Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Tạo dòng hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) đột biến bằng tia gamma ( 60Co) trong điều kiện in vitro

Mục tiêu của luận án là xác định liều gây chết 50% (LD50) của tia gamma (60Co) trên mô sẹo và cụm chồi hoa huệ sau 150 ngày nuôi cấy. Xác định các dạng bất thường về kiểu hình của cây giai đoạn thuần dưỡng. (4) Chọn đƣợc một đến hai dòng hoa huệ tăng về số lượng cánh hoa (nhiều hơn 12 cánh), kích thước hoa to hơn và có mùi thơm theo phƣơng pháp nhân giống truyền thống.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU & PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-oOo-

ĐÀO THỊ TUYẾT THANH

TẠO DÕNG HOA HUỆ (Polianthes tuberosa

TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

Mã ngành: 62 42 02 01

Cần Thơ - 2018

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU & PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-oOo-

ĐÀO THỊ TUYẾT THANH

TẠO DÕNG HOA HUỆ (Polianthes tuberosa

TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

Mã ngành: 62 42 02 01

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS TS Nguyễn Bảo Toàn

Cần Thơ - 2018

TRANG XÁC NHẬN CỦA NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

Luận án “Tạo dòng hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) đột biến bằng tia

Thanh thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Bảo Toàn

Người hướng dẫn khoa học Tác giả luận án

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn thầy, PGS.TS Nguyễn Bảo Toàn, đã tận tình

hướng dẫn khoa học, tư vấn thiết kế các thí nghiệm, hướng dẫn cách tiếp cận

luận án nghiên cứu sinh

Xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh Đạo Viện Nghiên cứu & Phát triển

Công nghệ Sinh học, Trại Nghiên cứu & Thực nghiệm Nông nghiệp thuộc

Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Khoa Sau Đại Học đã tạo điều kiện

thuận lợi trong thực hiện các thủ tục, hỗ trợ hóa chất và trang thiết bị cho các

nghiên cứu của Luận án

Chân thành cảm ơn quý thầy cô, các anh chị, các bạn đồng nghiệp thuộc

Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ Sinh học và Khoa Nông nghiệp &

Sinh học Ứng dụng đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong

suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn chú Nguyễn Thượng Hiền đã hỗ trợ nguồn giống

hoa huệ Đồng thời, tôi cũng chân thành gửi lời cảm ơn đến các em học viên

cao học đã cộng tác trong suốt thời gian thực hiện luận án

Xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Giám đốc Trung Tâm Dạy nghề &

Hỗ trợ Nông dân tỉnh Tiền Giang, các anh chị em đồng nghiệp đã hỗ trợ trong

công tác để tôi có thời gian hoàn thành được khóa học

Sau cùng tôi xin được cảm ơn những người thân yêu trong gia đình đã

luôn động viên, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình

học tập và nghiên cứu

Đào Thị Tuyết Thanh

TÓM TẮT

Nghiên cứu “Tạo dòng hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) đột biến bằng

được môi trường nuôi cấy để tạo vật liệu cho các thí nghiệm; (2) xác định

cây giai đoạn thuần dưỡng; (4) chọn được một đến hai giống hoa huệ tăng về

số lượng cánh hoa, kích thước hoa và hoa có mùi thơm theo phương pháp

truyền thống Nghiên cứu bao gồm tạo nguồn vật liệu cho thí nghiệm trên hai

Co)

của mô sẹo và cụm chồi in vitro; thuần dưỡng và đánh giá sự thay đổi về mặt

hình thái lá và hoa rồi chọn ra ít nhất hai dòng có kiểu hình trội Kết quả thí

nghiệm cho thấy môi trường cơ bản bổ sung 1,0 mg/l NAA và 4,0 mg/l BA

(60Co) khoảng 10-15 Gy (giá trị tính là 10,96 ± 2,96 Gy) trong khi LD50 của

các giống/dòng hoa huệ kép khoảng 20-25 Gy (giá trị tính là 22,91 ± 4,01 Gy)

Theo dõi sự sinh trưởng chồi in vitro, khi xử lý liều chiếu xạ càng cao thì số

chồi, chiều cao chồi và số lá càng giảm ở cả hai giống và các dòng hoa huệ

Giai đoạn này ghi nhận được các dạng bất thường về hình thái ở lá và chồi

Giai đoạn thuần dưỡng, các cây còn nhỏ, sự khác biệt về hình thái lá và chồi

không nhận thấy rõ ràng Ở giai đoạn ngoài đồng, các chỉ tiêu sinh trưởng đều

bị ảnh hưởng bởi các liều chiếu xạ ở các dòng hoa huệ Có sự xuất hiện các

dạng bất thường về hình thái lá, thân và số cánh hoa Đặc biệt, trên cùng một

phát hoa huệ đơn có sự gia tăng số lượng cánh hoa lên 7 và 8 cánh (thay vì hoa

mùi thơm, trừ dòng hoa huệ với liều xử lý 5 Gy với đặc điểm hoa không nở

hoàn toàn Ở hoa huệ kép chọn được 2 dòng đột biến tiềm năng nhất về đặc

điểm hoa to và có mùi thơm với 22 và 36 cánh

ABSTRACT

The study on "Inducing of mutation tuberose (Polianthes tuberosa L.)

lines by irradiating with 60Co gamma rays in vitro" was carried out (1) to

determine culture medium to create materials for experiments on two

tuberoses, single petals and double petals; (2) to determine the effects of

(3) to determine morphological diversities at acclimatization stage; (4) to

select two new tuberose lines having bigger flower size, larger number of

petals and aromatic odour The obtained results included producing materials

calli and shoot clumps in vitro; acclimatizing and evaluating changes on

morphologies and petals, and selecting, at least, two lines with better

phenotypes The implemented experiments showed that the base medium

supplemented with 1.0 mg/l NAA and 4.0 mg/l BA was very suitable for

single petal tuberose variety was obtained about 10-15 Gy (the counting value

was 10.96±2.96 Gy), whereas that of double petal oneabout 20-25 Gy (the

counting value was 22.91±4.01 Gy) At the in vitro stage, the higher radiation

doses were, the lower number of shoot got, shoot height and the number of

leaves were the same as in all varieties/lines There were also appearances of

the abnormal structures or disappearance of the chlorophyll in leaves At the

acclimatization stage, the lethal rates of plantlets were significantly different

from each other for the irradiation doses, and the variations of leaves and

shoots were not clearly recognized At the field stage, the growth parameters

such as the number and diameter of bulbs, the height of inflorescences, the

number of flowers and the days to flowering in all varieties/lines were affected

by irradiated doses There were appearances of variability of leaves, trunks

and petal number In single petal tuberose, there was an increase of petal

number (up to 7 or 8) in each inflorescence Almost single petal tuberose

tuberose lines irradiated at 5 Gy In double petal tuberoses, among the

variations of phenotypes were the two fragrant mutant lines with 22 and 36

petals, having the most potential ability for production

Key words: gamma, in vitro, irradiation, LD 50 , mutation, petal, tuberose

CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

CAM KẾT KẾT QUẢ

Tôi xin cam kết luận án “Tạo dòng hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) đột

trên các kết quả nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS

Nguyễn Bảo Toàn Các kết quả của công trình nghiên cứu này chưa được

dùng cho bất cứ luận án cùng cấp nào khác

Tác giả luận án

Đào Thị Tuyết Thanh

MỤC LỤC

Trang

TRANG XÁC NHẬN CỦA NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC i

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

ABSTRACT iv

CAM KẾT KẾT QUẢ v

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH BẢNG xii

DANH SÁCH HÌNH xiv

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT xvi

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 2

1.2.1 Mục tiêu chính 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 2

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

1.5 Điểm mới của luận án 3

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

2.1 Giới thiệu về cây hoa huệ 5

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại thực vật cây hoa huệ 5

2.1.2 Đặc điểm thực vật cây hoa huệ 5

2.1.3 Tình hình sản xuất hoa huệ trên thế giới và ở Việt Nam 7

2.1.3.1 Trên thế giới 7

2.1.3.2 Ở Việt Nam 7

2.1.4 Tầm quan trọng và mục đích sử dụng hoa huệ 8

2.1.5 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển 9

2.1.6 Một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây 9

2.1.6.1 Nhiệt độ 9

2.1.6.2 Độ sâu khi trồng 10

2.1.6.3 Các chất dinh dưỡng 10

2.2 Kỹ thuật trồng và chăm sóc cây hoa huệ 11

2.2.1 Chuẩn bị giống 11

2.2.2 Chuẩn bị đất 12

2.2.3 Chăm sóc 12

2.2.4 Sâu bệnh trên cây hoa huệ 12

2.3 Kỹ thuật nuôi cấy in vitro trong chọn tạo giống cây trồng đột biến 13

2.3.1 Các giai đoạn của nuôi cấy thực vật in vitro 13

2.3.2 Các loại mẫu cấy trong nuôi cấy in vitro ở cây hoa huệ 13

2.3.3 Kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (meristem culture) 14

2.3.4 Môi trường nuôi cấy thực vật in vitro 15

2.3.4.1 Dinh dưỡng khoáng và vitamin trong nuôi cấy thực vật in vitro 15

2.3.4.2 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong nuôi cấy thực vật in vitro 16

