Tinh sạch Peptid người tái tổ hợp có khả năng thấm qua màng, khả năng ứng dụng trong protein trị liệu

Bài viết Tinh sạch Peptid người tái tổ hợp có khả năng thấm qua màng, khả năng ứng dụng trong protein trị liệu trình bày những khiếm khuyết của protein là nguyên nhân của phần lớn các bệnh ở người. Protein trị liệu là liệu pháp thay thế có hiệu quả cho phần lớn các bệnh liên quan tới quá trình tổng hợp sai protein hoặc ức chế tiến trình biệt hóa sai của tế bào ung thư,... Mời các bạn cùng tham khảo.

TINH SẠCH PEPTID NGƯỜI TÁI TỔ HỢP CÓ KHẢ NĂNG THẤM

QUA MÀNG, KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG PROTEIN TRỊ LIỆU

Nguyễn Văn Hạnh

Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn Lâm KH - CN Việt Nam Những khiếm khuyết của protein là nguyên nhân của phần lớn các bệnh ở người Protein trị liệu là liệu

pháp thay thế có hiệu quả cho phần lớn các bệnh liên quan tới quá trình tổng hợp sai protein hoặc ức chế

tiến trình biệt hóa sai của tế bào ung thư Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày kết quả tổng hợp các

peptid có khả năng thấm qua màng tế bào (CPP) từ bộ gen người nhằm cung cấp công cụ mới tạo các

protein tái tổ hợp có thể xuyên màng để ứng dụng trong sinh học và y học Hai CPP mới được chọn từ vùng

chuyển tín hiệu vào nhân của tác nhân phiên mã ở người Chúng được thử chức năng vận chuyển vào tế

bào Hela và Jurkat trong điều kiện in vitro Kết quả cho thấy, những protein mới có hiệu quả vận chuyển

tương tự đối TAT-EGFP mặc dù chúng có trình tự acid amin ngắn hơn Các protein đi vào tế bào chất và

nhân, từ đó giả thiết rằng các protein liên quan nội bào có thể ứng dụng cho mục đích trị liệu

Từ khóa: CPP, protein tái tổ hợp, protein trị liệu, TAT

Địa chỉ liên hệ: Nguyễn Văn Hạnh - Viện Công nghệ Sinh

học - 18 Hoàng Quốc Việt - Hà Nội

Email: nvhanh@ibt.ac.vn

Ngày nhận: 27/11/2012

Ngày được chấp thuận: 26/4/2013

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Hướng quan trọng nhất của liệu pháp

protein là tạo các protein có chức năng ngăn

chặn sự kích hoạt các gen dẫn đến phát triển

tế bào ung thư Ngoài ra, protein cũng được

định hướng để kích hoạt các gen sản xuất

các sản phẩm cần thiết như insulin hay làm

tác nhân đáp ứng trong các bệnh nhân thiếu

hụt miễn dịch [1] Hiện đã có một số thuốc là

protein hay có nguồn gốc từ các protein đã

được thương mại hóa và có mặt trên thị

trường Theo thông báo gần đây trong

nghiên cứu “phân tích thị trường protein trị

liệu toàn cầu”, thị trường này dự báo sẽ tăng

trung bình 13% trong giai đoạn 2012 - 2014

Thông báo này cũng tiết lộ lĩnh vực kháng thể

đơn dòng sẽ chiếm ưu thế nhất trong các loại

thuốc Ttuy nhiên các thuốc trong lĩnh vực

protein cũng hứa hẹn tạo ra thị trường nhiều tỉ

đô la [2]

