Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn tả trong môi trường cảm ứng sinh độc tố tả in vitro và tách chiết độc tố từ môi trường nuôi cấy làm nguyên liệu chế tạo kít phát hiện và antidote kháng độc tố tả.
Trang 132
CẢM ỨNG VI KHUẨN TẢ SINH ĐỘC TỐ TARIN VITRO
VÀ TÁCH CHIẾT ĐỘC TỐ TỪ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
Hoàng Đắc Thăng*; Đỗ Minh Trung*; Phạm Thế Tài*; Lê Văn Đông*
TÓM TẮT
Mục tiêu: cảm ứng vi khuẩn tả (VKT) Vibrio cholerae sinh độc tố tả (ĐTT) in vitro và tách
chiết độc tố từ môi trường nuôi cấy làm nguyên liệu chế tạo kít phát hiện ĐTT và antidote
kháng ĐTT Phương pháp: nuôi cấy tăng sinh đồng thời kích thích VKT sinh ĐTT in vitro trong
môi trường cảm ứng có chứa pepton, cao men bia, NaCl và NaHCO 3 Tách chiết ĐTT từ môi trường nuôi cấy bằng kỹ thuật kết tủa phân đoạn protein Đánh giá hoạt tính của sản phẩm thu được bằng kỹ thuật GM 1 -ELISA và điện di SDS-PAGE Kết quả: nuôi cấy in vitro VKT trong môi trường cảm ứng có sinh ĐTT, sản phẩm độc tố tách chiết được từ môi trường nuôi cấy có khả năng gắn đặc hiệu vào thụ thể GM1 và có kích thước tương ứng với các tiểu phần của ĐTT
Kết luận: đã nuôi cấy cảm ứng VKT sinh độc tố in vitro và tách chiết được ĐTT từ môi trường
nuôi cấy
* Từ khóa: Độc tố tả; Vi khuẩn tả; Tách chiết độc tố
In Vitro Induction of Cholera Toxin Production and Extraction of Toxin
Summary
Objective: Induction of cholera toxin (CT) in vitro production by Vibrio cholerae and extraction of
CT from culture medium to be used as material for the development of CT detection kit and antidote Methods: Bacterial proliferation and stimulation of toxin production were done by culturing of V cholerae with the inducing medium which contained peptone, yeast extract, NaCl, NaHCO 3 The toxin was extracted from culture medium by protein-precipitation fractionation method Obtained toxin was determined by GM 1 -ELISA and SDS-PAGE techniques Results:
V cholerae produced CT in vitro as being cultured in the inducing medium The toxin extracted from culture medium bind specifically to GM1 receptor and has the size corresponding to CT subuits Conclusion: CT has been successfully induced and extracted from in in vitro culture medium
* Key words: Vibrio cholerae; Cholera toxin; Toxin extraction
ĐẶT VẤN ĐỀ
Vi khuẩn tả (Vibrio cholerae) là một
loại vi khuẩn gram âm sinh ĐTT ĐTT gắn
vào các thụ thể đặc hiệu GM1 trên bề mặt
các tế bào biểu mô niêm mạc của ruột, gây tiêu chảy nặng, kèm theo rối loạn nước, điện giải, là dấu hiệu đặc trưng của bệnh tả Trường hợp bệnh nặng có thể gây tử vong trong thời gian ngắn Bệnh tả có khả năng
* Häc viÖn Qu©n y
Người phản hồi (Corresponding): Lê Văn Đông (levandong@yahoo.com)
Ngày nhận bài: 10/01/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 22/01/2015
Ngày bài báo được đăng: 28/01/2015
Trang 233
bùng phát thành đại dịch trong thời gian