2.3.4.3 Các chất bổ sung khác trong nuôi cấy thực vật in vitro 17

2.3.5 Sự hình thành mô sẹo và chồi (cụm chồi) trong nuôi cấy thực vật in vitro 17

2.3.5.1 Sự hình thành mô sẹo trong nuôi cấy in vitro 17

2.3.5.2 Sự hình thành chồi trong nuôi cấy in vitro 18

2.4 Phương pháp xử lý đột biến bằng kỹ thuật chiếu xạ trong chọn tạo giống cây trồng 19

2.4.1 Sơ lược về đột biến bằng kỹ thuật chiếu xạ 19

2.4.2 Đặc điểm của tia phóng xạ gamma 19

2.4.2.1 Cơ chế tạo đột biến của tia gamma (60 Co) 19

2.4.2.2 Hiệu quả của tia gamma trong chọn giống cây trồng 20

2.4.2.3 Liều chiếu xạ 20

2.4.2.4 Liều gây chết LD50 21

2.4.2.5 Tần số đột biến in vitro 21

2.4.3 Ý nghĩa của phương pháp chọn giống đột biến 22

2.4.4 Tình hình tạo giống ở hoa huệ trên thế giới và ở Việt Nam 22

2.4.4.1 Trên thế giới 22

2.4.4.2 Ở Việt Nam 23

2.5 Sự kết hợp của chọn giống đột biến bằng nuôi cấy thực vật in vitro và chiếu xạ tia gamma 23

2.5.1 Nguồn vật liệu để tạo đột biến in vitro 23

2.5.2 Ưu điểm và khuyết điểm của phương pháp chọn giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro và xử lý đột biến bằng tia gamma 23

2.5.3 Một số kết quả nghiên cứu về sử dụng phương pháp nuôi cấy thực vật in vitro và xử lý đột biến bằng tia gamma ở các loại cây trồng 24

2.5.4 Một số nghiên cứu về xử lý đột biến bằng nuôi cấy thực vật in vitro và chiếu xạ tia gamma ở cây hoa huệ trên thế giới và ở Việt Nam 25

2.6 Ứng dụng chỉ thị di truyền để chọn lọc dòng đột biến trong chọn giống cây trồng và hoa huệ bằng xử lý tác nhân vật lý 25

2.6.1 Phản ứng chuỗi trùng hợp 26

2.6.2 Kỹ thuật chuỗi lặp lại đơn giản giữa (Inter Simple Sequence Repeat-ISSR) 26

2.6.3 Một số nghiên cứu về sử dụng PCR-ISSR trong chọn giống cây trồng bằng xử lý đột biến 27

2.6.4 Một số nghiên cứu ở cây hoa huệ sử dụng phương pháp PCR-ISSR 27

2.6.5 Phân tích sự đa hình trình tự ADN trên gen ITS (Internal Transcribed Spacer) 28

2.7 Địa lý và điều kiện tự nhiên ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long 29

2.7.1 Tiền Giang 29

2.7.2 Cần Thơ 30

2.7.3 An Giang 30

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

3.1 Phương tiện nghiên cứu 31

3.1.1 Thời gian và địa điểm 31

3.1.2 Vật liệu thí nghiệm 31

3.1.3 Trang thiết bị và hóa chất 32

3.2 Phương pháp nghiên cứu 33

3.2.1 Nội dung 1: Tạo vật liệu cho xử lý chiếu xạ bằng tia gamma (60Co) trong điều kiện in vitro 34

3.2.1.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây hoa huệ 34

3.2.1.2 Tạo mô sẹo và cụm chồi hoa huệ cho xử lý chiếu xạ 35

3.2.2 Nội dung 2: Xác định hiệu quả của liều lượng tia gamma (60Co) trên hai giống/dòng hoa huệ bằng liều gây chết 50% (LD50) in vitro 36

3.2.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của liều lượng tia (60Co) gamma đến sự sinh trưởng và phát triển của cụm mô sẹo ở giống/dòng hoa huệ đơn 37

3.2.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của liều lượng tia gamma (60Co) đến sự sinh trưởng và phát triển của cụm chồi ở giống/dòng hoa huệ kép 38

3.2.2.3 Nhân chồi và tạo rễ thành cây hoa huệ hoàn chỉnh 39

3.2.3 Nội dung 3: Xác định sự đa dạng về mặt hình thái của cây con giai đoạn thuần dưỡng trong nhà lưới 39

3.2.4 Nội dung 4: Chọn các dòng hoa huệ tăng về số cánh hoa, kích thước hoa và hoa có mùi thơm theo phương pháp truyền thống 40

3.2.4.1 Thí nghiệm 3: Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của giống/dòng hoa huệ đơn sau khi xử lý tia gamma (60Co) ở ngoài đồng 40

3.2.4.2 Thí nghiệm 4: Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của giống/dòng hoa huệ kép sau khi xử lý tia gamma (60Co) ở ngoài đồng 42

3.2.4.3 Đánh giá đa dạng ADN ở giống/dòng hoa huệ đột biến 43

3.3 Phương pháp xử lý số liệu 45

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47

4.1 Tạo vật liệu cho xử lý chiếu xạ bằng tia gamma (60Co) trong điều kiện in

vitro 47

4.1.1 Tỷ lệ sống khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (ĐST) hai giống hoa huệ 47

4.1.2 Nhân cụm mô sẹo (callus) và cụm chồi 47

4.2 Xác định hiệu quả của liều lượng tia gamma (60Co) trên hai giống/dòng hoa huệ bằng liều gây chết 50% (LD50) in vitro 48

4.2.1 Hiệu quả của liều lượng tia gamma (60Co) đến sự sinh trưởng và phát triển của mô sẹo giống/dòng hoa huệ đơn 48

4.2.1.1 Tỷ lệ tái sinh chồi ở cụm mô sẹo giống/dòng hoa huệ đơn 48

4.2.1.2 Tỷ lệ chết của cụm mô sẹo/chồi ở giống/dòng hoa huệ đơn 49

4.2.1.3 Liều gây chết LD50 của cụm mô sẹo/chồi ở giống/dòng hoa huệ đơn 50 4.2.1.4 Số chồi, chiều cao chồi và số lá ở giống/dòng hoa huệ đơn 52

4.2.1.5 Tác động của các liều chiếu xạ tia gamma (60Co) trên các cấu trúc bất thường ở giống/dòng hoa huệ đơn 53

4.2.2 Hiệu quả của liều lượng tia gamma (60Co) đến sự sinh trưởng và phát triển của cụm chồi giống/dòng hoa huệ kép 54

4.2.2.1 Tỷ lệ chết của cụm chồi ở giống/dòng hoa huệ kép 54

4.2.2.2 Liều gây chết LD50 của cụm chồi ở giống/dòng hoa huệ kép 55

4.2.2.3 Số chồi, chiều cao chồi và số lá ở giống/dòng hoa huệ kép 57

4.2.2.4 Tác động của các liều chiếu xạ tia gamma (60Co) trên các cấu trúc bất thường ở giống/dòng hoa huệ kép 59

4.2.3 Nhân chồi và tạo rễ thành cây hoa huệ hoàn chỉnh 61

4.3 Xác định sự đa dạng về mặt hình thái của cây con giai đoạn thuần dưỡng trong nhà lưới 62

4.3.1 Tỷ lệ chết của các giống/dòng hoa huệ đơn giai đoạn thuần dưỡng 62

4.3.2 Tỷ lệ chết của các giống/dòng huệ kép giai đoạn thuần dưỡng 63

4.3.3 Các dạng bất thường về kiểu hình của các giống/dòng hoa huệ đơn và kép giai đoạn thuần dưỡng 64

4.4 Chọn các dòng hoa huệ tăng về số cánh hoa, kích thước hoa và hoa có mùi thơm theo phương pháp truyền thống 64

4.4.1 Trồng lần 1 (M1) 64

4.4.1.1 Các đặc điểm sinh trưởng và ra hoa ở giống/dòng hoa huệ đơn 64

4.4.1.2 Các đặc điểm sinh trưởng và ra hoa ở các giống/dòng hoa huệ kép 75

4.4.2 Trồng lần 2 (M2) 90

4.4.3 Đánh giá đa dạng di truyền các giống/dòng hoa huệ bất thường chọn được 92

4.4.3.1 Đánh giá sự đa dạng di truyền bằng phương pháp đánh dấu phân tử ISSR-PCR 92

