Nghiên cứu nhằm mục tiêu trình bày ứng dụng quy trình PCR chẩn đoán sự hiện diện của gen SRY nằm trên nhiễm sắc thể Y. Nghiên cứu tiến hành DNA của 5 thai nhi được tách chiết từ các mẫu dịch ối của 5 thai phụ có tuổi lớn hơn 40. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết.
Trang 1ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR PHÁT HIỆN SỰ HIỆN DIỆN
CỦA GEN SRY TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH
CÁC BỆNH LÝ DI TRUYỀN
Nguyễn Thị Băng Sương *
TÓM TẮT
Mở đầu: Việc điều trị các bệnh lý di truyền vẫn còn là vấn đề thách thức đối với nền y học, do vậy việc
phòng bệnh bằng chẩn đoán trước sinh là biện pháp cần thiết và có hiệu quả cao Đối với bệnh di truyền liên kết với giới tính, chẩn đoán giới tính thai nhi đóng vai trò quan trọng trong quá trình chẩn đoán trước sinh
Mục tiêu: Ứng dụng quy trình PCR chẩn đoán sự hiện diện của gen SRY nằm trên nhiễm sắc thể Y Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: DNA của 5 thai nhi được tách chiết từ các mẫu dịch ối của 5 thai
phụ có tuổi > 40 Các mẫu dịch ối này đã được xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ để chẩn đoán thai nhi có mắc hội chứng Down hay không Tiến hành kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn gen SRY nằm trên nhiễm sắc thể Y bằng cặp mồi đặc hiệu Sau đó điện di trên gel agarose 1,5% để xác định giới tính của thai nhi So sánh với kết quả giới tính được xác định bằng nhiễm sắc thể đồ
Kết quả: Phát hiện được 2 thai nhi có giới tính nam và 3 thai nhi có giới tính nữ Kết quả này phù hợp với
phân tích bằng nhiễm sắc thể đồ
Kết luận: Nghiên cứu đã ứng dụng thành công kỹ thuật PCR giúp xác định giới tính của thai nhi, điều này
có ý nghĩa thực tiễn trong chẩn đoán trước sinh các bệnh lý di truyền trên nhiễm sắc thể giới tính
Từ khoá: chẩn đoán trước sinh, gen SRY, nhiễm sắc thể Y
ABSTRACT
APPLICATION OF PCR TECHNIQUE FOR IDENTIFICATION OF SRY GENE IN PRENATAL
DIAGNOSIS OF GENETIC DISEASES
Nguyen Thi Bang Suong * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 17 - No 1 - 2013: 38 - 43
Introduction: The treatment of genetic diseases is still a challenge in medicine, then prevention by prenatal
diagnosis is necessary and effective For disorders are sex-linked genetic disease, detection of fetal gender is very important in prenatal diagnosis
Objective: Application of PCR technique for detection the presence of SRY gene located on Y chromosome Patients and Methods: DNA was extracted from five amniotic fluid samples of five women with age > 40
The amniotic fluid samples were tested to diagnose Down syndrome before by karyotype The SRY gene was amplified with a pair of specific primer After that, PCR products were electrophoresis on agarose gel to determine the sex of fetus
Results: 2 fetus are male and the other fetus are female, this result is suitable for the sex of fetus analyzed by
karyotype
Conclusion: This study applied successfully PCR techniques to determine the sex of fetus, this process is
very important in prenatal diagnosis of sex-linked disorders
* Bộ môn Hóa Sinh, Trung Tâm Sinh Học Phân Tử, Khoa Y - Đại học Y Dược TPHCM