rất ngắn và trên phạm vi rộng, ảnh hưởng
nặng nề đến sức khoẻ, kinh tế xã hội và
an ninh của nhiều quốc gia [1] Tuy nhiên,
các VKT thường chỉ sinh ĐTT trong điều
kiện in vivo khi đã nhiễm vào tăng sinh
trong môi trường đường ruột của đối
tượng bị nhiễm Trong điều kiện nuôi cấy
thường, vi khuẩn này chỉ tăng sinh mà
không tiết độc tố [3, 4, 5] Phát hiện ĐTT
và có kháng thể đặc hiệu làm antidote
chống ĐTT là biện pháp quan trọng trong
điều trị nhiễm trùng, nhiễm độc do vi
khuẩn và ĐTT, đặc biệt khi ĐTT được sử
dụng như một tác nhân vũ khí sinh học
Để có được nguyên liệu phát triển kít
phát hiện và antidote kháng ĐTT, cần có
nguyên liệu ban đầu là ĐTT, nhất là sản
phẩm ĐTT do các chủng VKT gây tiêu
chảy cấp thành dịch ở Việt Nam Nghiên
cứu này được tiến hành nhằm: Nuôi cấy
tăng sinh VKT trong môi trường cảm ứng
sinh ĐTT in vitro và tách chiết độc tố từ
môi trường nuôi cấy làm nguyên liệu chế
tạo kít phát hiện và antidote kháng ĐTT
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
1 Vật liệu nghiên cứu
- Chủng VKT V50 được khảo sát và
tuyển chọn trong nghiên cứu trước của
chúng tôi, là chủng có khả năng tăng sinh
mạnh nhất trong số 10 chủng VKT được
Khoa Vi sinh Y học, Bệnh viện Quân y
103 phân lập từ các vụ dịch tiêu chảy cấp
thành dịch tại Hà Nội vào các năm 2007 -
2008 [2]
- Hóa chất, thiết bị nghiên cứu: môi
trường nuôi cấy TCBS agar, thạch kiềm,
pepton, cao men bia, NaCl, NaHCO3, NaH2PO4, NaOH, HCl, H2CO3, (NH)2SO4 (Hãng Merck) Protein GM1, ĐTT chuẩn, kháng thể đơn clôn kháng ĐTT, kháng thể kháng IgG gắn enzym HRP (Hãng Sigma); các hóa chất thông thường dùng cho phản ứng ELISA và điện di SDS-PAGE đều đạt tiêu chuẩn phân tích và do các hãng có uy tín cung cấp
2 Phương pháp nghiên cứu
* Nuôi cấy VKT trong môi trường cảm ứng sinh độc tố:
Nuôi cấy VKT trong môi trường cảm ứng sinh tổng hợp ĐTT có chứa pepton, cao men bia, NaHCO3 có bổ sung NaCl như mô tả trong nghiên cứu trước của chúng tôi [2] Sau 72 giờ nuôi cấy, thu hoạch môi trường nuôi cấy bằng cách ly tâm 4.500 vòng/phút trong 25 phút lấy dịch nổi chứa ĐTT Định lượng nồng độ protein trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp Bradford sử dụng BSA làm protein chuẩn để định lượng nồng độ protein tổng
số Xác định sự có mặt của ĐTT trong môi trường nuôi cấy bằng kỹ thuật GM1-ELISA
* Tách chiết ĐTT:
Được thực hiện theo phương pháp kết tủa phân đoạn nhiều bước với muối sulphat amôn
- Bước 1: gây kết tủa các thành phần không phải protein Tính thể tích dịch nổi thu được sau nuôi cấy và lượng muối sulphat amôn đạt 20% độ bão hòa Cho
từ từ sulphat amôn vào dung dịch nuôi cấy đã để trong đá lạnh và khuấy nhẹ nhàng bằng máy khuấy từ trong thời gian
2 tiếng Ly tâm 9.000 vòng/phút trong thời gian 25 phút bằng máy ly tâm lạnh 40
C, thu dịch nổi chứa ĐTT và bỏ cặn
Trang 334
- Bước 2: tủa phân đoạn với muối
sulphat amôn ở các các nồng độ 30%,
40%, 60% hoặc 70% theo cách làm tương