4.4.3.2 Giải trình tự vùng ITS các giống/dòng hoa huệ 96

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 101

5.1 Kết luận 101

5.2 Đề nghị 103

CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 104

LÝ LỊCH TRÍCH NGANG 105

TÀI LIỆU THAM KHẢO 106

PHỤ LỤC BẢNG 131

PHỤ LỤC HÌNH 140

DANH SÁCH BẢNG

Trang

loại cây trồng 21

Bảng 3.1: Bố trí các liều chiếu xạ và nghiệm thức ở giống hoa huệ đơn 37

Bảng 3.2: Bố trí các liều chiếu xạ và nghiệm thức ở giống hoa huệ kép 39

Bảng 3.3: Danh sách các mồi ISSR sử dụng đánh giá đa dạng ADN các

giống/dòng huệ 44

Bảng 4.1: Tỷ lệ sống của đỉnh sinh trưởng ở hai giống hoa huệ đơn và hoa huệ

kép ở 30 ngày sau khi cấy 47

Bảng 4.2: Tỷ lệ tái sinh chồi ở cụm mô sẹo ở giống/dòng hoa huệ đơn 49

Bảng 4.3: Tỷ lệ chết của cụm mô sẹo/chồi ở giống/dòng hoa huệ đơn sau 150

ngày nuôi cấy 50

Bảng 4.4: Bảng chuyển đổi tỷ lệ chết ở giống/dòng hoa huệ đơn ở các liều

chiếu xạ 51

Bảng 4.5: Số chồi, chiều cao chồi và số lá của giống/dòng hoa huệ đơn đã xử

lý tia gamma (60Co) sau 150 ngày nuôi cấy 52

Bảng 4.6: Phần trăm xuất hiện cấu trúc bất thường ở giống/dòng hoa huệ đơn

Bảng 4.9: Số chồi, chiều cao chồi và số lá của giống/dòng hoa huệ kép đã xử

lý tia gamma (60Co) sau 150 ngày nuôi cấy 59

Bảng 4.10: Phần trăm xuất hiện cấu trúc bất thường ở giống/dòng hoa huệ kép

đã xử lý tia gamma (60Co) sau 100 ngày nuôi cấy 60

Bảng 4.11: Tỷ lệ chết của cây sau 30 ngày thuần dưỡng ở giống/dòng huệ đơn

Bảng 4.14: Các chỉ tiêu sinh trưởng của các giống/dòng hoa huệ đơn sau 180

ngày trồng 66

Bảng 4.15: Đặc điểm ra hoa của giống/dòng hoa huệ đơn khi ra hoa lần 1 68

Bảng 4.16: Tần số các dạng bất thường ở lá của các dòng hoa huệ đơn sau 60

ngày trồng 70

Bảng 4.17: Tần số các dạng bất thường ở thân và củ của các dòng hoa huệ đơn

sau 60 ngày trồng 72

Bảng 4.18: Tần số các dạng hoa bất thường trên cùng phát hoa của các dòng

hoa huệ đơn khi ra hoa lần 1 73

Bảng 4.19: Đánh giá mức độ mùi thơm ở các giống/dòng hoa huệ đơn khi ra

hoa lần 1 75

Bảng 4.20: Tỷ lệ chết của các giống/dòng hoa huệ kép sau 60 ngày trồng 76

Bảng 4.21: Các chỉ tiêu sinh trưởng của các giống/dòng hoa huệ kép sau 180

ngày 77

Bảng 4.23: Tần số các dạng bất thường ở lá của các dòng hoa huệ kép sau 60

Bảng 4.26: Tần số các dạng hoa bất thường trên cùng một phát hoa của các

dòng hoa huệ kép khi ra hoa lần 1 89

Bảng 4.27: Đánh giá mức độ mùi thơm của các giống/dòng hoa huệ kép khi ra

Bảng 4.30: Hệ số tương đồng di truyền của các giống/dòng hoa huệ chọn được

với 4 cặp mồi ISSR 95

Bảng 4.31: Kết quả BLAST đoạn gene ITS các mẫu lá hoa huệ trên cơ sở dữ

liệu của ngân hàng gene NCBI6 99

DANH SÁCH HÌNH

Trang Hình 2.1: Hoa huệ đơn (trái) và kép (phải) 6

Hình 2.3: Đỉnh sinh trưởng thực vật1 14

Hình 3.1: Giống hoa huệ đơn và kép đang canh tác ở tỉnh An Giang 32

Hình 3.2: Quy trình thực hiện tạo dòng hoa huệ đột biến bằng phương pháp

nuôi cấy in vitro và xử lý chiếu xạ tia gamma (60Co) 34

Hình 3.3: Đỉnh sinh trưởng cây hoa huệ 35

Hình 3.4: Môi trường túi nylon được chuẩn bị trước khi cấy mẫu 36

Co) 37 Hình 3.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ngoài đồng của giống/dòng hoa huệ đơn và

kép thế hệ M1 tại Cần thơ và Tiền Giang 43

Hình 4.1: Đỉnh sinh trưởng phát triển sau 30 ngày nuôi cấy 47

Hình 4.2: Sự hình thành mô sẹo (a) và cụm chồi (b) ở giống hoa huệ đơn 48

khác nhau ở giống/dòng hoa huệ đơn sau 150 ngày nuôi cấy 51

Hình 4.4: Các dạng cấu trúc bất thường của cụm chồi giống/dòng hoa huệ đơn

ở các liều chiếu xạ khác nhau sau 150 ngày nuôi cấy 54

khác nhau ở giống/dòng hoa huệ kép sau 150 ngày nuôi cấy 57

Hình 4.6: Các dạng cấu trúc bất thường của cụm chồi giống/dòng hoa huệ kép

ở các liều chiếu xạ khác nhau sau 150 ngày nuôi cấy 61

Hình 4.7: Giai đoạn ra rễ giống hoa huệ đơn 62

Hình 4.8: Đường kính củ ở giống/dòng hoa huệ đơn khi ra hoa lần 1 67

Hình 4.9: Chiều cao phát hoa của các giống/dòng hoa huệ đơn khi ra hoa lần 1

Hình 4.12: Các dòng hoa huệ đơn có số cánh hoa tăng khi ra hoa lần 1 73

Hình 4.13: Các dạng hoa huệ đơn với số cánh hoa tăng khi ra hoa lần 1 74

Hình 4.14: Số củ của các giống/dòng hoa huệ kép khi trồng lần 1 78

Hình 4.15: Chiều cao phát hoa của các giống/dòng hoa huệ kép khi ra hoa lần

Hình 4.19: Dạng hoa bất thường với hoa nở và có mùi thơm ở các giống/dòng

hoa huệ kép khi ra hoa lần 1 87

Hình 4.20: Hình thái cánh hoa các dạng hoa bất thường với số cánh hoa nhiều

hơn 12 cánh và có mùi thơm 88

Hình 4.21: Các dạng hoa bất thường trên cùng một phát hoa ở các dòng hoa

huệ kép khi ra hoa lần 1 89

Hình 4.22: Các giống hoa huệ địa phương và dòng hoa huệ đột biến chọn được

khi trồng lần 2 92

Hình 4.23: Phổ điện di sản phẩm PCR của các dòng hoa huệ đột biến và giống

gốc với một số mồi ISSR 94

Hình 4.24: Sơ đồ hình nhánh về mối quan hệ di truyền giữa các kiểu gen hoa

huệ dựa trên dữ liệu ISSR 96

Hình 4.25: Phổ điện di sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1/ITS4 96

Hình 4.26: So sánh các trình tự nucleotide của vùng ITS trên các giống/dòng

BLAST (Basic Local Alignment

ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) Kỹ thuật chuỗi lặp lại đơn giản giữa

sao mã

NCBI (National Center for

Biotechnology Information)

Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia, Mỹ

RFLP (Restriction fragment length

polymorphism)

Kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA dựa trên điểm cắt các enzym giới hạn

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Cây hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) là một trong những cây hoa cắt cành

phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Ở Việt Nam, cây hoa huệ là loại cây

trồng mang lại thu nhập cao hơn so với lúa hoặc các cây trồng khác Vì vậy, cây

hoa huệ đã được đưa vào chương trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng và được xem

là cây trồng xóa đói giảm nghèo ở các tỉnh như Tiền Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ

và An Giang Hiện nay, chỉ có hai giống hoa huệ với một tràng hoa gồm 6 cánh

hoặc với hai tràng hoa gồm 12 cánh được canh tác chủ yếu ở Đồng Bằng Sông

Cửu Long

Tuy nhiên, việc nhân giống hoa huệ chủ yếu bằng củ qua nhiều thế hệ dẫn

đến giống bị thoái hóa nghiêm trọng, dễ bị sâu bệnh tấn công và làm giảm năng

suất đáng kể Do đó, nhu cầu về giống mới để thay thế đang rất cần thiết Mặt

khác, việc lai tạo giống mới ở cây hoa huệ theo kiểu truyền thống gặp phải một

số hạn chế do tính bất tương hợp cao vì hoa có nhụy và nhị chín không cùng lúc

và hạt không tạo được trong điều kiện tự nhiên (Estrada-Basaldua et al., 2011)

Hơn nữa, chỉ có giống hoa đơn thì tạo được hạt nhưng hạt khó nẩy mầm Có lẽ

tạo đột biến là cách tốt nhất trong việc tạo giống hoa huệ mới Trong các tác nhân

đột biến vật lý, tia gamma được sử dụng rộng rãi và có hiệu quả nhất (Matsumara

et al., 2010) Kỹ thuật này làm tăng biến dị di truyền ở một số loài hoa như sự

thay đổi về màu sắc, hình dạng, đặc tính sinh trưởng… của hoa (Xu et al., 2012)

Bên cạnh đó, kỹ thuật nuôi cấy in vitro cần được áp dụng để tăng số mẫu được

chiếu xạ Sự nhân giống cây hoa huệ in vitro đã được nghiên cứu (Huỳnh Thị

Huế Trang và ctv., 2007; Hutchinson et al., 2004) Trong đó, nuôi cấy đỉnh sinh

trưởng và chiếu xạ là phương pháp hiệu quả để làm cây sạch bệnh, nhân nhanh

và có được biến dị Sự kết hợp này được áp dụng thành công trên cọ, táo, khoai

tây, khoai lang và khóm (Ulukapi and Nasircilar, 2015) và hoàn toàn có thể áp

dụng trong việc chọn tạo giống hoa huệ

Mặt khác, cánh hoa có vai trò quan trọng trong sự nở hoa, sự thụ phấn và

giao phấn… Đối với cây hoa kiểng, số lượng cánh hoa có liên quan lớn đến kiểu

hình hoa Khi xử lý tia gamma riêng lẻ và nuôi cấy in vitro kết hợp xử lý tia

gamma đã làm thay đổi số lượng cánh hoa hồng, sự gia tăng số lượng cánh hoa

Do đó, ở hoa huệ khả năng gây đột biến tạo nguồn biến dị mới về đặc điểm tăng

số lượng cánh hoa rất cao khi nuôi cấy in vitro và xử lý tia gamma Cho đến nay,

ở Việt Nam, chưa có giống hoa huệ mới với nhiều cánh hoa được tạo ra theo

phương pháp truyền thống cũng như các phương pháp chọn giống bằng kỹ thuật

công nghệ sinh học hiện đại khác Như vậy, cần thiết phải thực hiện nghiên cứu

trong điều kiện in vitro”.