Tác giả liên lạc: TS BS Nguyễn Thị Băng Sương ĐT: 0914007038 Email: suongnguyenmd@gmail.com
Trang 2Keywords: prenatal diagnosis, SRY gene, Y chromosome.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Các bệnh lý di truyền chiếm một tỷ lệ khá
cao và đây là nguyên nhân gây tử vong chính
trong thời kỳ sơ sinh Một số bệnh ở trạng thái dị
hợp tử có biểu hiện hoàn toàn bình thường,
người mang gen có thể kết hôn và khả năng
truyền gen bệnh cho thế hệ sau với tỷ lệ cao
Trường hợp bệnh thuộc dạng di truyền liên kết
giới tính X (như hemophilia A, hemophilia B,
loạn dưỡng cơ Duchenne,…) thì tỷ lệ mắc bệnh ở
trẻ nam tương đối cao hơn so với nữ do chỉ cần
nhận 1 nhiễm sắc thể X bị đột biến từ người mẹ
thì sẽ biểu hiện bệnh, trong trường hợp này nếu
người mẹ có kiểu gen dị hợp tử thì khả năng
truyền gen bệnh cho con trai là 50%(8) Việc điều
trị các bệnh lý di truyền vẫn còn là một thách
thức lớn đối với nền y học Phần lớn bệnh nhân
vẫn tử vong, để lại hậu quả nặng nề cho gia đình
và xã hội Hiện nay, nhờ sự tiến bộ của ngành
sinh học phân tử, một số bệnh lý di truyền có thể
được điều trị khả quan hơn Tuy nhiên, trước khi
có những phương pháp điều trị triệt để các bệnh
lý di truyền bằng liệu pháp gen thì việc chẩn
đoán trước sinh và phòng bệnh bằng phương
pháp phá thai chủ động những thai nhi mắc
bệnh được các nhà khoa học khuyên dùng nếu
chưa thực hiện được kỹ thuật PGD
(preimplantation genetic diagnosis) Đối với
những bệnh lý di truyền liên kết giới tính, phân
tích giới tính thai nhi luôn đi kèm với việc phân
tích gen để xác định tình trạng bệnh lý(4) Nếu là
bệnh di truyền theo nhiễm sắc thể X thì giới tính
nam của thai nhi được xếp vào nhóm yếu tố
nguy cơ cao, khả năng mắc bệnh rất lớn Việc xác
định giới tính của thai nhi trong chẩn đoán trước
sinh các bệnh lý di truyền được nghiên cứu rất
nhiều, các tác giả thường lựa chọn kỹ thuật xác
định gen SRY nằm trên nhiễm sắc thể Y(5) Có
nhiều phương pháp được tiến hành để xác định
sự hiện diện của gen SRY trên nhiễm sắc thể Y
như PCR, realtime PCR,… tuy nhiên, phương
pháp PCR thực hiện đơn giản, hiệu quả, thời
gian nhanh và giá thành tương đối rẻ nên được
nhiều tác giả sử dụng(1) Chúng tôi tiến hành đề tài này với mục tiêu: “Ứng dụng quy trình PCR chẩn đoán sự hiện diện của gen SRY nằm trên nhiễm sắc thể Y”
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu
- 20 người bình thường gồm 10 người nam
và 10 người nữ dùng làm mẫu đối chứng nam và
nữ để chuẩn hóa quy trình Mỗi người được lấy
2 ml máu tĩnh mạch chống đông bằng EDTA
- 5 mẫu dịch ối của năm thai phụ có độ tuổi trên 40, chọc ối để làm nhiễm sắc thể đồ giúp chẩn đoán thai nhi có bị hội chứng Down hay không Kết quả nhiễm sắc thể đồ xác định có 2 thai nam và 3 thai nữ
Phương pháp nghiên cứu
Kỹ thuật tách chiết ADN từ máu ngoại vi và
từ dịch ối
- Ly trích DNA từ máu ngoại vi: Máu tươi được chống đông bằng EDTA, được tách trong
vòng 24 giờ Quy trình tách chiết DNA từ 200 μl
máu ngoại vi được tiến hành theo QiAgen Kit
Đo nồng độ và độ tinh sạch của DNA, những mẫu có giá trị tỷ lệ về mật độ quang đo ở bước sóng 260/280 đạt ≥ 1,8 mới được sử dụng để tiến hành phản ứng PCR