tự như ở bước 1 Sau ly tâm 9.000 vòng/
phút trong thời gian 25 phút bằng máy
ly tâm lạnh 4ºC, thu cặn kết tủa protein
chứa ĐTT
- Bước 3: rửa cặn tủa protein và thẩm
tích protein chứa ĐTT với dung dịch PBS
lạnh Hòa tan cặn protein trong dung dịch
PBS, sau đó cho vào túi thẩm tích (không
quá 2/3 thể tích túi) Thẩm tích trong bình
chứa dung dịch PBS lạnh trong 48 giờ
Trong thời gian thẩm tích, định kỳ thay
dung dịch thẩm tích 5 lần
- Xác định nồng độ protein chứa ĐTT
thu được sau thẩm tích bằng phương pháp
Bradford sử dụng BSA là protein chuẩn
để định lượng nồng độ protein tổng số
Xác định sự có mặt của ĐTT bằng kỹ thuật
GM1-ELISA Độ tinh sạch và kích thước
protein được khảo sát bằng phương pháp
điện di SDS-PAGE
* Phát hiện và thử hoạt tính ĐTT:
Phát hiện ĐTT bằng phản ứng GM1
-ELISA theo nguyên lý kỹ thuật -ELISA kiểu
sandwich, sử dụng ganglioside GM1 là
phối tử đặc hiệu với ĐTT gắn lên pha rắn
làm phân tử bắt giữ ĐTT Kháng thể đơn
clôn kháng ĐTT được dùng để phát hiện
sự có mặt của ĐTT đã bị GM1 bắt giữ
Các bước cụ thể như sau: gắn GM1 vào
các giếng của đĩa ELISA, để qua đêm rồi
rửa với PBS-T, block các giếng bằng BSA
1%, thời gian 30 phút, sau đó rửa bằng
PBS-T ĐTT chuẩn (chứng dương); sản phẩm
ĐTT sau tách chiết, môi trường nuôi cấy
chứa ĐTT và môi trường nuôi cấy không
có V cholera (chứng âm) được cho vào
các giếng đã gắn GM1 để ĐTT gắn với
GM1 trong giếng, rửa bằng PBS-T Cho kháng thể kháng ĐTT vào các giếng, thời gian 1 giờ, rửa các giếng bằng PBS-T, cho kháng thể thứ hai gắn enzym HRP vào các giếng, thời gian 1 giờ, rửa lại bằng PBS-T Cho cơ chất vào các giếng phản ứng với nồng độ 0,5 mg/ml, thời gian 10 phút Xác định kết quả thông qua mật độ quang học của các giếng đo được bằng máy đọc DTX 880 (Hãng Beckman Coulter, Mỹ) ở bước sóng 450 nm Kiểm tra độc tính của ĐTT bằng đường uống trên chuột nhắt trắng sơ sinh 2 - 5 ngày tuổi
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
1 Nuôi cấy tăng sinh V cholerae trong
môi trường sinh độc tố
Bảng 1: Nồng độ protein và hoạt tính
ĐTT trong dịch nổi sau nuôi cấy VKT
Nồng độ
Sau 24 giờ nuôi cấy, VKT đã chết tiết ĐTT vào môi trường Nồng độ protein thu được trong protein của dịch nổi sau nuôi cấy 72 giờ có nồng độ protein cao nhất (0,101 mg/ml) và hoạt tính ĐTT mạnh nhất Điều này phù hợp với với chu trình tăng sinh của VKT trong điều kiện nuôi cấy in vitro [2, 3]
Trang 435
2 Tách chiết ĐTT từ môi trường nuôi cấy
Bảng 2: Nồng độ protein thu được từ các phân đoạn kết tủa
Hình 1: Hoạt tính ĐTT ở các phân đoạn kết tủa
Phân đoạn kết tủa ở nồng độ muối sulphat amôn 60% bão hòa có nồng độ protein
và hoạt tính ĐTT cao nhất so với các phân đoạn kết tủa ở nồng độ muối sulphat amôn 30%, 40% hoặc 70%, cho thấy ở nồng độ muối quá thấp hoặc quá cao không gây kết tủa hết ĐTT trong môi trường Nồng độ 60% độ bão hòa muối sulphat amôn là phù hợp nhất cho mục đích thu cặn protein có chứa ĐTT với hoạt tính mạnh nhất