1.2 Mục tiêu

1.2.1 Mục tiêu chính

Chọn được giống hoa huệ có số lượng cánh hoa nhiều hơn giống làm vật

liệu nghiên cứu, có kích thước hoa to hơn và có hương thơm

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

(1) Đánh giá kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để tạo nguồn vật liệu mô

cụm chồi hoa huệ sau 150 ngày nuôi cấy

(3) Xác định các dạng bất thường về kiểu hình của cây giai đoạn thuần

dưỡng

(4) Chọn được một đến hai dòng hoa huệ tăng về số lượng cánh hoa (nhiều

hơn 12 cánh), kích thước hoa to hơn và có mùi thơm theo phương pháp nhân

giống truyền thống

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu

- Hai giống hoa huệ đang được canh tác ở tỉnh An Giang

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu

- Số giống nghiên cứu: giống hoa huệ đơn và kép

- Thời gian nghiên cứu: Tháng 10 năm 2013 đến tháng 8 năm 2017

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

- Nghiên cứu đã kết hợp kỹ thuật nuôi cấy in vitro và xử lý chiếu xạ bằng

vật liệu khởi đầu cho quy trình chọn giống Về mặt lý thuyết, nuôi cấy đỉnh sinh

trưởng tạo được nguồn mẫu sạch bệnh

- Cung cấp số liệu về đặc điểm sinh trưởng; xác định được liều gây chết

mô sẹo (giống hoa huệ đơn) và cụm chồi (giống hoa huệ kép) giai đoạn in vitro

- Cung cấp số liệu nông học về đặc điểm sinh trưởng, ra hoa, các dạng bất

thường về lá, thân, củ, hoa và mùi thơm của hoa giai đoạn thuần dưỡng và ngoài

đồng

- Bên cạnh đó, nghiên cứu đã đánh giá sự đa dạng về mặt di truyền bằng

một số kỹ thuật ADN như PCR-ISSR và giải trình tự đoạn gen vùng ITS1/4 của 2

dòng hoa huệ đột biến chọn được và 2 giống hoa huệ đối chứng

- Kết quả của Luận án là tài liệu khoa học để tham khảo cho công tác

nghiên cứu và giảng dạy ở các Trường đại học và Viện nghiên cứu

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Kết quả nghiên cứu nuôi cấy đỉnh sinh trưởng đã tạo ra một lượng lớn

mẫu cấy sạch bệnh làm nguồn vật liệu cho nghiên cứu Phương pháp này ít tốn

kém hơn phương pháp xử lý bằng củ

- Xác định liều gây chết 50% cũng như quy trình chọn tạo giống hoa huệ rất

cần thiết cho các nghiên cứu sau này

- Các kết quả của luận án góp phần cải tiến gen và đa dạng nguồn gen hoa

huệ; đã tạo được nhiều dòng hoa huệ có đặc tính nổi trội, trong đó chọn được 2

dòng hoa huệ đột biến có các đặc tính hình thái khác biệt và có ưu điểm hơn so

với 2 giống ban đầu như hoa to, nhiều cánh (22 và 36 cánh) và có hương thơm

1.5 Điểm mới của luận án

- Luận án chọn cây hoa huệ là cây hoa có giá trị kinh tế cao nhưng chưa

được nghiên cứu trong việc tạo giống mới ở Việt Nam Luận án đã sử dụng kỹ

thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để làm vật liệu khởi đầu để xử lý chiếu xạ bằng

trên mẫu mô sẹo giống hoa huệ đơn và cụm chồi giống hoa huệ kép trong điều

kiện in vitro

- Ở hai giống/dòng hoa huệ, xác định các dạng bất thường về hình thái lá và

chồi sau 150 ngày nuôi cấy in vitro; xác định các dạng bất thường về hình thái lá,

thân và củ sau 60 ngày trồng ngoài đồng; xác định đặc điểm sinh trưởng cũng

như các dạng bất thường về hình thái hoa và mùi thơm giai đoạn sau 180 ngày

trồng ngoài đồng

- Chọn được 2 dòng hoa huệ đột biến có đặc tính khác so với giống ban đầu

như tăng số cánh hoa lên 22 và 36 cánh, kích thước hoa to và hoa có mùi thơm

sau 2 thế hệ trồng ngoài đồng

- Đánh giá đa dạng di truyền bằng phương pháp PCR-ISSR để chứng minh

sự khác biệt về gen giữa hai dòng hoa huệ đột biến so với hai giống hoa huệ đối

chứng, cụ thể là có sự xuất hiện hoặc mất đi băng ADN; tiếp tục giải trình tự gen

để so sánh trình tự ADN vùng ITS1/4 các dòng/giống hoa huệ này để thấy được

các dạng đột biến như thay thế, mất hoặc thêm một/một đoạn nucleotide

- Luận án đã xây dựng được quy trình tạo dòng hoa huệ đột biến bằng tia

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây hoa huệ

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại thực vật cây hoa huệ

Cây hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) có nguồn gốc từ Mexico, được trồng

phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, thuộc lớp phụ Lilidae, bộ Liliales và

họ Agavaceae với bộ nhiễm sắc thể 2n = 30 Tổng cộng gồm 12 loài và có 9 loài

với đặc điểm hoa màu trắng (Khandagale et al., 2014; Rodrigo et al., 2012;

Mohammadi et al., 2012)

2.1.2 Đặc điểm thực vật cây hoa huệ

Cây hoa huệ là loài đơn tử diệp, thân thảo, rễ chùm, ưa sáng, ưa nhiệt và nở

hoa quanh năm (Sangavai and Chellapandi, 2008; Ahmad et al., 2013) Loại hoa

này còn được gọi là dạ lai hương (thơm ban đêm) hoặc vũ lai hương (thơm lúc

mưa) do đặc điểm hoa nở về đêm, có khả năng tỏa hương về ban đêm với mùi

hương ngào ngạt

* Thân: Hoa huệ thuộc cây thân thảo sống nhiều năm Thân hành hay còn

gọi là thân giả được kết bởi các bẹ lá xếp chồng lên nhau, bẹ lá trước phủ lên bẹ

lá sau Thân thẳng không phân nhánh, gốc mọc lá thành chùm Cây hoa huệ có

thân thẳng đứng, tròn, màu xanh thẫm, yếu, không phân nhánh vươn lên thành

một ngồng hoa (Đặng Phương Trâm, 2005)

* Củ và rễ: Cây hoa huệ có bộ rễ chùm phát triển mạnh, rễ phân bố chủ yếu

ở lớp đất mặt 1,0-15,0 cm Có hai loại rễ: rễ mọc từ củ mẹ ban đầu là rễ sơ cấp và

rễ mọc từ củ con gọi là rễ thứ cấp, củ huệ thực chất chính là thân ngầm của cây,

củ hình tròn dài giống cây tỏi Củ giữ chức năng dự trữ các chất dinh dưỡng để

nuôi cây (Trần Văn Mão, 2006)

* Lá: Cây hoa huệ có lá đơn mọc quanh gốc, xanh và dài, cuống lá gốc

rộng và to thành hình để bao lấy củ, giữa phiến lá và bẹ lá không phân biệt rõ

ràng Lá dài, không có răng cưa, mọc lệch Chiều dài lá khoảng 20,0-30,0 cm, bề

rộng của lá từ 0,5-1,0 cm (Sangavai and Chellapandi, 2008)

* Hoa: Cây hoa huệ ra hoa không chịu ảnh hưởng bởi quang kỳ Sự tạo

mầm hoa và hình thành phát hoa cần nhiệt độ cao sau khi củ đạt đúng kích cỡ

Nhìn chung, có mối tương quan tuyến tính cao giữa thời gian ra hoa và số lá ở

cây hoa huệ (Rodrigo et al., 2012) Cây hoa huệ cho hoa quanh năm, nhưng hoa

nở chủ yếu vào mùa hè, còn mùa đông tỷ lệ ra hoa ít, hoa nhỏ và bông ngắn hơn

(Trần Văn Mão, 2006)