Các peptid có khả năng thấm qua màng tế bào (cell permeable peptides - CPP) bao gồm một nhóm các peptid có khả năng thấm qua màng sinh chất của tế bào sống [3] Các nghiên cứu phát triển CPP được tiến hành sau khám phá ra cơ chế truyền nhiễm của HIV khi chúng dựa vào protein TAT để thâm nhập vào tế bào người [4] Dựa vào phát hiện này, các CPP mới đã được phát triển là các peptid

có chiều dài 10 - 14 acid amin, giàu arginin và leucin ở các loài sinh vật hay được tổng hợp nhân tạo [5] Đánh giá chức năng của những CPP này thường dựa vào khả năng vận chuyển protein từ môi trường ngoài vào trong

tế bào Tuy nhiên, các peptid ngoài việc chúng

có chức năng vận chuyển protein qua màng, chúng cũng là các yếu tố ngoại sinh nên thường gây độc cho các tế bào người Do vây, để tăng khả năng ứng dụng trong y học

do tránh được tính độc hại của các peotein ngoại lai, những peptid có nguồn gốc gần gũi hoặc tổng hợp từ DNA người sẽ là công cụ tốt

để phát triển các thuốc theo định hướng protein trị liệu [6]

Trong nghiên cứu này, nhằm mục tiêu thử nghiệm khả năng vận chuyển protein của các peptid có nguồn gốc từ các đoạn gen chuyển tín hiệu vào nhân tế bào (nuclear localling signal) ở người thay thế cho các peptid có nguốc gốc từ virus hay các vi sinh vật khác để ứng dụng tạo protein trị liệu trong tương lai

II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

1 Chuẩn bị protein tái tổ hợp

Protein EGFP tái tổ hợp được tổng hợp và tinh sạch theo phương pháp của Choi và cộng

sự [7] Trình tự DNA của TAT và các CPP khác được nhân lên cùng với gen EGFP (hình 1) trong vector pET28a(+), biểu hiện trong

E coli BL21 (hình 2)

Hình 1 Sơ đồ cấu tạo thành phần các protein trong nghiên cứu

Hình 2 Sơ đồ vector biểu hiện các

protein

Protein được hoạt hóa tổng hợp bằng IPTG (500 µM), tinh sạch bằng phương pháp

sử dụng cột Niken (Qiagen) gắn kết với đuôi 6 Histidin trong vector pET28a (+) Sau khi tinh sạch, protein được khử muối bằng cột PD10 (Qiagen), trong môi trường PBS 20% glycerol Protein được định lượng, chia nhỏ và bảo quản ở -20oC cho tới khi sử dụng

2 Đánh giá khả năng vận chuyển pro-tein trên tế bào Jurket

Phương pháp thử nghiệm chức năng xuyên màng của protein được thực hiện theo Gomez và cộng sự [3] Tế bào lympho T (tế bào Jurkat, RIKEN) được nuôi trong môi trường RPMI-1640 có bổ sung 10% FBS, 50 IU/ml penicillin và 50 µg/ml streptomycin Thu toàn bộ tế bào sau 2 ngày nuôi, ly tâm 3000 v/p, gieo tế bào theo nồng độ 1,5 triệu tế bào vào mỗi đĩa nuôi 6 giếng Protein thử nghiệm được bổ sung vào các đĩa nuôi đạt nồng độ

5 mM Nuôi tế bào trong vòng 1 giờ ở 37oC,

độ ẩm bão hòa, 5% CO2 Thu mẫu tế bào đã

xử lý, rửa 2 lần bằng PBS trước khi đo độ phát xạ huỳnh quang bằng máy FACS (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)

3 Đánh giá khả năng vận chuyển protein trên tế bào Hela

Phương pháp thử nghiệm chức năng xuyên màng của protein được thực hiện theo Choi và cộng sự [3] Tế bào Hela được nuôi trong môi trường D-MEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium), bổ sung 10% huyết thanh bò, trên các phiến kính tròn trong đĩa nuôi 4 giếng Sau 2 ngày nuôi, tế bào mọc chiếm khoảng 60% diện tích phiến kính sẽ tiến hành thí nghiệm Quá trình thí nghiệm được tiến hành theo bước sau: 1) hút toàn bộ môi trường nuôi cũ, thay bằng 500 ml môi trường nuôi mới chứa 5 mM protein, nuôi trong 1 giờ trong tủ nuôi 37oC, độ ẩm bão hòa, 5% CO2

