Bài viết Phát hiện các điểm đột biến trên gen gyra và parc của các chủng vi khuẩn lậu phân lập trình bày nghiên cứu về tình hình kháng kháng sinh và giải thích cơ chế đề kháng của vi khuẩn lậu là rất cần thiết. Tiến hành giải trình tự gen của 71 chủng vi khuẩn lậu được phân lập từ những bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại Bệnh viện Da liễu Trung ương nhằm tìm hiểu cơ chế đề kháng với kháng sinh ciprofloxacin của vi khuẩn lậu,... Mời các bạn cùng tham khảo.
Trang 1Địa chỉ liên hệ: Lê Văn Hưng - Bộ môn Da liễu - Trường
Đại học Y Hà Nội
Email: levanhungvdl@yahoo.com
Ngày nhận: 26/03/2013
Ngày được chấp thuận: 20/6/2013
PHÁT HI Ệ N CÁC Đ I Ể M ĐỘ T BI Ế N TRÊN GEN GYRA VÀ PARC
C Ủ A CÁC CH Ủ NG VI KHU Ẩ N L Ậ U PHÂN L Ậ P
Lê Văn Hưng
Tr ườ ng Đạ i h ọ c Y Hà N ộ i Nghiên c ứ u v ề tình hình kháng kháng sinh và gi ả i thích c ơ ch ế đề kháng c ủ a vi khu ẩ n l ậ u là r ấ t c ầ n thi ế t
Ti ế n hành gi ả i trình t ự gen c ủ a 71 ch ủ ng vi khu ẩ n l ậ u đượ c phân l ậ p t ừ nh ữ ng b ệ nh nhân có h ộ i ch ứ ng ti ế t
d ị ch ni ệ u đạ o, âm đạ o đế n khám t ạ i B ệ nh vi ệ n Da li ễ u Trung ươ ng nh ằ m tìm hi ể u c ơ ch ế đề kháng v ớ i kháng sinh ciprofloxacin c ủ a vi khu ẩ n l ậ u K ế t qu ả cho th ấ y các ch ủ ng nh ạ y c ả m có n ồ ng độ ứ c ch ế t ố i thi ể u (Minimum Inhibitory Concentratation - MIC) 0,002 - 0,060 µg/ml không có độ t bi ế n gen Các ch ủ ng có MIC càng cao càng xu ấ t hi ệ n nhi ề u độ t bi ế n trên gen gyrA và parC Trên gen gyrA: 100% s ố ch ủ ng có độ t bi ế n
t ạ i codon 91 (Ser thành Phe) 63,8% s ố ch ủ ng có độ t bi ế n t ạ i codon 95 (Asp thành Ala), các độ t bi ế n ở v ị trí khác có t ầ n s ố th ấ p h ơ n Trên gen parC: 44,9% s ố ch ủ ng có độ t bi ế n t ạ i codon 87 (Ser thành Asn) Độ t bi ế n
ở codon 86 và 91 xu ấ t hi ệ n v ớ i t ầ n s ố th ấ p h ơ n
Từ khóa: vi khuẩn lậu, kháng kháng sinh, ciprofloxacin, đột biến gen
I ĐẶ T V Ấ N ĐỀ
Ciprofloxacin là một kháng sinh được chỉ
định điều trị bệnh lậu với liều uống duy nhất
(500 mg), vì vậy kháng sinh này được thầy
thuốc và bệnh nhân rất ưa chuộng Do đó,
việc lạm dụng kháng sinh này đã dẫn tới tốc
độđề kháng đang tăng nhanh và nếu không
có biện pháp can thiệp hữu hiệu, ciprofloxacin
có thể trở thành kháng sinh không có tác dụng
đối với vi khuẩn lậu trong thời gian tới Nhiều
nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới
như Trees D L và cộng sự (1998) tại Trung
tâm phòng chống bệnh xã hội Atlanta, Mỹ [1],
Su X và Lind I (2001) tại Đan Mạch [2] về
những chủng vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin
cho thấy: những chủng đề kháng với
ciprofloxacin đều có những thay đổi trên gen
gyrA và gen parC Đó là các gen có liên quan