Phát hoa huệ thẳng và hoa mọc ở đỉnh có màu trắng, bao hoa hình phễu,

nhưng những nụ hoa có thể có màu hồng nhạt khi được trồng dưới điều kiện lạnh

(Solano, 2000) Phát hoa huệ thường dài, ở nách mỗi lá có 2 hoa màu trắng, có

tràng hoa đơn hoặc kép, nhị ở giữa Một nhánh hoa huệ dài 100 cm có thể cho

20-25 hoa màu trắng, nở từ dưới lên Trong canh tác còn gặp một số biến dị hoa

nhiều tràng, đài hoa màu tím nhạt, hương vị nhạt hơn, nhưng nhiều hoa, mỗi cây

có 24-32 bông, cây cao và to hơn (Cuc and Pilon, 2007; Trần Văn Mão, 2006;

Jitendriya and Mohammad, 2013) Cùng với mùi hương thì phát hoa dài cũng đã

góp phần tạo nên giá trị của hoa huệ trên thị trường hoa cắt cành (Benschop,

1993) Phát hoa huệ đơn có 10-20 cặp hoa Hoa thương phẩm dài từ 60,0-90,0

cm, được thu hoạch khi 2 hoặc 3 hoa ở dưới cùng nở và chỉ có khoảng 50,0% hoa

trên phát hoa nở sau khi thu hoạch (Kimani et al., 2001) (Hình 2.1)

Hình 2.1: Hoa huệ đơn (trái) và kép (phải)

(Nguồn: Kainthura and Srivastava, 2015)

Ở hoa huệ, thường có sự lẫn lộn về tên gọi Chẳng hạn, nhiều giống ở các

vùng địa lý khác nhau vẫn được gọi chung là huệ đơn hoặc kép mặc dù trong

al., 2014; Khandagale et al., 2014) Có giả thuyết cho rằng dạng hoa đơn và kép

có thể tiến hóa từ kiểu gen khác nhau và cả hai đều duy trì đặc điểm nhận dạng

riêng (Bharti et al., 2012)

2.1.3 Tình hình sản xuất hoa huệ trên thế giới và ở Việt Nam

2.1.3.1 Trên thế giới

Ở Iran, diện tích trồng hoa huệ được khoảng 288 hecta với năng suất

khoảng 29 triệu cành hoa với 4 giống (Statistics of ornamental plants, 2007) Đài

Loan chỉ có 2 giống được canh tác là giống đơn và giống kép (giống „Pearl‟)

Giống hoa có màu rất ít so với giống hoa màu trắng (Huang et al., 2001)

Rodrigo et al (2012) cho rằng hoa huệ có hai loại hoa, dạng đơn (gọi là „single‟

hoặc „huệ Mexico‟) và dạng kép (gọi là „Double‟ hoặc „giống Pearl‟) được canh

tác rộng rãi Ở Ấn Độ, có 2 nhóm hoa huệ được trồng phổ biến là huệ đơn (single

petal type) gồm: Mexican single, Shringar, Prajwal và huệ kép (double petal

type) gồm Pearl Double, Suvasini và Vaibhav (Ramasamy et al., 2004)

2.1.3.2 Ở Việt Nam

Với đặc điểm sinh thái dễ thích nghi điều kiện khí hậu nhiệt đới như ở nước

ta, yêu cầu trồng và chăm sóc không quá khắt khe nên cây hoa huệ được trồng

khá phổ biến và mang lại thu nhập rất cao cho người dân Mặc dù, du nhập vào

Việt Nam từ rất lâu và được trồng rộng rãi trong cả nước nhưng cây hoa huệ

được trồng chủ yếu ở miền Nam Diện tích canh tác cây hoa huệ ngày càng được

mở rộng Diện tích trồng hoa huệ khoảng 500-1.000 hecta/tỉnh như Tiền Giang,

Đồng Tháp, Cần Thơ, An Giang… Thu nhập mang lại trung bình từ 150-200

triệu đồng/hecta Trong những năm gần đây, trên địa bàn các tỉnh vùng Nam

Trung Bộ bắt đầu đẩy mạnh canh tác cây hoa huệ, đặc biệt ở Bình Định và

Khánh Hòa, với thu nhập trung bình 80-120 triệu đồng/hecta (Nguyễn Thị Y

Thanh, 2009)

Ở Việt Nam, có hai giống hoa huệ được canh tác chủ yếu:

- Hoa huệ kép: Giống hoa này còn gọi là huệ tứ diện, cây cao, hoa dài và

dày Hoa thường có 12 cánh, làm thành hai tràng hoa, có từ 3-6 nhị màu trắng

hoặc xanh, chiều dài bông khoảng 15,0-30,0 cm, ở nách mỗi lá có 2 hoa, được

trồng phổ biến ở miền Tây Nam Bộ Thời gian ra hoa tùy theo kích cỡ củ Củ lớn

thì cây tăng trưởng nhanh sẽ không cho bông lớn Đây là dạng giống thương mại

chủ yếu trên thị trường (Nguyễn Huy Trí, 2000)

- Hoa huệ đơn: Giống hoa này còn gọi là huệ hương có 6 cánh bao thành

một tràng hoa, 6 nhị màu xanh nhạt, bông thưa, đóng chùm, ở nách mỗi lá có 2

hoa, chiều dài bông khoảng 5,0-10,0 cm Hoa trổ một lượt nhanh và mau tàn

Cây có lá mỏng, thân yếu nên chống chịu sâu bệnh yếu hơn huệ kép Hoa có mùi

thơm nồng nhất trong các giống (Nguyễn Huy Trí, 2000) Cây thấp, hoa ngắn và

thưa Giống hoa này thơm và dễ trồng, nhưng giống hoa huệ kép được nhiều

người ưa chuộng hơn, được trồng phổ biến vì cây mọc khỏe, cho bông lớn, lâu

tàn và bán giá cao hơn huệ đơn

Tuy nhiên, hiện nay việc canh tác cây hoa huệ đang gặp nhiều khó

khăn do bị sâu bệnh phá hoại nhiều Trong đó, có một bệnh rất khó trị là bệnh

chai bông do tuyến trùng Aphelenchoides besseyi Bệnh gây thiệt hại nghiêm

trọng cho người canh tác Đặc điểm nhận dạng là các đốm nâu trên nhánh hoa

huệ, làm mất giá trị sử dụng của cây, sau đó dẫn đến cây bị chết dần (Cuc and

Pilon, 2007) Tuyến trùng có thể tồn lưu trong củ hoa huệ trong thời gian dài,

cây hoa huệ mới có nguy cơ nhiễm bệnh cao nếu tiếp tục sử dụng nguồn củ

hoa huệ đã nhiễm tuyến trùng để nhân giống Chính vì vậy, năng suất cây hoa

huệ trên nhiều vùng có xu hướng không ổn định và chất lượng hoa thì giảm

đáng kể (Huang and Chiang, 1975)

2.1.4 Tầm quan trọng và mục đích sử dụng hoa huệ

Cây hoa huệ là loại cây có giá trị kinh tế cao trong công nghiệp hoa cắt

cành, mỹ phẩm và dược liệu vì có hoa rời, đẹp, tao nhã, mùi thơm ngọt ngào

(Huang et al., 1995; Kiran et al., 2012) Ở một số quốc gia như Mỹ, Ấn Độ,

Mexico, New Zealand, Trung Quốc, Ấn Độ, Romani và Kenya, cây hoa huệ

được trồng thương mại rộng rãi, cung cấp hoa cắt cành cho thị trường ở các nước

Mỹ, Châu Âu và Nhật Bản Giống hoa này đang ưa chuộng trong ngành trích tinh

dầu thơm Bên cạnh đó, hoa huệ là nguồn tổng hợp thứ cấp được sử dụng trong

công nghiệp dược liệu rất giá trị thương mại (Kimani et al., 2001; Toma and

Sorina, 2008; Eshagh et al., 2011) Tinh dầu chiết xuất từ hoa huệ được sử dụng

là chất tạo hương và chăm sóc da trong công nghiệp mỹ phẩm, được sử dụng để

xông hơi thư giãn nhờ mùi hương dễ chịu (Roberts, 2000) Hiện nay, một số

nghiên cứu về loại hoa này đã tìm ra một số thành phần hóa học có liên quan đến

việc sản xuất ra các loại dầu thơm được chiết xuất từ các bộ phận như hoa, sáp

hoa… Trong đó, những thành phần chiết xuất được là geraniol, nerol, benzyl

alcohol, methyl benzoate, methyl silicate, ethanol, benzyl benzoate và methyl

anthranilate Loại tinh dầu thu được khi chiết xuất từ hoa gồm các chất

polysaccharide và glycoside Ngoài ra, n-alkal chiếm tỷ lệ không nhỏ tới 42%

trong sáp hoa cũng là một thành phần hóa học quan trọng trong việc chiết xuất

các loại nước hoa (Kaufman et al., 1998; Edwards, 2006) Thành phần trong tinh

dầu hoa huệ có chứa geraniol, indole và methyl anthranilate được biết là có khả

năng kháng nấm (Nidiry and Babu, 2005) Ngoài giá trị sử dụng thông thường

như trên, gần đây người ta còn sử dụng một số bộ phận của cây để làm thuốc

chữa bệnh Bộ phận thường được sử dụng là củ Trong tinh dầu củ hoa huệ có

chứa thành phần saponin, hoạt chất có khả năng tăng cường trao đổi chất trong

cơ thể động vật và bảo vệ tế bào trước sự tấn công của vi khuẩn (Majima et al.,

1995; Sadiqa et al., 1999) Saponin bao gồm hecogenin và tigogenin trong củ và

rễ hoa huệ là loại hợp chất được chiết xuất để bào chế ra một số loại thuốc quý và

làm xà phòng (Trueblood, 1973)

