Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xây dựng phương pháp định lượng kháng thể IgY kháng vi khuẩn tả và độc tố tả còn hoạt tính bằng phương pháp ELISA nhằm làm cơ sở cho đánh giá chất lượng kháng thể và bào chế chế phẩm dùng đường uống từ nguồn nguyên liệu này.
Trang 1NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
KHÁNG THỂ IgY KHÁNG VI KHUẨN TẢ (Vibrio cholera) VÀ
ĐỘC TỐ TẢ CÒN HOẠT TÍNH BẰNG ELISA
Phạm Văn Hiển*; Vũ Bình Dương*; Ngô Xuân Trình*
Hồ Bá Ngọc Minh*; Ngô Thị Tuyết Mai*; Nguyễn Thị Hồng Thanh**
TÓM TẮT
Mục tiêu: xây dựng phương pháp định lượng kháng thể IgY kháng vi khuẩn (VK) tả và độc
tố tả còn hoạt tính Đối tượng: kháng thể IgY kháng VK tả và kháng độc tố tả được sản xuất tại Học viện Quân y Phương pháp: thẩm định theo Hướng dẫn của ICH, Bộ Y tế Việt Nam Kết quả: xác định được điều kiện phân tích bằng phương pháp ELISA nhờ phản ứng tạo màu của
phức hợp kháng thể - HRP với cromogen đo ở bước sóng 450 nm Phương pháp đã được thẩm định, bảo đảm yêu cầu của phương pháp phân tích gồm tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính,
độ đúng, độ chính xác, giới hạn định lượng (LOQ) và giới hạn phát hiện (LOD) Kết luận: đã xây dựng và thẩm định được phương pháp định lượng kháng thể IgY kháng VK tả và độc tố tả còn hoạt tính bằng phương pháp ELISA
* Từ khóa: Vi khuẩn tả; Kháng thể IgY kháng vi khuẩn tả; Kháng thể IgY kháng độc tố tả; ELISA
Determination of Activation of Anti-vibrio Cholera and Anti-vibrio Cholera Toxin IgY by ELISA Method
Summary
Objectives: Establishment and validation of IgY anti-vibrio and anti-vibrio toxin by ELISA Materials: IgY anti-vibrio and IgY anti-vibrio toxin were prepared at Vietnam Military Medical University Methods: Using ELISA method based on colourimetry of complex IgY-HRP-cromogen at 450 nm The validation was carried out in accordance with ICH and Vietnam Ministry of Health guideline Results: The quantification method of IgY anti-vibrio cholera and anti-vibrio cholera toxin was established and validated completing of selectivity, linerity, presison, accuracy, LOD and LOQ Conclusions: The quantification method of IgY anti-vibrio cholera and anti-vibrio cholera toxin was validated fully in accordance with ICH and Vietnam Ministry of Health
* Key words: Cholera; Anti-vibrio cholera IgY; Anti-vibriocholera toxin IgY; ELISA
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh tả gây ra bởi VK tả (Vibrio cholera)
và độc tố tả (Vibrio cholera toxin), đặc biệt
đối với các nước nhiệt đới như Việt Nam,
là một mối đe dọa lớn đối với sức khỏe cộng đồng Theo báo cáo của WHO năm
2007, toàn thế giới có 177.963 trường hợp
* Học viện Quân y
** Đại học Y khoa Vinh
Người phản hồi (Corresponding): Vũ Bình Dương (vbd2978@gmail.com)
Ngày nhận bài: 15/07/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/08/2016
Ngày bài báo được đăng: 07/09/2016
Trang 2mắc dịch tả và con số tử vong là 4.301