2) hút toàn bộ môi trường, rửa 2 lần bằng 500

ml dung dịch PBS, sau đó thêm 500 ml hóa

chất nhuộm nhân Hoechst pha loãng theo tỷ lệ

1/4000 trong PBS Tế bào được nhuộm trong

30 phút; 3) Tế bào được rửa 2 lần bằng 500

ml dung dịch PBS, sau đó cố định bằng formaldehyd 10% trong 15 phút 4) rửa tấm phiến kính 2 lần bằng nước cất và đặt lên lam kính để quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (Olympus, Nhật Bản)

Hình 3 Hình ảnh điện di gen SDS các sản phẩm protein sau tinh sạch

Khối lượng EGFP (30,55 kDa); TAT-EGFP (30,1 kDa); CPP2-EGFP (29,85 kDa);

CPP3-EGFP (31,48kDa)

III KẾT QUẢ

Kết quả tổng hợp các protein tái tổ hợp được trình bày trong hình 3 Kết quả cho thấy, các

protein có độ tinh sạch cao, kích thước từ 29,85 kDa (CPP2-EGFP) đến 31,48 kDa

(CPP3-EGFP) Hai CPP-EGFP mới có kích thước protein tương tự với TAT-EGFP Kết quả hấp thụ

protein vào trong tế bào Jurkat đánh giá bằng máy flow cytometric được thể hiện trong hình 4

Hình 4 So sánh khả năng vận chuyển protein của peptid mới với TAT

trong vận chuyển protein vào tế bào jurkat

a) với EGFP mức vận chuyển không có sự khác biệt so với đối chứng không tế bào và CPP2

-EGFP có mức độ biểu hiện tương đương TAT EGFP

b) với EGFP mức vận chuyển không có sự khác biệt so với đối chứng không tế bào và CPP3

-EGFP có mức độ biểu hiện tương đương TAT EGFP

a b

Với hàm lượng protein 5 mM, ủ trong vòng

1 giờ biểu hiện phát quang của lô xử lý bằng EGFP là tương đương với lô đối chứng không

xử lý trong khi ở lô xử lý CPP2-EGFP và CPP3-EGFP có mức độ biểu hiện tương tự với TAT-EGFP

Kết quả hấp thụ protein vào trong tế bào Hela được thể hiện trong hình 5 Hình ảnh

hiển vi cho thấy, hàm lượng protein mới được hấp thụ vào tế bào là tương đồng với TAT-EGFP Các protein CPP-EGFP mới thấm vào

cả tế bào chất và nhân của tế bào Trong hầu hết các lô thí nghiệm xử lý 100% tế bào có hấp thụ protein Thời gian protein vận chuyển vào đến nhân tế bào giao động từ 15 đến

30 phút

Hình 5 Protein biểu hiện trong tế bào Hela

Với bước sóng ánh sáng chuyên dụng cho Hoechst tất cả các lô xử lý đều cho ánh sáng như nhau trong khi bước sóng cho ánh sáng phù hợp EGFP chỉ có các lô tế bào xử lý CPP - EGFP có phát quang tương tự TAT - EGFP

IV BÀN LUẬN

Cơ chế vận chuyển qua màng của các peptid đã được nghiên cứu trong suốt thập kỷ qua Mục tiêu của hướng nghiên cứu này là khẳng định khả năng ứng dụng trong trị liệu, vì trong quá trình xử lý cần tránh những tổn thương tới các tế bào khỏe mạnh Gần đây, những nghiên cứu đã dần làm sáng tỏ các con đường vận chuyển qua màng của các CPP [1] Từ những kết quả này, những CPP

có khả năng kết hợp với protein trị bệnh mà

có đặc tính phù hợp với từng loại tế bào sẽ được nghiên cứu phát triển Các nghiên cứu