2.1.5 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển

Độ cao thích hợp nhất cho cây huệ là 1.200-1.800 m so với mực nước biển

Khoảng pH tối hảo cho sự phát triển của cây là 6,5-7,5 (Mishra et al., 2006)

Thời điểm thu hoạch phụ thuộc vào số hoa nở trên phát hoa và thường được

thu hoạch khi có hoa đầu tiên nở Yếu tố này được quyết định bởi sự tích lũy

carbohydrate bên trong cây, sự tích lũy này cũng ảnh hưởng đến khả năng nở của

cánh hoa sau khi thu hoạch (Varu and Barad, 2010) Củ được thu hoạch khi các

lá già khô, cây ngừng sinh trưởng và củ hầu như đã khô Củ sau khi thu hoạch

giữ được từ 1,5-2 năm Kích thước của củ giống được trồng cũng ảnh hưởng rất

lớn đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây sau này Tehranifar and

Akbari (2012) cho rằng kích thước củ giống không ảnh hưởng đến thời gian cho

hoa, chiều cao của cây nhưng lại ảnh hưởng đến số lượng và đường kính của phát

hoa, số hoa trên phát hoa và chiều dài của phát hoa Ahmad et al (2009) cũng

cho thấy rằng củ giống có kích thước đường kính từ 3,0-4,0 cm sẽ cho khả năng

sinh trưởng mạnh, chất lượng hoa tốt và tạo nhiều củ con, thích hợp cho việc

canh tác cây huệ Củ có kích thước lớn có chứa nhiều gibberellin hơn củ nhỏ

Đây cũng là lý do giải thích cho việc củ giống có kích thước lớn sẽ cho hoa sớm

hơn củ có kích thước nhỏ (Benschop, 1993)

2.1.6 Một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát

triển của cây

2.1.6.1 Nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của cây

hoa huệ và khoảng nhiệt độ thích hợp cho cây sinh trưởng tốt là từ 20-30°C Cây

hoa huệ không sống ở nơi có nhiệt độ thấp hơn 5°C và nó cũng không cần nhiệt

độ thấp để cảm ứng hình thành mầm hoa hay trong bất kỳ giai đoạn sinh trưởng

nào Một số nghiên cứu chứng minh rằng cây hoa huệ sinh trưởng tốt nhất ở mức

nhiệt độ thấp nhất là 21°C (Post, 1952) Nó cần nhiệt độ cao cho sự phân hóa

mầm hoa, giới hạn thấp nhất là 19°C (Kosugi and Kimura, 1960) Nhiệt độ thấp

trong giai đoạn tồn trữ củ huệ cũng làm chậm quá trình mọc mầm của củ

(Watako and Ngamau, 2013) Điều này có thể không thích hợp trong trường hợp

thương mại, nhưng lại có ý nghĩa quan trọng trong sự sinh tồn trong tự nhiên là

sự miên trạng của củ giúp nó chống chịu lại sự bất lợi của môi trường (Borochov

et al., 1997) Bên cạnh đó, Huang et al (2001) cũng cho thấy rằng thời gian cây

cho hoa (tính từ khi trồng đến khi cho hoa) của cây trồng ở 20°C sẽ dài hơn cây

trồng ở 25°C hay 30°C Hơn thế nữa, kích thước hoa của cây được trồng ở 30°C

cũng lớn hơn nhưng các đặc tính hoa khác như chiều dài phát hoa, số hoa trên

phát hoa lại khác biệt không có ý nghĩa thống kê Ngoài ra, nhiệt độ còn ảnh

hưởng đến chất lượng của hoa huệ Vì nhiệt độ ảnh hưởng mạnh đến sự tích lũy

anthocyanin trong cánh hoa Nhiệt độ thấp là tăng sự tích lũy anthocyanin và

ngược lại (Shaked-Sachray et al., 2002)

Hơn thế nữa, sự khác nhau về nhiệt độ do phân hóa độ cao khi trồng cây

hoa huệ cũng cho thấy ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây Thời

gian trổ lần lượt là 80,3 và 89,5 ngày và chiều cao lần lượt là 98,2 và 124,2 cm ở

độ cao 25 và 1.200 m (Huang et al., 2001) Tuy nhiên, kết quả này lại không cho

thấy có sự khác biệt thống kê của chiều dài phát hoa ở các độ cao khác nhau

Kích cỡ của hoa tăng lên khi tăng độ cao nhưng số lượng hoa lại không khác biệt

Khi trồng ở độ cao 1.200 m thì nồng độ anthocyanin cao hơn gấp 2-3 lần khi

trồng ở 25 m

2.1.6.2 Độ sâu khi trồng

Độ sâu thích hợp để trồng củ là một trong những yếu tố quyết định đến thời

gian cho hoa cũng như chất lượng của hoa được tạo ra (Hagiladi et al., 1992)

Hertogh and Le Nard (1998) cho rằng độ sâu thích hợp để trồng củ huệ là từ 3,0

đến 10,0 cm nhưng còn tùy vào điều kiện môi trường và loại đất trồng Ở đất cát

thì củ nên được trồng sâu hơn khi so với đất sét Độ sâu để trồng cũng phụ thuộc

vào kích thước của củ giống Củ lớn thì nên trồng sâu hơn củ nhỏ (Chandy,

1994) Củ trồng cạn sẽ có thời gian ra hoa và hoa nở sớm hơn khi trồng củ sâu

(Hertogh and Le Nard, 1998) Hussain et al (2014) cho thấy rằng củ huệ trồng ở

độ sâu 5,0 cm sẽ cho hoa sau 180 ngày khi so với độ sâu 10,0 và 15,0 cm lần lượt

là 198 và 212 ngày Tuy nhiên, củ được trồng sâu lại cho chiều dài phát hoa, số

hoa trên phát hoa và chiều cao cây cao hơn củ được trồng cạn Gregory (2006)

cho rằng củ được trồng sâu sẽ có khả năng tiếp cận được vùng nước hữu dụng

trong đất tốt hơn, do đó mà khả năng hấp thu dinh dưỡng trong đất cũng tốt hơn

2.1.6.3 Các chất dinh dưỡng

năng sinh trưởng, tạo hoa và củ ở cây hoa huệ Các chỉ số đo chất lượng hoa như

chiều dài phát hoa, chiều dài nhánh hoa và trọng lượng của hoa đều tăng khi gia

tăng đạm (Mukhopadhyay and Bankar, 1986) Khalaj et al (2012) cho thấy rằng

khi cung cấp 200 kg N/ha thì cây sẽ cho củ và hoa với số lượng và chất lượng tốt

số lượng và trọng lượng của hoa (Mukhopadhyay and Bankar, 1986) Trong khi

đó, kali (K2O) lại được xem như là nguyên tố liên kết với các quá trình sinh hóa

và sinh lý quan trọng trong cây (Cakmak, 2005) Nó được cho là hạn chế củ ở

trong đất bị thối Việc thiếu kali sẽ dẫn đến giảm số lượng chồi, cây cho hoa trễ

hơn và nhánh hoa ngắn hơn (Wilfert, 1980) Cây hoa huệ sinh trưởng khỏe và

cho hoa có chất lượng tốt khi cung cấp 150 kg K2O/ha (Hussain et al., 2014)

Khan and Ahmad (2004) báo cáo rằng khi bón đạm cao kèm với lượng thấp lân

và kali sẽ kích thích quá trình sinh trưởng sinh dưỡng của cây nhưng làm chậm

quá trình cho hoa Chiều dài nhánh hoa và phát hoa được gia tăng khi tăng lượng

đạm và lân cho cây (Singh et al., 1996)

Bên cạnh đó, việc cung cấp phân hữu cơ cũng cho thấy sự ảnh hưởng có

lợi đến sự sinh trưởng và phát triển cây huệ như làm tăng số hoa trên phát hoa,

chiều dài, đường kính và trọng lượng tươi của nhánh hoa (Bahadoran et al.,

2011) Điều này có thể là do trong phân hữu cơ có chứa các nguyên tố vi lượng

(Br, Mn, Cu…) và đa lượng (N, P, K, Ca…) cần thiết cho sự sinh trưởng của cây

(Barker and Pilbeam, 2006)

2.2 Kỹ thuật trồng và chăm sóc cây hoa huệ

2.2.1 Chuẩn bị giống

Theo Nguyễn Thị Y Thanh (2009) phương pháp canh tác truyền thống, cây

hoa huệ trồng bằng củ, vì vậy khi cây có nhiều lá vàng úa thì bới củ, tách nhẹ

nhàng từng củ chọn những củ có kích thước đạt chuẩn sau đó cắt bỏ lá và rễ tiến

hành phơi nắng 2-3 ngày cho lá héo rồi đem bảo quản nơi thoáng mát, cao ráo,

sau 2-3 tháng có thể đem trồng trở lại trong thời gian bảo quản nên thường

xuyên kiểm tra tránh hiện tượng củ bị thối

Trong những năm gần đây, xuất hiện bệnh chai bông trên diện rộng, vì

vậy, để phòng trừ bệnh chai bông trên cây hoa huệ cần tiến hành các bước

sau:

- Không sử dụng củ bị nhiễm bệnh hoặc củ lấy từ những ruộng đã bị

nhiễm bệnh trước đó làm củ giống

- Phơi củ trong vòng 1-1,5 tháng trước khi đem ra trồng

- Nên thay đổi chân đất sau mỗi vụ trồng hoặc luân canh cây hoa huệ

với một loại cây trồng khác

- Khi phát hiện thấy có triệu chứng bệnh cần loại bỏ cây bệnh ra khỏi

ruộng, phơi khô và đốt bỏ Khi không có củ giống sạch bệnh, có thể chọn củ ở

cây không có triệu chứng bệnh và tiến hành phơi nắng kỹ từ 1-1,5 tháng, sau

C

2.2.2 Chuẩn bị đất

Nên chọn nơi có nắng, luống trồng liên tiếp rộng khoảng 1,2-1,5 m và đào

rảnh sâu khoảng 0,5 m để có thể giữ nước tốt Luống đất nên bố trí dọc theo

hướng mặt trời để cây nhận ánh sáng tốt và đồng đều Trước khi trồng nên bón

phân lót và phun xịt các loại thuốc diệt nấm và mầm bệnh (Đặng Phương Trâm,

2005)

2.2.3 Chăm sóc

Trong canh tác cây hoa huệ, yêu cầu về nước là rất quan trọng, phải

thường xuyên tưới nước đồng thời phải xới đất và làm cỏ giúp cho bộ rễ phát

triển tốt Phân bón thường sử dụng để bón cho cây là hỗn hợp (Urea, Lân và

Kali) Sau khi trồng được khoảng 2-3 năm, cây hoa huệ bắt đầu suy thoái,

sinh trưởng chậm, cho hoa ít và chất lượng kém Do đó, phải nhổ lên, phân

loại củ và trồng lại trên một diện tích khác (Nguyễn Thị Y Thanh, 2009)

Trong thời gian trồng và thu hoạch cần tiến hành trừ cỏ, xới đất, bón

phân, tưới nước, phun thuốc… thường xuyên để tránh lây lan nguồn sâu bệnh

hại Nên bón phân với số lượng ít và chia thành nhiều đợt như bón lót, bón thúc

Ngoài cách bón vào đất còn có thể phun lên lá để bổ sung dinh dưỡng, hỗ trợ cho

quá trình ra hoa và chống rụng nụ hoa Trong thời kỳ phân hóa mầm hoa cần bón

thêm phân đạm, khi ra nụ và sau khi ra hoa cần bón thêm lân và kali (Đặng

Phương Trâm, 2005; Nguyễn Thị Y Thanh, 2009)

2.2.4 Sâu bệnh trên cây hoa huệ

Theo Nguyễn Thị Y Thanh (2009) bệnh hại trên cây hoa huệ được chia

thành 2 nhóm:

- Nhóm bệnh không truyền nhiễm, do điều kiện trồng không phù hợp

thường gặp nhất là bệnh thối lá, thối gốc, đốm lá, gỉ sắt… có thể phòng trị bằng

các loại thuốc hóa học

- Nhóm bệnh truyền nhiễm chủ yếu do vi sinh vật ký sinh gây ra bao

gồm: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm, mycoplasma, virus… thường rất khó trị, nhất

là bệnh do virus gây ra rất dễ lây lan và phát tán thành dịch, gây hại nghiêm

trọng và truyền từ đời này sang đời khác, đặc biệt là ở nhóm cây nhân giống

vô tính bằng củ như cây hoa huệ

Sau khi trồng khoảng một tháng, ở cây hoa huệ thường bị nhện đỏ phá

hại nặng trên lá Từ 3-4 tháng trở đi cây dễ bị rệp sáp phá hại nên có thể

phòng trị bằng các loại thuốc sau: Basudin 10H, Comitee, Nokaph 20EC…

Khoảng tháng 9-10, khi trời mưa kéo dài, cây hoa huệ dễ bị úng thối lá, thối

củ thì có thể khắc phục hiện tượng này bằng Topsin, Ridomil Gold… (Đặng

Phương Trâm, 2005)

2.3 Kỹ thuật nuôi cấy in vitro trong chọn tạo giống cây trồng đột biến

Việc nhân giống cây trồng theo phương pháp truyền thống cho hệ số nhân

giống không cao Những năm gần đây, nuôi cấy thực vật in vitro là kỹ thuật nhân

giống đã được áp dụng thành công trên một số loại cây trồng nhằm cung cấp

lượng lớn cây giống sạch bệnh và đồng đều trong một thời gian ngắn (Endang,

2012; Huỳnh Thị Huế Trang và ctv., 2007; Rodrigo et al., 2012) Nuôi cấy thực

vật in vitro là kỹ thuật được dùng để nhân giống cây dưới điều kiện vô trùng, dựa

vào tính toàn thế của tế bào thực vật Các tế bào đơn, các tế bào trần, mẫu lá, rễ

hoặc củ có thể được dùng để tái sinh thành cây mới trong môi trường nuôi cấy có

chất dinh dưỡng và chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Badr and Jean, 1995;

Krishnamurthy et al., 2001) Phương pháp nhân giống truyền thống bằng củ ở

hoa huệ chậm so với nhu cầu giống ngày càng lớn và vì thế cần thiết thực hiện

nuôi cấy in vitro ở loại cây này (Jitendriya and Mohammad, 2013)

2.3.1 Các giai đoạn của nuôi cấy thực vật in vitro

Ivan et al (2010) chia nuôi cấy in vitro làm 4 giai đoạn: (1) Thiết lập sự

nuôi cấy vô trùng; (2) Nhân nhanh; (3) Hình thành tạo rễ và (4) Thuần dưỡng

Ahloowalia (2004) và Hussain et al (2012) bổ sung thêm giai đoạn 0 là giai đoạn

chuẩn bị và lựa chọn mẫu cấy từ cây mẹ Tất nhiên, mỗi giai đoạn đều có vai trò

quan trọng, ảnh hưởng đến chất lượng và khả năng thích nghi của cây cấy mô ở

điều kiện tự nhiên (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

2.3.2 Các loại mẫu cấy trong nuôi cấy in vitro ở cây hoa huệ

Ở cây hoa huệ, có nhiều loại mẫu cấy được sử dụng để nuôi cấy in vitro

như đỉnh chồi (shoot tips) (Hutchinson et al., 2004), vảy củ (bulb scale)

(Muralidhar and Mehta, 1982; Bose et al., 1987; Khan et al., 2000; Rajasekharan

et al., 2000; Nazneen et al., 2003; Mishra et al., 2006), thân rễ (rhizome)

(Sangavai and Chellapandi, 2008), mẫu lá (leaf disc) (Bindhani et al., 2004), rễ

(Narayanaswamy and Prabhudesai, 1979) và túi phấn (Gi and Tsay, 1989) Tuy

nhiên, tần số tái sinh ở tất cả nghiên cứu trên ở mức trung bình

Toma and Sorina (2008) cho rằng việc nuôi cấy hoa huệ rất dễ thực hiện

Kết quả nuôi cấy có thể khác nhau lớn ở việc thay đổi các loại mẫu cấy và môi

trường nuôi cấy Phương pháp nuôi cấy sử dụng đỉnh sinh trưởng hoa huệ nhằm

mục đích tạo cây sạch bệnh virus hoặc đạt được số lượng giống lớn đồng nhất

(Huỳnh Thị Huế Trang và ctv., 2007) Tuy nhiên, Narayanaswamy (1994) cho

rằng ở hoa huệ, phôi sinh dưỡng được tạo ra với số lượng lớn từ nuôi cấy lá bắc

(bract) và cánh hoa (petal), nhưng tránh nuôi đỉnh chồi vì phôi sẽ không phát

triển mặc dù có xuất hiện mầm rễ do đây là những phôi sinh dưỡng giả

(pseudoembryoids)

2.3.3 Kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (meristem culture)

Đỉnh sinh trưởng là một nhóm tế bào chưa phân hóa được hình thành trong

quá trình phát sinh phôi Đỉnh sinh trưởng liên tục tạo tế bào mới trải qua quá

trình phân hóa thành các mô và tạo cơ quan mới, hình thành cấu trúc cơ bản của

thân cây (Hình 2.3) Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là kỹ thuật tách một cách tỉ mỉ

một phần hình vòm của vùng sinh trưởng của đỉnh chồi từ cây mẹ và nuôi trong

môi trường dinh dưỡng Mỗi phần hình vòm tách phải hạn chế số mầm lá và

Điều kiện nuôi cấy được kiểm soát cho phép ngọn phát triển nhanh và trực tiếp

thành chồi mà không có sự hình thành cơ quan nào khác, đảm bảo sự bền vững di

truyền của cây tái sinh (Brown and Thorpe, 1995)

Ích lợi chủ yếu của nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là sạch vi sinh vật gây bệnh

(Rolf, 1991; Ivan et al., 2010), kích thước đỉnh sinh trưởng thích hợp là 0,1-1mm