người [5] Hàng năm, có trên 100.000 người
mắc tả và 90% tập trung ở khu vực châu
Á và châu Phi Để điều trị tả, ngoài sử
dụng các biện pháp dự phòng và điều trị
kinh điển như vắc xin, bù nước điện giải,
kháng sinh…, việc sử dụng các kháng thể
kháng VK tả và độc tố tả đường uống là
biện pháp khá hữu hiệu [4] Kháng thể
IgY là một immunoglobin có tác dụng tốt
để điều trị các dịch bệnh nhiễm trùng,
nhiễm độc đường tiêu hóa [6, 7, 8] Hiện
nay, Học viện Quân y đã chế tạo thành
công kháng thể IgY kháng VK tả và độc tố
tả có nguồn gốc từ trứng gà mái được
gây miễn dịch [2] Nhằm làm cơ sở cho
đánh giá chất lượng kháng thể và bào chế
chế phẩm dùng đường uống từ nguồn
nguyên liệu này, chúng tôi xây dựng phương
pháp định lượng kháng thể IgY kháng VK
tả và độc tố tả còn hoạt tính bằng phương
pháp ELISA
NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1 Nguyên liệu và thiết bị
- Kháng thể chuẩn IgY kháng VK tả
(Vibrio cholera) và IgY kháng độc tố tả
(chuẩn đối chiếu) được Virusys Corporation
(Mỹ) cung cấp (10 µg/ml; 0,1 ml)
- Kháng thể IgY kháng VK tả và IgY
kháng độc tố tả được Bộ môn Miễn dịch,
Học viện Quân y cung cấp
- Kháng nguyên: chủng VK tả (Vibrio
cholerae) do Khoa Vi sinh vật, Bệnh viện
Quân y 103 cung cấp, phân lập từ các mẫu
bệnh phẩm của bệnh nhân mắc bệnh tả
tại Việt Nam giai đoạn 2010 - 2015 Độc
tố tả được Sigma (Mỹ > 98,0%) cung cấp
- Các hóa chất, trang thiết bị khác đạt
tiêu chuẩn phân tích dược học và vi sinh
2 Phương pháp nghiên cứu
Định lượng hoạt tính kháng thể IgY kháng VK tả và độc tố tả bằng phương pháp ELISA Thẩm định phương pháp theo chỉ dẫn của ICH và Bộ Y tế Việt Nam gồm: tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, giới hạn định lượng
và giới hạn phát hiện [1, 3]
- Mẫu chuẩn: chuẩn bị các chuẩn làm việc có nồng độ 1,56 - 50 ng/ml bằng pha loãng chuẩn gốc IgY kháng VK tả và độc
tố tả (10 µg/ml) với dung môi pha loãng
- Mẫu thử: sử dụng dung môi pha
loãng kháng thể để chuẩn bị mẫu thử có nồng độ khoảng 10 ng/ml
- Mẫu trắng: dung dịch đệm pha loãng khoáng thể IgY (Virusys Corporation, Mỹ, IgY Sample Diluent 1x, chứa 10 mM Tris,
pH 7,4 và 150 mM NaCl)
* Tiến hành: kháng nguyên VK tả và
độc tố tả được chuẩn bị ở các nồng độ 7,5 x 106 CFU/ml và 10 µg/ml 100 µl mỗi loại dung dịch được gắn lên đĩa 96 giếng trong dung dịch đệm 0,1 M carbonat-bicarbonat pH 9,6 ở 40C và để qua đêm Sau đó, thêm 200 µl dung dịch PBS chứa 0,05 Tween 20 và 1% BSA Các giếng này sau đó ủ với 100 µl kháng thể IgY kháng độc tố tả hoặc VK tả với nồng độ khác nhau trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng Sau đó, ủ các giếng với phức hợp HRP - kháng thể IgG cừu kháng IgY gà Ở giữa mỗi bước, rửa giếng với 200 µl dung dịch PBS chứa 0,05% Tween 20 Màu của phản ứng được khai triển bằng cách thêm
100 µl dung dịch cromogen 1x (IAV_TMB - chứa 3,3', 5,5;-tetramethylbenzidine) ủ tiếp trong 15 phút trong bóng tối Dừng phản ứng bằng thêm 100 µl dung dịch axít HCl 1N Đem đọc mật độ quang ở bước sóng