- Ly trích DNA thai nhi từ mẫu dịch ối: lấy 1
ml dịch ối cho vào ống tube 2 ml, quay ly tâm 10.000 vòng/phút, thu cặn Hòa tan cặn trong 200 nước tinh khiết và tiến hành tách DNA dịch ối bằng QiAgen Kit tương tự như quy trình tách mẫu máu ngoại vi Sau khi tách DNA, đo nồng
độ và độ tinh sạch của DNA, những mẫu có giá trị tỷ lệ về mật độ quang đo ở bước sóng 260/280 đạt ≥ 1,8 mới được sử dụng để tiến hành phản ứng PCR
- Quy trình tách chiết DNA từ máu ngoại vi
và dịch ối theo QiAgen Kit:
+ Bước 1: Cho vào tube 1,5ml: 20μl QIAGEN protease (proteinase K), 200μl máu toàn phần (hoặc 200 μl cặn dịch ối), 200μl Buffer AL Vortex
Trang 3đều trong 15 giây
+ Bước 2: Ủ tube ở 56OC trong 10 phút, spin
trong 5 giây để loại bọt khí
+ Bước 3: Thêm 200μl Ethanol (96 – 100%)
vào tube, vortex 15giây, spin 5 giây
+ Bước 4: Chuyển hỗn hợp sang cột lọc chứa
trong tube 2 ml, quay ly tâm 8.000 vòng trong 1
phút
+ Bước 5: Chuyển cột sang tube 2ml mới, hút
500μl Buffer AW1 cho vào cột lọc, quay ly tâm
8.000 vòng trong 1 phút
+ Bước 6: Chuyển cột sang tube 2ml mới, hút
500μl Buffer AW2 cho vào cột lọc, quay ly tâm
14.000 vòng/ 3 phút
+ Bước 7: Chuyển cột sang tube 2ml mới,
quay ly tâm 14.000 vòng/1phút
+ Bước 8: Chuyển sang cột thu 1,5ml Thêm
200 μl Buffer AE (đối với mẫu dịch ối chỉ thêm
100 μl Buffer AE) Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút,
quay ly tâm 8.000 vòng trong 1 phút
+ Bước 9: Thu DNA và bảo quản ở nhiệt độ -
20OC
Đo nồng độ và độ tinh sạch DNA
Theo nguyên lý
- Acid nucleic có phổ hấp thụ cực đại ở ánh
sáng tử ngoại 260 nm là do có mặt của base
purin và pyrimidin Giá trị mật độ quang ở bước
sóng 260 nm (A260nm) của các mẫu cho phép xác
định nồng độ acid nucleic trong mẫu
- Protein hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước
sóng 280 nm do sự hấp thụ của các acid amin
thơm và dị vòng như tyrosin, tryptophan và
phenylalanin Đo phổ hấp thụ của protein ở
bước sóng 280 nm (A280nm)
- Dựa vào tỷ lệ A260nm/A280nm để kiểm tra độ
tinh sạch của DNA, nếu A260nm /A280nm = 1,8- 2,0
thì DNA được coi là tinh sạch Các mẫu DNA có
kết quả 1,8 – 2,0 mới được dùng để tiến hành
phản ứng PCR
Kiểm tra chất lượng phân tử DNA tách từ
máu và dịch ối
Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi khuếch đại gen GAPDH, sản phẩm khuếch đại
có kích thước 290 bp (base pair)
Mồi xuôi GAPDH:
5’–ACATGTTCCAATATGATTCC – 3’ Mồi ngược GAPDH
5’–TGGACTCCACGACGTACTCA – 3’
Thành phần phản ứng
Chu kỳ nhiệt của phản ứng
Đầu tiên là giai đoạn biến tính ở 96°C trong 5 phút, tiếp theo là 40 chu kỳ gồm biến tính ở 94°C trong 30 giây; gắn mồi ở 55°C trong 30 giây và bước kéo dài 72°C trong 60 giây, cuối cùng là giai đoạn hoàn chỉnh ở 72°C trong 5 phút và bảo quản tạm thời sản phẩm PCR ở 15°C Kết quả khuếch đại được điện di trên gel agarose 1,5%
Xác định sự hiện diện của gen SRY
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn
gen SRY (có kích thước 252 bp) đặc hiệu trên
NST Y, cặp mồi này được thiết kế bằng phần mềm Lightscanner primer design Sau khi thiết
kế, các mồi được kiểm tra SNPs (single nucleotide polymorphism) để đảm bảo không có
sự hiện diện các SNP trong trình tự mồi:
- Mồi xuôi SRY:
5’- ACGTCCAGGATAGAGTGAAGCGAC- 3’
- Mồi ngược SRY:
5’- GGCAGCATCTTCGCCTTCCGACGA- 3’
Thành phần phản ứng
Trang 4Thành phần Thể tích (µl)
Chu kỳ nhiệt của phản ứng
Đầu tiên là giai đoạn biến tính ở 96°C trong 5
phút, tiếp theo là 40 chu kỳ gồm biến tính ở 94°C
trong 45 giây; gắn mồi ở 53°C trong 30 giây và
bước kéo dài 72°C trong 45 giây, cuối cùng là giai đoạn hoàn chỉnh ở 72°C trong 5 phút và bảo quản tạm thời sản phẩm PCR ở 15°C
Kết quả PCR được điện di trên thạch agarose nồng độ 1,5% Dựa vào sự xuất hiện vạch điện di
có kích thước 252 bp, tương ứng với sự hiện diện của NST Y để xác định sự hiện diện của nhiễm
sắc thể Y (chứa gen SRY)
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả tách chiết DNA từ bạch cầu máu ngoại vi và từ dịch ối
Bảng 1: Nồng độ và độ tinh sạch các mẫu DNA
Mã số
(mẫu
chứng)
Nồng ñộ DNA
(ng/µl)
ðộ tinh sạch
(A 260 /A 280 )
Mã số (mẫu chứng)
Nồng ñộ DNA
(ng/µl)
ðộ tinh sạch
(A 260 /A 280 )
Mã số (dịch ối)
Nồng ñộ DNA
(ng/µl)
ðộ tinh sạch
(A 260 /A 280 )
Nhận xét
- DNA tổng số tách từ bạch cầu máu ngoại vi
có giá trị từ 45-65 ng/µl Trong khi đó nồng độ
DNA tách chiết từ dịch ối thấp hơn, từ 10-15
ng/µl
- Độ tinh sạch của các mẫu DNA đạt yêu cầu
với tỷ lệ mật độ quang đo được ở bước sóng
260/280 nm luôn nằm trong khoảng 1,8-2,0 Với
độ tinh sạch này, các phân tử DNA được sử
dụng để tiến hành phản ứng PCR
Kiểm tra chất lượng phân tử DNA tách từ
máu và dịch ối bằng cặp mồi GAPDH
Các vạch điện di có băng sáng đồng nhất, bờ
đều, sắc gọn Chứng tỏ chất lượng sản phẩm
DNA tốt, không bị đứt gãy và có thể sử dụng để
thực hiện các phản ứng phân tích tiếp theo
(Hình 1)
Hình 1: Kết quả khuếch đại DNA bằng cặp mồi
GAPDH Mẫu C5: mẫu đối chứng nam, C10: chứng
nữ, Ối 1 đến Ối 5: các mẫu dịch ối
Kết quả xác định gen SRY của thai nhi
Tiến hành khuếch đại gen SRY của các thai
nhi, phản ứng luôn kèm hai mẫu đối chứng nam
và nữ
Ở mẫu chứng nam có xuất hiện vạch điện di
có kích thước 252 bp, tương ứng với vạch
khuếch đại của gen SRY, trong khi đó mẫu
chứng nữ và mẫu nước (không chứa DNA)
Trang 5không xuất hiện vạch này
Các mẫu dịch ối 2, ối 5 xuất hiện vạch tương
ứng với vạch khuếch đại đoạn gen SRY Trong
khi mẫu dịch ối 1, ối 3 và ối 4 không xuất hiện
vạch này (Hình 2)
Hình 2: Kết quả xác định sự có mặt gen SRY của thai
nhi
BÀN LUẬN
Sự phát triển không ngừng của sinh học
phân tử trong những thập niên gần đây đã giúp
cho các ngành khoa học phát triển trên mọi lĩnh
vực Trong lĩnh vực Y học, kỹ thuật sinh học
phân tử giúp chẩn đoán rất nhiều bệnh lý như
ung thư, di truyền, nhiễm trùng,… Bên cạnh đó
nó còn được ứng dụng trong điều trị và phòng
bệnh Hiện nay có rất nhiều kỹ thuật di truyền
giúp chẩn đoán các bệnh lý ở mức độ gen như
PCR, giải trình tự gen, kỹ thuật lai phân tử, tạo
dòng, … Tuy nhiên muốn thực hiện được các kỹ
thuật di truyền này thì bước đầu tiên chúng ta
phải tách chiết được các phân tử acid nucleic của
tế bào Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng
bộ kit ly trích DNA (QIAamp Blood Kit) của
hãng QiAgen Đây là một hãng hóa chất rất uy
tín của Mỹ Bộ kít hóa chất này được sử dụng để
tách DNA từ tế bào bạch cầu, tự dịch ối hoặc các
dịch khác của cơ thể Quy trình tách chiết gồm