đã cho thấy, các đoạn peptid ngắn thuộc đoạn gen chuyển tín hiệu vào nhân tế bào (nuclear

localization signal) trên các protein có hoạt động dẫn truyền protein qua màng sinh chất của tế bào sống [7] Các protein tái tổ hợp thường được thiết kế để có thể vận chuyển được EGFP từ môi trường nuôi vào trong các

tế bào, với cấu trúc gắn đầu cuối N của peptid với đầu cuối C của EGFP (hình 1) [8] Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào đánh giá khả năng vận chuyển protein của các peptid được khảo sát thông qua kết quả hình ảnh thu được của đích đến protein EGFP Kết quả đã cho thấy các protein sau khoảng thời gian nhất định đã khu trú tại vùng nhân của tế bào (hình 5)

Việc phát triển các CPP mới nhằm ứng

dụng cho hướng protein trị liệu đã được

nhiều phòng thí nghiêm trên thế giới theo

đuổi Từ việc thay đổi một vài acid amin trong

trình tự của TAT để tăng tính thấm vào loại tế

bào chuyên biệt [9] hay tạo các CPP tổng hợp

có trình tự toàn arginin [10] Đáng chú ý, việc

xác định của một nhóm protein trên đó có một

vùng khả năng đảm nhiệm chức năng vượt

qua các màng tế bào một cách thụ động đã

dẫn đến hướng nghiên cứu trong lĩnh vực

đánh giá tính chất thâm nhập vào màng tế bào

của protein [11] Các CPP mới ngoài việc xác

định có khả năng chuyển qua màng còn phát

triển để đến những loại tế bào hay cơ quan

nhất định [12] Trong nghiên cứu này của

chúng tôi, tuy khả năng vận chuyển của peptid

mới không cao hơn so với TAT nhưng ưu thế

của peptid mới là đều có nguồn gốc từ DNA

người nên sẽ có khả năng ứng dụng cao hơn

do hạn chế được tính độc và tính kháng miễn

dịch đối với protein lạ của cơ thể

V KẾT LUẬN

Nghiên cứu này đã tổng hợp được các

peptid mới có nguồn gốc từ người và có

khả năng vận chuyển qua màng tế bào

Việc phát triển gắn các peptid này với các

protein định hướng chữa bệnh sẽ được

tiếp tục thực hiện trong các nghiên cứu

tiếp theo

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Stewart K.M., Horton K.L., Kelley S.O.,

(2008) Cell-penetrating peptides as delivery

vehicles for biology and medicine Org

Biomol Chem 6, 2242 - 2255

2 Szlachcic A., Zakrzewska M., Otlewski

J., (2011) Longer action means better drug:

Tuning up protein therapeutics Biotech Adv

29, 436 - 441

3 Gomez J.A., Chen J., Ngo J., et al (2010)

Cell-Penetrating Penta-Peptides (CPP5s):