450 nm
Trang 3KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1 Tính đặc hiệu của phương pháp
Hình 1: Kết quả quét phổ của dung dịch đem đo quang định lượng IgY kháng VK tả
(a) Dung dịch thử; (b) Dung dịch chuẩn; (c) Mẫu trắng
Hình 2: Kết quả quét phổ của dung dịch đem đo quang định lượng IgY kháng độc tố tả
(a) Dung dịch thử; (b) Dung dịch chuẩn; (c) Mẫu trắng
Quét phổ để xác định cực đại hấp thụ của mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng Kết quả cho thấy phổ chuẩn và phổ thử đều xuất hiện cực đại hấp thụ ở bước sóng
450 nm Trên mẫu trắng không có cực đại hấp thụ này, cho thấy phương pháp đảm bảo tính đặc hiệu
2 Khoảng tuyến tính
Chuẩn bị dãy chuẩn từ 1,56 - 100,0 ng/ml bằng pha loãng dung dịch chuẩn gốc với dung dịch pha loãng (chứa 10 mM Tris, pH 7,4 và 150 mM NaCl) Thực hiện phản ứng theo như mô tả ở phương pháp nghiên cứu Đánh giá mối tương quan giữa nồng độ IgY và độ hấp thụ quang đo được Kết quả trình bày như bảng 1, 2 và hình 3, 4
Trang 4Bảng 1: Mối tương quan giữa mật độ quang nồng độ IgY kháng VK tả
Hình 3: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mật độ quang và
nồng độ IgY kháng VK tả
Bảng 2: Mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ kháng thể IgY kháng độc
tố tả
Nồng độ IgY kháng độc tố tả
lgY kháng VK tả
Nồng độ (ng/ml)
Trang 5Hình 4: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mật độ quang và
nồng độ IgY kháng độc tố tả
Kết quả bảng 1, 2; hình 1 và 2 cho thấy: nồng độ IgY cũng như nồng độ kháng thể
IgY kháng độc tố tả và mật độ quang có tương quan chặt chẽ với nhau, hệ số tương
quan tuyến tính xấp xỉ bằng 1
3 Độ lặp lại
Tiến hành xử lý mẫu với các mẫu chuẩn kháng thể IgY kháng độc tố tả và VK tả có
nồng độ khác nhau: LQC (3,13 ng/ml), MQC (6,25 ng/ml)) và HQC (25 ng/ml) Phân
tích trong cùng 1 ngày, để bảo quản, sau đó phân tích sau 3 ngày để xác định độ lặp
lại của phương pháp phân tích
Bảng 3: Kết quả xác định độ lặp lại trong ngày và khác ngày định lượng IgY kháng
VK tả và độc tố tả
IgY kháng
VK tả
IgY kháng
độc tố tả
Kết quả cho thấy, RSD ở 3 mức nồng độ ngoại suy từ đường chuẩn, kể cả trong
ngày và khác ngày đều < 2,0% Với kết quả này, phương pháp phân tích đáp ứng yêu
cầu về độ lặp lại
4 Độ đúng
Sử dụng phương pháp thêm chuẩn để xác định độ đúng của phương pháp định lượng
Thêm các lượng kháng thể IgY chuẩn vào mẫu thử đã biết hàm lượng Tiến hành xử lý
mẫu theo phương pháp đã lựa chọn ở trên Sau đó, đo mật độ quang ở bước sóng
450 nm và dựa vào đường chuẩn để ngoại suy lượng thêm vào
lgY kháng độc tố tả
Nồng độ (ng/ml)
Trang 6Bảng 4: Kết quả xác định độ đúng định lượng IgY kháng VK tả và độc tố tả
Loại
Lượng tìm thấy (ng)
Độ thu hồi (%)
Lượng tìm thấy (ng)
Độ thu hồi (%)
Lượng tìm thấy (ng)
Độ thu hồi (%)
IgY kháng độc tố tả 3,13 ± 0,08 100,1 ± 2,6 6,32 ± 0,05 101,2 ± 0,7 25,66 ± 0,20 102,6 ± 0,8