đến kháng ciprofloxacin Gen gyrA có độ dài
2.751 nucleotide, mã hoá 916 amino acid;
vùng quyết định đề kháng quinolon dài khoảng
279 nucleotide, mã hoá 93 amino acid Gen
parC có độ dài 2.307 nucleotide, mã hoá 768
amino acid; vùng quyết định đề kháng
quinolon dài khoảng 255 nucleotide, mã hoá
85 amino acid Những nghiên cứu về tình hình kháng kháng sinh, cơ chế đề kháng của vi khuẩn lậu là rất cần thiết và phải được tiến hành thường xuyên nhằm đóng góp hữu hiệu cho công tác phòng chống các bệnh lây truyền qua đường tình dục nói chung và bệnh lậu nói riêng Xuất phát từ những lý do trên đề tài
nghiên cứu được tiến hành nhằm mục tiêu: góp phần tìm hiểu cơ chếđề kháng với kháng sinh ciprofloxacin của vi khuẩn lậu
II ĐỐ I T ƯỢ NG VÀ PH ƯƠ NG PHÁP
1 Đối tượng
Trong khoảng thời gian từ năm 2005 đến
2007, có 5.091 bệnh nhân có hội chứng tiết
dịch niệu đạo, âm đạo đến khámtại bệnh viện
Da liễu Trung ương, phân lập được 503
chủng Nghiên cứu này đã chọn ngẫu nhiên 6
Trang 2tháng từ tháng 7 năm 2007 đến tháng 12 năm
2007 được 71 chủng vi khuẩn lậu
2 Vật liệu
Tủ nuôi cấy CO2 Sanyo (Nhật Bản) Môi
trường Thayer - Martin, Neisseria 4H, Oxidase
(Mỹ) Thanh giấy E - test (Thụy Điển) Chủng
chuẩn: ATCC 49226 (WHO cung cấp) (bảng 1)
3 Phương pháp
3.1 K ỹ thu ậ t xác đị nh vi khu ẩ n l ậ u
Nhuộm Gram →Nuôi cấy trên môi trường Thayer - Martin →Test Oxidase và Neisseria 4H
→ Kết luận: Neisseria gonorrhoear → Tiến hành kỹ thuật kháng sinh đồ: sử dụng E - test
để xác định MIC của vi khuẩn lậu
Bảng 1 Các đoạn mồi dùng trong phản ứng PCR và giải mã trình tự gen [3]
được khuếch đại
Mồi xuôi
Mồi ngược
CGGCGCGTACTGTACGCGATGCA
Mồi xuôi
Mồi ngược
ATGCGCGATATGGGTTTGAC
3.2 Quy trình PCR đố i v ớ i gen gyrA và
gen parC
Sử dụng hóa chất của hãng Bio - rad (Hoa
Kỳ) với 2 cặp mồi đặc hiệu để tiến hành quy
trình PCR đối với gen gyrA và gen parC
Thành ph ầ n ph ả n ứ ng: Dung dịch đệm 10x
(5 ml); dNTP 10 mM (1 ml); MgCl2 50 mM (1,5
ml); Taq polymerase 5 UI/ml (0,5 ml); Dung
dịch DNA (5 ml); Mồi xuôi 10 mM (2,5 ml); Mồi
ngược 10 mM (2,5 ml); Nước khử ion (32 ml)
Tổng thể tích là 50 ml
- Chu kỳ nhiệt:
93oC 3 phút - [93oC 30 giây - 52oC 1 phút -
72oC 1 phút] x 30 chu kì - 72oC 5 phút
- Sản phẩm khuếch đại gen
3.3 Quy trình gi ả i trình t ự gen
Quy trình giải trình tự đoạn gen có thể
chứa đột biến được thực hiện theo quy trình
hướng dẫn của hãng
a Tinh sạch sản phẩm PCR bằng MinElute PCR Purification Kit:
Thêm 200 ml buffer PB vào 40 ml sản
phẩm PCR, trộn đều bằng pipet Cho toàn bộ
dịch vào cột chiết tách Ly tâm 13.000 vòng/
phút trong 1 phút Hút bỏ phần dịch lọc Thêm
750 ml buffer PE, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút Hút bỏ dịch lọc Ly tâm thêm 20.000 vòng/phút trong 1 phút Chuyển cột chiết tách sang ống ly tâm 1,5 ml Thêm 20 ml