Measurement of Cell Entry and

Protein-Transduction Activity Pharmaceuticals 3,

3594 - 3613

4 Frankel A.D., Pabo C.O (1988) Cellular

uptake of the tat protein from human

immunodeficiency virus Cell 55 (6), 1189 - 1193

5 Torchilin V.P., (2008) Tat

peptide-mediated intracellular delivery of

pharmaceutical nanocarriers Adv Drug Del

Rev 60, 548 – 558

6 Torchilin V.P., (2011) Tumor delivery of

macromolecular drugs based on the EPR

effect Adv Drug Del Rev 63, 131 – 135

7 Choi J.M., Ahn M.H., Chae W.J., et al

(2006) Intranasal delivery of the cytoplasmic

domain of CTLA-4 using a novel protein transduction domain prevents allergic

inflammation Nat med 12 (5), 574 - 579

8 Wadia J.S., Stan R.V., Dowdy S.F., (2004) Transducible TAT-HA fusogenic

peptide enhances escape of TAT-fusion

proteins after lipid raft macropinocytosis Nat

Med 10 (3), 310 - 315

9 Lea N.C., Buggins A.G.S., Orr S.J., et

al (2003) High efficiency protein transduction

of quiescent and proliferating primary

hematopoietic cells J Biochem Biophys

Methods 55, 251 - 258

10 Fuchs S.M., Raines R.T., (2005)

Polyarginine as a multifunctional fusion tag

Protein Sci 14, 1538 - 1544

11 Wadia J.S., Dowdy S.F., (2005)

Transmembrane delivery of protein and peptide drugs by TAT-mediated transduction

in the treatment of cancer Adv Drug Del

Rev 57, 579 – 596

12 Foerg C., Merkle H.P., (2008) On the

biomedical promise of cell penetrating

peptides: limits versus prospects J Pharm

Sci 97 (1), 144 - 162

Summary PURIFICATION OF RECOMBINANT CELL PERMEABLE PROTEINS

AND THE POSSIBILITY FOR PROTEIN THERAPY

Inactivated proteins caused many human diseases Protein therapy is one of the therapies for many diseases related to a defected protein or inhibitor of a biological process to stop the growth

of the tumor Here, we present the results of improved recombinant cell-penetrating peptides (rCPPs) These rCPPs can serve as new tools for delivering protein in biology and medicine ap-plications We cloned the CPP in-frame with green fluorescent protein (rCPP - GFP) We were

able to express and purify full-length rCPP - GFP fusion proteins The results showed that, each

purified r.protein was tested in Hela and Jurkat cell lines for their transduction efficiency and trans-location The purified rCPPs - GFP fusion proteins have biological activity as good as HIV virus derived TAT - EGFP peptides The expressed rCPPs-EGFPs were able to translocate across both the cytoplasm and nucleus, thus, these intracellular regulatory proteins can be used as protein transporters for therapeutic purposes

Key words: CPP, protein recombination, TAT, therapeutic protein

PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TỦY RĂNG CHUỘT

Hoàng Đạo Bảo Trâm 1 , Tô Minh Quân 2 , Đoàn Nguyên Vũ 2 , Nguyễn Thị Ngọc Mỹ 2 , Lê Thị Ngọc Hương 2 , Lưu Phương Nam 3 , Phan Kim Ngọc 2

1 Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

2 Trường đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh

3 Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào gốc tủy răng chuột được tiến hành trên 15 mẫu tủy răng chuột nhắt trắng Mus musculus var albino 2 - 3 tuần tuổi Răng cửa hàm dưới chuột được xử lý bằng dung dịch Peniciline 400UI/ml, Streptomycine 400µg/ml trong 20 phút Mảnh mô tủy răng được nuôi cấy sơ cấp trên đĩa 35mm trong môi trường DMEM/F12, bổ sung FBS 10%, Peniciline 100UI/ml, Streptomycine 100µg/ml, ở điều kiện 37 o C, CO 2 5% Sau 3 tuần, các tế bào hợp dòng, cấy chuyền sang Flask 25cm 2 và tiếp tục quá trình nuôi cấy thứ cấp cho tới thế hệ thứ tư (P4) Sự biểu hiện các marker bề mặt của tế bào được đánh giá bằng phương pháp Flow Cytometry Kết quả cho thấy tế bào tủy răng chuột P4 có biểu hiện các marker của

tế bào gốc trung mô CD73, CD90, CD105 và không biểu hiện các marker của tế bào máu CD19, CD34, CD45 Các tế bào có thời gian nhân đôi là 45 giờ và đỉnh đường cong tăng trưởng đạt vào ngày thứ 7 Tế bào gốc tủy răng chuột đã được nuôi cấy thành công bằng phương pháp nuôi cấy mảnh mô tủy răng chuột

Từ khóa: tế bào gốc tủy răng, phân lập tế bào, nuôi cấy tế bào

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Tủy răng là mô liên kết chứa các tế bào, mạch máu và thần kinh, có chức năng duy trì

sự sống của răng Tương tự như tủy xương, tủy răng chứa các tế bào gốc trung mô Ngoài

ra, tủy răng còn chứa tiền nguyên bào ngà và