Ở 3 mức thêm chuẩn, độ thu hồi của mẫu đều đạt ≥ 98% Như vậy, phương pháp định lượng đáp ứng yêu cầu về độ đúng
5 Giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện
Có nhiều phương pháp để xác định giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện của phương pháp Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp ngoại suy từ độ dốc đường tuyến tính và độ lệch chuẩn của mẫu trắng để xác định LOD và LOQ, trong
đó LOD = 3,3 × SD/δ và LOQ = 10 × SD/δ; với SD là độ lệch chuẩn của mẫu trắng và
δ là độ dốc đường tuyến tính Kết quả nghiên cứu đã xác định được LOD và LOQ của IgY kháng VK tả và IgY kháng độc tố tả đều lần lượt là 0,04 ng/ml và 0,13 ng/ml
* Áp dụng đánh giá một số mẫu kháng thể IgY:
Chúng tôi áp dụng phương pháp định lượng trên để xác định lượng kháng thể IgY còn hoạt tính trong một số mẫu sản xuất ở Học viện Quân y
Bảng 5: Kết quả xác định lượng IgY kháng VK tả và độc tố tả ở một số mẫu
Như vậy, lượng IgY còn hoạt tính ở một số mẫu sản xuất được tại Học viện Quân y dao động ở mức khoảng ≥ 60% Điều này có thể do các mẫu này lấy ở phân đoạn với phương pháp tách chiết và tinh chế khác nhau
KẾT LUẬN
Đã xây dựng được phương pháp định
lượng IgY còn hoạt tính kháng VK tả
và độc tố tả bằng phương pháp ELISA
Phương pháp được thẩm định theo quy
định chung của ICH và Bộ Y tế Việt Nam, đảm bảo các yêu cầu về tính đặc hiệu, độ đúng (98,9 - 102,6%), độ chính xác (RSD
< 2%), độ lặp lại, giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện Xác định lượng IgY kháng VK tả và độc tố tả ở một số mẫu
Trang 7cho thấy lượng kháng thể còn hoạt tính
của IgY kháng VK tả từ 67,6 - 96,1%,
của IgY kháng độc tố tả từ 56,7 - 94,5%,
tùy thuộc vào phương pháp tinh chế, tách
chiết khác nhau
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Cục Quản lý Dược - Bộ Y tế Sổ tay
Hướng dẫn tạm thời đăng ký thuốc Ban hành
kèm theo quyết định số 229/QĐ-QLD ngày 12
tháng 08 năm 2010 2010
2 Hoàng Trung Kiên và CS Nghiên cứu
quy trình gây miễn dịch tạo kháng thể IgY
kháng VK tả (Vibrio cholerae) trên gà mái
2013, số 1
3 ICH Validation of analytical procedures:
text and methodology Q2R1 2005
4 Kazuyuki Hirai et al Passive oral
immunization by egg yolk immunoglobulin
(IgY) to Vibrio cholerae effectively prevents
cholera Acta Med Okayama 2010, 64 (3),
pp 163-170
5 World Health Organization., Cholera 2007
Wkly Epidemiol Rec Geneva 2008, 83,
pp.269-283
6 Xiao-Yu Li et al Chitosan-alginate
microcapsules for oral delivery of egg yolk immunoglobulin (IgY): in vivo evaluation in a pig model of enteric colibacillosis Veterinary Immunology and Immunopathology 2009,
129 (1), pp.132-136
7 Xiao-Yu Li et al Chitosan-alginate
microcapsules for oral delivery of egg yolk immunoglobulin (IgY) Journal of Agricultural and Food Chemistry 2007, 55 (8),
pp.2911-2917
8 Yoshinori Mine, Jennifer Kovacs-Nolan
Chicken egg yolk antibodies as therapeutics
in enteric infectious disease: a review Journal
of Medicinal Food 2002, 5 (3), pp.159-169.