3 Hoạt tính của ĐTT
Trang 536
Sản phẩm thu được bằng kết tủa phân
đoạn ở nồng độ muối sulphat amôn 60%
bão hòa có hoạt tính ĐTT gắn đặc hiệu vào
phối tử GM1 Đồ thị biểu thị mức độ phản
ứng của ĐTT khi pha loãng bậc hai tương
đối điển hình theo dạng đường cong chuẩn
của phản ứng ELISA, cho thấy sản phẩm
thu được có phản ứng gắn đặc hiệu với thụ
thể GM1 Đánh giá sơ bộ qua đường uống
sản phẩm thu được gây chết chuột nhắt
trắng sơ sinh 3 - 5 ngày tuổi, chứng tỏ
sản phẩm thu được là độc tố gắn GM1
3 Độ tinh sạch và kích thước của ĐTT
thu được
Phân tích sản phẩm protein có hoạt tính
ĐTT bằng điện di SDS-PAGE cho thấy xuất
hiện 2 băng tương ứng với kích thước
tương đương 11,6 kDa của tiểu phần B và
9,7 Kda của tiểu phần A2
Hình 3: Kết quả điện di SDS-PAGE
(1: Môi trường nuôi cấy chưa kết tủa; 2:
Protein sau kết tủa ở 60% sulphat amôn bão
hòa; M: thang protein chuẩn)
Vi khuẩn tả sản xuất độc tố ruột gọi là
gồm 2 thành phần: tiểu phần A (phần hoạt độc - active) và tiểu phần B (phần gắn dính - binding) ĐTT bao gồm 5 tiểu đơn vị B và một tiểu đơn vị A, tiểu đơn vị B có khối lượng phân tử khoảng 11,6 Kda, tiểu phần A1 khối lượng phân tử khoảng 23,5 kDa, tiểu phần A2 khối lượng phân tử khoảng 9,7 kDa [3, 4] Dựa vào kết quả điện di thu được, kết quả ở giếng số 1 là môi trường nuôi cấy trước kết tủa có xuất hiện nhiều băng protein, nhưng tương đối mờ nhạt do nồng độ protein trong dịch nuôi cấy thấp Sản phẩm thu được sau kết tủa có các băng tương ứng với kích thước của tiểu phần B là 11,6 Kda, A2 là 9,7 kDa Bên cạnh các băng này còn có một số băng phụ Tuy nhiên, mật
độ tương đối thấp hơn so với 2 băng chính, chứng tỏ sản phẩm thu được chứa chủ yếu
là các protein tương ứng với ĐTT, có thể sử dụng làm nguyên liệu cho việc tách tinh sạch, phục vụ cho nghiên cứu phát triển kít phát hiện và antidote chống ĐTT sau này
KẾT LUẬN
Đã nuôi cấy cảm ứng VKT sinh độc tố in
nuôi cấy bằng phương pháp tủa phân đoạn protein Sản phẩm độc tố tách chiết được từ môi trường nuôi cấy có khả năng gắn đặc hiệu vào thụ thể GM1 và có kích thước tương ứng với các tiểu phần của ĐTT
Trang 637
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Phùng Đắc Cam Vibrio cholerae và bệnh
dịch tả Nhà xuất bản Y học Hà Nội 2013
2 Đỗ Minh Trung, Hoàng Đắc Thăng,
Lê Văn Đông và CS Nghiên cứu tuyển chọn và
nuôi cấy VKT sinh ĐTT in vitro Tạp chí Y - Dược
học Quân sự 2013, 38 (9), tr.84-90
3 Davy Vanden Broeck, Caroline Horvath,
Marc JS De Wolf Vibrio cholerae: Cholera
toxin The International Journal of Biochemistry
& Cell Biology 2007, 39, pp.1771-1775
4 Stephen H Richardson, Dolores G Evans, John C Feeley Biochemistry of Vibrio cholerae
Virulence I Purification and Biochemical Properties of PF/Cholera Enterotoxin Infection and immunity 1970, June, pp.546-554
5 Mark Dertzbaugh Method for purifying cholera
toxin United States Patent 1999, 6, pp.308-329.