ữ ộ ế Để ở
Trang 3ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing
Core Kit: Pha Premix gồm 5X sequencing
buffer (4 ml); dNTP mix (1 ml); A dye
terminator (0,5 ml); C dye terminator (0,5 ml);
G dye terminator (0,5 ml); T dye terminator
(0,5 ml); AmpliTaq (1 ml)
Thành phần phản ứng: Premix 8µl, sản
phẩm PCR sau tinh sạch 5µl, mồi 3,2 pmol,
nước cất vừa đủ 20µl
Chu kỳ nhiệt:
96oC 10 giây – [96oC 10 giây – 50oC 5 giây
– 60oC 4 phút] x 25 chu kỳ - 4oC 1 phút
c Tinh sạch sản phẩm
Thêm vào 20 ml sản phẩm sequencing: 3
ml KCH3COO 3M pH = 7,0; 14,5 µl nước cất;
62,5 µl cồn 100% Để nhiệt độ phòng 15 phút
Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 20 phút Hút bỏ
dịch nổi Thêm 200 ml cồn 70% Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 5 phút Hút bỏ dịch
nổi Để khô ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng Hoà tan bằng 25 ml final buffer
- Đọc kết quả bằng máy ABI PRISM 310
của hãng Applied Biosystem
Trình tự các nucleotide ở các mẫu nghiên
cứu được so sánh với trình tự nucleotide của
gen gyrA và parC của chủng vi khuẩn lậu gốc
để tìm ra các điểm khác nhau với chủng gốc
III K Ế T QU Ả
1 Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định đoạn gen gyrA, parC
Hình 1 Kết quả điện di sản phẩm PCR
xác định đoạn gen gyrA
Giếng 1: chứng âm
Giếng 2: chứng dương
Giếng 3: thang ADN 100 bp
Giếng 4 đến 7: kết quả dương tính
Hình 2 Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định đoạn gen ParC
Giếng 1: chứng âm
Giếng 2: chứng dương
Giếng 3: thang ADN 100 bp
Giếng 4 đến 7: kết quả dương tính
Trang 42 Trình tự nucleotid của đoạn gen gyrA chứa đột biến (mũi tên đánh dấu điểm đột biến)
3 Trình tự nucleotid của đoạn gen parC chứa đột biến (mũi tên đánh dấu điểm đột biến)
IV BÀN LU Ậ N
Nghiên cứu giải trình tự gen của 71 chủng
vi khuẩn lậu gồm: 2 chủng nhạy cảm và 69
chủng đề kháng Phân tích các đột biến trên
gen gyrA và parC và sự phối hợp giữa các đột
biến trên 2 gen này cho thấy: tất cả những
chủng đề kháng đều có đột biến trên 2 gen
gyrA và parC, số lượng đột biến cũng tăng
theo nồng độ MIC 2 chủng nhạy cảm MIC
0,002 - 0,060 µg/ml (2,8%) không có thay đổi
nào trong trình tự DNA 11 chủng đề kháng có
MIC 1 - 2 µg/ml (tỷ lệ 15,5%) mang 2 đột biến
trên gen gyrA và không mang đột biến trên
ủ đề
vậy, MIC cũng có mối liên quan với số lượng
đột biến [4] Với MIC nhỏ, mang ít đột biến
MIC lớn mang nhiều đột biến hơn Kết quả
này tương đồng với những nghiên cứu của các tác giả trên thế giới [5, 6, 7] Tuy nhiên, nghiên cứu này thu được kết quả khác với các tác giả các tác giả trên thế giới là những
chủng kháng ciprofloxacin đều có đột biến trên