nhiều phản ứng liên tiếp, có những phản ứng
được lặp lại nhiều lần để loại bỏ hết những chất
không cần thiết giúp sản phẩm có độ tinh sạch
cao Năm 2011, Hui L sử dụng bộ kit QIAamp
Blood Kit để tách chiết tế bào thai nhi từ dịch ối
và nghiên cứu đã thu được các phân tử DNA có
đặc tính tốt, giúp cho nghiên cứu được thành
công(3) Bảng 1 mô tả nồng độ và độ tinh sạch của
các phân tử DNA tách chiết từ máu ngoại vi của
các mẫu đối chứng và các mẫu DNA của thai nhi
được tách từ dịch ối Nồng độ DNA của các mẫu đối chứng (tách từ bạch cầu máu ngoại vi) có giá trị từ 45-65 ng/µl, trong khi các mẫu DNA tách chiết từ dịch ối có nồng độ thấp hơn, khoảng
10-15 ng/µl Điều này phù hợp với thực tế do máu ngoại vi chứa nhiều bạch cầu có nhân (nhân tế bào chứa acid nucleic), trong khi đó số lượng tế bào thai nhi trong dịch ối không nhiều như số lượng bạch cầu trong máu ngoại vi Bảng 1 còn cho thấy mật độ quang của các mẫu DNA đo ở bước sóng 260 nm và 280 nm Theo Khất Hữu Thanh, khi tỷ lệ mật độ quang đo được ở bước sóng 260/280 nm nằm trong khoảng 1,8-2,0 thì phân tử DNA có độ tinh sạch cao(6) Sản phẩm
tách chiết của chúng tôi có tỷ lệ 260/280 nm giao động từ 1,81 đến 1,87, chứng tỏ quy trình tách chiết DNA hiệu quả, có độ tinh sạch cao
Sau khi xác định nồng độ và độ tinh sạch của DNA chúng tôi tiến hành kiểm tra chất lượng của DNA bằng phản ứng khuếch đại gen GAPDH với cặp mồi đặc hiệu Gen GADPH hiện diện ở mọi tế bào của cơ thể và được xem như là gen nội chuẩn được sử dụng để kiểm tra chất lượng của DNA nói chung Sau phản ứng khuếch đại, nếu chất lượng DNA không tốt, bị đứt gãy hay tạp nhiễm thì băng điện di trên agarose sẽ mờ, bờ không đều, loang lổ, xuất hiện các băng phụ(7) Đối với nghiên cứu của chúng tôi, sau khi khuếch đại các phân tử DNA bằng cặp mồi GADPH, kết quả điện di agarose luôn xuất hiện những băng sáng, bờ đều, không có băng phụ (hình 1) Như vậy, có thể chứng minh rằng các phân tử DNA thu được có chất lượng tốt, có thể sử dụng để tiến hành các kỹ thuật sinh học phân tử khác
Để xác định giới tính của thai nhi, chúng tôi
sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho phép khuếch đại
đoạn gen SRY nằm trên NST Y, trình tự
nucleotid của cặp mồi được thiết kế bằng phần mềm chuyên dụng Phản ứng PCR được tiến hành trên các mẫu DNA của thai nhi, kèm theo mẫu đối chứng nam (mẫu chứng dương), chứng
nữ (mẫu chứng âm) và mẫu nước không chứa DNA để kiểm tra khả năng ngoại nhiễm của
Trang 6phản ứng PCR Sản phẩm khuếch đại được điện
di trên thạch agarose nồng độ 1,5% Xác định
giới tính của thai nhi dựa vào sự xuất hiện vạch
điện di đặc hiệu có kích thước 252 bp, hoặc so
sánh với kích thước của vạch xuất hiện ở mẫu
đối chứng nam Mỗi mẫu DNA thai nhi, lặp lại
phản ứng ba lần để tránh sự nhầm lẫn Hình 2
cho thấy mẫu đối chứng nam xuất hiện vạch có
kích thước 252 bp, tương vứng với kích thước
đoạn gen SRY được khuếch đại, trong khi mẫu
đối chứng nữ và mẫu nước không xuất hiện sản
phẩm khuếch đại Điều này chứng tỏ có sự hiện
diện gen SRY ở người này, kết quả phù hợp vì
đây là người nam bình thường Quan sát hình
ảnh điện di của mẫu ối 2 và ối 5 chúng ta thấy có