gen gyrA tại codon 91 (Ser thành Phe) Điều này có thể do những chủng vi khuẩn lậu lây truyền hiện nay tại Việt Nam có nguồn gốc từ
cùng một chủng và mang tính khu vực [8] Kết
quả của nghiên cứu thu được đã chứng minh
Trang 5những chủng đa đề kháng lan truyền trong
cộng đồng là rất cần thiết để có thể tránh
những thất bại trong điều trị
Ciprofloxacin thuộc nhóm quinolon Đích
tác động của nhóm kháng sinh này là ADN
gyrase và topoisomerase IV của vi khuẩn Sự
đột biến của vi khuẩn lậu (tại gen gyrA và
parC làm thay đổi đích kháng sinh, do đó dẫn
đến sự đề kháng với kháng sinh ciprofloxacin
của vi khuẩn lậu
L ờ i c ả m ơ n
Xin cảm ơn sự giúp đỡ chân thành từ
PGS.TS Trần Hậu Khang, ThS Trần Mẫn
Chu, ThS Phạm Đăng Bảng, PGS.TS
Nguyễn Vũ Trung, CN Ninh Thị Dần, CN Lê
Phương Thảo bệnh viện Da liễu Trung ương
và GS.TS Norihisa Ishii, Viện truyền nhiễm
quốc gia, Nhật Bản
1 Trees D L., Sandul A L., Whittington
W L et al (1998) Identification of novel
muta-tion patterns in the parC gene of
ciprofloxacin-resistant isolates of Neisseria gonorrhoeae
Anti-microb Agents Chemother, 42(8), 2103 - 2105
2 Su X., Lind I (2001) Molecular basis of
high - level ciprofloxacin resistance in
Neis-seria gonorrhoeae strains isolated in Denmark
from 1995 to 1998 Antimicrob Agents
Chemother, 45(1), 117 - 123
3 Otero, L., et al (2001) First Isolate of a
Neisseria gonorrhoeae Strain Associated With an Ofloxacin Treatment Failure in Spain
Sex Transm Dis, 28(10), 576 - 578
4 Xu J S., Wang B., Wang C X., et al (2006) Study on fluoroquinolone resistance
and the relationship between resistance and mutations of gyrA and parC in Neisseria gon-orrhoeae Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi,
27(8), 702 - 704
5 Shultz T R., Tapsall J W., White P A (2001) Correlation of in vitro susceptibilities to
newer quinolones of naturally occurring quino-lone-resistant Neisseria gonorrhoeae strains with changes in gyrA and parC Antimicrob
Agents Chemother, 45(3), 734 - 738
6 Tanaka M., Nakayama H., Haraoka M.,
et al (2000) Antimicrobial resistance of
Neis-seria gonorrhoeae and high prevalence of ciprofloxacin-resistant solates in Japan, 1993
to 1998 J Clin Microbiol, 38(2), 521 - 525
7 Zhang T., Zhou X., Chen Y., et al (2009) Fluoroquinolone resistance and
mu-tation patterns in gyrA and parC genes in Neisseria gonorrhoeae isolates from Shang-hai, China J Huazhong Univ Sci Technolog
Med Sci, 29(1), 29 - 34
8 Chaudhry U., Ray K., Bala M., et al
(2002) Mutation patterns in gyrA and parC
genes of ciprofloxacin resistant isolates of
Neisseria gonorrhoeae from India Sex
Transm Infect, 78(6), 440 - 444
Summary
MUTATIONS IN GYRA AND PARC GENES OF
NEISSERIA GONORRHOEAE ISOLATED FROM PATIENTS