xuất hiện vạch tương ứng với vạch của đoạn gen
SRY ở mẫu đối chứng nam (có kích thước 252
bp) Theo nghiên cứu của Hussey ND, khi điện
đi kết quả khuếch đại gen SRY bằng cặp mồi đặc
hiệu, nếu có xuất hiện vạch có kích thước tương
ứng với kích thước đoạn gen SRY được khuếch
đại thì mẫu DNA đó có mang gen SRY hay nói
cách khác mẫu DNA này là của người có giới
tính nam Trong trường hợp kết quả điện di
không xuất hiện vạch tương ứng với đoạn gen
SRY thì mẫu DNA đó không chứa gen SRY, như
vậy giới tính là nữ(4) Như vậy hình 2 giúp chúng
ta kết luận mẫu ối 2 và ối 5 có giới tính là nam
Đối với mẫu ối 1, 3 và 4, kết quả điện di
không xuất hiện vạch nào cả, chứng tỏ không có
sự hiện diện của gen SRY ở các thai nhi này, hay
nói cách khác các thai nhi này có giới tính là nữ
Chúng tôi lặp lại thí nghiệm 3 lần đều có kết quả
như nhau Khi so sánh với kết quả nhiễm sắc thể
đồ của các thai nhi chúng tôi thấy kết quả của
nghiên cứu phù hợp với kết quả nhiễm sắc thể
đồ, thai nhi 2 và 5 có sự hiện diện của nhiễm sắc
thể Y, trong khi các thai nhi 1, 3 và 4 mang cặp nhiễm sắc thể giới tính XX Điều này chứng tỏ quy trình xác định giới tính của nghiên cứu này
có độ tin cậy cao
KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã xây dựng được quy trình xác định giới tính của thai nhi bằng kỹ thuật PCR, điều này có ứng dụng thực tiễn rất lớn trong quá trình chẩn đoán trước sinh và tư vấn các bệnh lý
di truyền, đặc biệt các bệnh di truyền liên kết nhiễm sắc thể giới tính
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Coriat AM, Müller U, Harry JL, Uwanogho D, Sharpe PT
(1993), “PCR amplification of SRY-related gene sequences reveals evolutionary conservation of the SRY-box motif” PCR
Methods Appl, 2(3); pp.218-22
2 Galbiati S, Smid M, Gambini D, Ferrari A, Restagno G, Viora E, Campogrande M, Bastonero S, Pagliano M, Calza S, Ferrari M, Cremonesi L (2005), “Fetal DNA detection in maternal plasma throughout gestation” Hum Genet, 117(2-3); pp.243-8
3 Hui L, Bianchi DW (2011), “Cell-free fetal nucleic acids in amniotic fluid” Hum Reprod Update, 17(3); pp 362-71
4 Hussey ND, Donggui H, Froiland DA, Hussey DJ, Haan EA, Matthews CD, Craig JE (1999), “Analysis of five Duchenne muscular dystrophy exons and gender determination using conventional duplex polymerase chain reaction on single cells” Mol Hum Reprod, 5(11); pp.1089-94
5 Jameson JL, Achermann JC, Ozisik G, Meeks JJ (2003), “Battle
of the sexes: new insights into genetic pathways of gonadal development” Trans Am Clin Climatol Assoc, 114; pp.51-63
6 Khuất Hữu Thanh (2006), “Kỹ thuật gen - Nguyên lý và ứng dụng”, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr 102-53
7 Tran V.K., Takeshima Y., Zhang Z., Yagi M., Nishiyama A., Habara Y., Matsuo M (2007), “A nonsense mutation-created intraexonic splice site is active in the lymphocytes, but not in the skeletal muscle of a DMD patient” Hum Genet, 120, pp 737-42
8 Wilhelm D, Palmer S, Koopman P (2007), “Sex determination and gonadal development in mammals” Physiol Rev, 87(1); pp.1-28
Ngày nhận bài: 29/11/2012 Ngày phản biện đánh giá bài báo: 06/1/2013 Ngày bài báo được đăng: 31/01/2013