We study the antibiotic resistance and resistance mechanisms of N gonorrhoeae We sequenced a part of gyrA and parC genes of 71 strains from patients admitted at the National
Hospital for Dermatology and Venereology with urethral and vaginal discharges to understand the resistance mechanisms to ciprofloxacin Ciprofloxacin-susceptible strains (MIC 0,002-0,060 µg/
Trang 6ml) had no mutation The number of gyrA and parC mutations were proportional to MIC level The
strains had Ser(91)Phe and Asp(95)Ala with the prevalence of 100% and 63.8%, respectively,
and lower prevalence at other positions on gyrA On parC, 44.9% of the strains had Ser(87)Asn
and lower prevalence at other positions
Key words: N gonorrhoeae, antibiotic resistance, ciprofloxacin, gene mutations
XÁC ĐỊ NH CA B Ệ NH Ấ U TRÙNG SÁN DÂY CHÓ
Nguyễn Văn Đề 1 , Tạ Chi Phương 2 , Ngô Thế Quân 2
1
Tr ườ ng Đạ i h ọ c Y Hà N ộ i, 2 B ệ nh vi ệ n Ph ổ i Trung ươ ng
B ệ nh nhân nam gi ớ i ở t ỉ nh Thanh Hóa đượ c m ổ và đ i ề u tr ị t ạ i b ệ nh vi ệ n B ệ nh ph ổ i Qu ố c gia tháng 3
n ă m 2013 Tr ướ c khi vào vi ệ n 2 tháng, b ệ nh nhân c ả m th ấ y t ứ c ng ự c bên ph ả i, không s ố t và không ho
X - quang ph ổ i có kh ố i u bên ph ổ i ph ả i, b ạ ch c ầ u ái toan t ă ng (12,8%) K ế t qu ả xét nghi ệ m ELISA d ươ ng
tính v ớ i kháng nguyên Echinococcus K ế t qu ả ph ẫ u thu ậ t c ắ t b ỏ kh ổ i u th ấ y m ộ t kén n ướ c (cyst) có kích
th ướ c 6 x 7 cm Trong kén có nhi ề u đầ u sán dây và đượ c xác đị nh là Echinococcus ortleppi b ằ ng hình thái
h ọ c và th ẩ m đị nh b ằ ng sinh h ọ c phân t ử (s ử d ụ ng gen NADH hydrogenasa và 23S rebosome v ớ i s ự t ươ ng
đồ ng nucleotide v ớ i Echinococcus ortleppi trên GenBank là 99,5%) Đ ây là ca b ệ nh ấ u trùng sán dây chó
Echinococcus ortleppi, đ ã kh ẳ ng đị nh b ệ nh có ở Vi ệ t Nam
Từ khóa: phổi, Echinococcus ortleppi, hydatid cyst disease, Việt Nam
I ĐẶ T V Ấ N ĐỀ
Sán dây chó (Echinoccocus) trưởng thành
dài 3 - 6 mm gồm 3 - 4 đốt, ký sinh ở ruột non
họ chó Trong 20 loài thuộc giống (chi)
Echi-nococcus, có 2 loài quan trọng liên quan đến y
học là E granulosus (gây nang nước - cystic
echinococcosis) và E multilocularis (gây bọc
nhiều túi nước - alveolar echinococcosis)[8]
Phân tích gen cho thấy Echinococcus
granu-losus (G1) và Echinococcus ortleppi (G5) là
nhiệt đới mà ấu trùng có liên quan đến bệnh nang nước sán chó (cystic hydatid disease)
lưu hành ở Nam Brazil (Balbinotti et al, 2012) [1] và lần đầu tiên Echinococcus ortleppi
(genotype G5) được thông báo ở Italy (Casulli
et al, 2008) [2].Ấu trùng sán dây chó ký sinh
ởđộng vật có vú như chó, mèo, gấu, báo, khỉ,
người và có khi ở cừu, dê, bò, lạc đà, hươu
và động vật gậm nhấm Ấu trùng ký sinh ở
gan hay phủ tạng khác tạo những bọc nước
lớn chứa nhiều đầu sán, các bọc nước này