được sử dụng để nuôi cấy cây sạch bệnh (Ahloowalia, 2004) Nuôi cấy đỉnh sinh

trưởng (meristem) đã được thực hiện ở khoai tây (Solanum tuberosum), tạo cây

sạch virus ở dâu, tỏi (Allium sativum), cà tím (Solanum melongena L.) và phục

tráng giống hoa huệ (Batool et al., 2014; Hossain et al., 2013; Biswas et al.,

2007; Taskin et al., 2013; Sharmin et al., 2008; Huỳnh Thị Huế Trang và ctv.,

2007)

Nhiều nhà nghiên cứu cho rằng, cây tạo ra từ đỉnh sinh trưởng sẽ ổn định

hơn những chồi tạo thành từ mô sẹo (Rout et al., 2006) Hasegawa (1980) tìm

thấy một cây có kiểu hình bất thường trong số 600 cây nhân giống từ cấy mô ở

Đỉnh sinh trưởng Mầm lá

Chồi bên

hoa hồng Martin et al (1981) thấy rằng không có biến dị giữa 2.125 cây hoa

hồng trồng ở ngoài đồng trong 3 năm Lloyd et al (1988) báo cáo rằng những

chồi tái sinh từ mô sẹo Rosa persica × xanthina có sự biến dị về hình thái lá

Trên hoa cúc, hiện tượng chồi từ nuôi cấy mô sẹo hoa (ray floret) có biến dị

nhiều hơn cây từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (Rout et al., 2006)

2.3.4 Môi trường nuôi cấy thực vật in vitro

Môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát

sinh hình thái của tế bào và mô thực vật Mô thực vật nuôi cấy trong môi trường

nhân tạo cũng cần được cung cấp các chất dinh dưỡng giống như cây được cung

cấp từ đất Tùy theo từng loài thực vật và giai đoạn phát triển của mô mà thành

phần môi trường có thể thay đổi để phù hợp Ngoài ra thành phần môi trường còn

phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy là nhân giống, lưu trữ giống hoặc theo mục tiêu

nghiên cứu Các chất cơ bản trong môi trường nuôi cấy bao gồm: muối khoáng,

vitamin, các chất điều hoà sinh trưởng thực vật và một số chất bổ sung khác

(Dương Công Kiên, 2000; Ivan et al., 2010)

2.3.4.1 Dinh dưỡng khoáng và vitamin trong nuôi cấy thực vật in vitro

Nhu cầu dinh dưỡng cho mô và tế bào in vitro tương tự với cây trong tự

nhiên Tuy nhiên, tế bào và mô bị tách ra thiếu khả năng tự tổng hợp nguồn

carbon, hầu hết các vitamin và chất điều hòa sinh trưởng Tùy vào mục đích nuôi

cấy có thể sử dụng một trong số các môi trường nuôi cấy phổ biến như White

(1963); Murashige and Skoog (1962); Gamborg et al.(1968)…

- Muối khoáng: Bao gồm khoáng đa lượng và vi lượng Khoáng đa lượng

(N, P, K, Ca) là yếu tố cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của thực vật

Khoáng vi lượng (Mn, I, Cu, Zn, B…) là yếu tố đòi hỏi trong sự tăng trưởng và

phát triển của cây và có nhiều vai trò khác nhau (Sellappan and Kannan, 2013)

- Vitamin: Vitamin thường giữ vai trò co-enzym trong các phản ứng sinh

hóa Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy in vitro là: B1

(thiamin HCl), B3 (calcium panthotenate), B6 (pyridoxine HCl), PP (acid

nicotinic), H (biotin), myo inositol (Peter and Kantharajah, 2011)

Nhiều nghiên cứu nuôi cấy cây hoa huệ in vitro đã sử dụng môi trường MS

(Krishnamurthy et al., 2001; Amah et al., 2006 ; Huỳnh Thị Huế Trang và ctv.,

2007) Chỉ có Gajbhiye et al (2011) nuôi cấy hoa huệ trên môi trường White

Kết quả nuôi cấy có thể khác nhau lớn ở việc thay đổi các loại mẫu cấy và môi

trường nuôi cấy (Krishnamurthy et al., 2001)

2.3.4.2 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong nuôi cấy thực vật

in vitro

Hiệu quả của nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy in vitro chịu ảnh

hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như môi trường dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt

độ, loài cây… Tuy nhiên, nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng trong môi

trường nuôi cấy được cho là yếu tố quan trọng nhất Nó đóng vai trò như là chất

tính hiệu trong việc điều khiển, kích thích hay ức chế các quá trình sinh trưởng

và phát triển của cây (Gomes and Canhoto, 2003; Mercier et al., 1997) Các chất

này giúp nhân nhanh số lượng cây hay rút ngắn thời gian nuôi cấy

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật còn được gọi là phytohormone, là các

chất hữu cơ có bản chất hóa học khác nhau nhưng đều có vai trò điều hòa các

hoạt động sinh lý, các quá trình sinh trưởng, sinh sản và phát triển của thực vật,

được tổng hợp với một lượng rất nhỏ trong các cơ quan khác nhau của thực vật

Các chất kích thích sinh trưởng này được sử dụng để tạo chồi, mô sẹo, nhân chồi,

nhân mô sẹo và tạo rễ (Badr and Jean, 1995; Krishnamurthy et al., 2001) Các

chất điều hòa sinh trưởng thực vật chủ yếu trong nuôi cấy thực vật in vitro là

nhóm (1) auxins; (2) cytokinins; (3) gibberellins; (4) abscisic acid và (5)

ethylene Trong các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đã được nghiên cứu,

auxin và cytokinin được xem là quan trọng hơn đối với kỹ thuật nuôi cấy in vitro

thực vật (Krishnamurthy et al., 2001; Prakash et al., 1999) Sự hiện diện của cả

auxin và cytokinin là cần thiết cho sự nhân mô sẹo và tái sinh chồi

+ Auxin: Auxin được biết đến như là yếu tố quan trọng trong sự cảm ứng ra

rễ vào những năm 1930 (Cooper, 1935) Ngoài hợp chất auxin nội sinh như IAA

thì các hợp chất tổng hợp như IBA và NAA cũng được sử dụng trong quá trình

tạo rễ Quan sát quá trình hình thành rễ ở cây đậu (Vigna radiate) từ 0 đến 24 giờ

thì nồng độ IAA tăng (Nag et al., 2001) Trong lĩnh vực nuôi cấy in vitro, auxin

chiếm vị trí rất quan trọng có tác dụng trong sự nhân lên của tế bào và hiệu quả

ra rễ Auxin có tác dụng kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo và huyền phù tế

bào đồng thời điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt khi sử dụng phối hợp với

cytokinin (Prakash et al., 1999) Tế bào thực vật tổng hợp IAA từ tryptophan,

cũng như tất cả các chất auxin khác, IAA làm tế bào kéo dài và phân chia thúc

đẩy cây sinh trưởng và phát triển nhanh (Nhut and Silva, 2002) Các mô non hơn

được biết là chứa lượng auxin cao có thể làm tăng sự hình thành mô sẹo

(Sheldrake, 1973)

+ Cytokinin: Cytokinin để thúc đẩy sự phân chia tế bào Các cytokinin tự

nhiên gồm những nhóm có liên quan đến cấu trúc (những dẫn xuất của purine)

Có hai cytokinin tự nhiên thường được sử dụng trong nuôi cấy thực vật in vitro

Zeatin thường ít được sử dụng vì đắt tiền và không bền (đặc biệt là zeatin) Các

cytokinin tổng hợp là kinetin và BAP (benzyl aminopurine) thường được sử dụng

hơn (Rolf, 1991)

Nhiều nghiên cứu trên các đối tượng cây trồng khác như khoai tây (Sanavy

and Moeini, 2003); khoai lang (Alconero et al., 1975); lúa miến (Sadia et al.,

2010); nho (Vitis rotundifolia) (Gray and Benton, 1991)… đã sử dụng kết hợp

hai nhóm chất cytokinin và auxin để tạo mô sẹo và chồi Chủ yếu là sử dụng các

chất NAA, IAA, Kinetin, BAP và BA Ở hoa huệ, cytokinin có tác dụng cho sự

hình thành chồi ở hoa huệ Tuy nhiên, sự bổ sung auxin làm tăng khả năng tái

sinh (Krishnamurthy et al., 2001).

Đặc biệt, sự sinh tổng hợp và tích lũy các chất đồng hóa thứ cấp ở cây cũng

phụ thuộc vào chất kích thích sinh trưởng ở các giai đoạn phát triển khác nhau

Vì thế, những chất điều hòa sinh trưởng thực vật có liên quan đặc biệt như IAA,

kinetin và BAP ở môi trường MS có thể hỗ trợ sự tổng hợp các hợp chất cần

thiết, đặc biệt là các hợp chất liên quan đến sản xuất nước hoa và mùi thơm ở hoa

huệ (Jitendriya and Mohammad, 2013)

2.3.4.3 Các chất bổ sung khác trong nuôi cấy thực vật in vitro

Các hợp chất carbon (đường), than hoạt tính, tác nhân hóa đông (agar,

gelatin và các chất hữu cơ khác như nước dừa, casein hydrolysate, dịch chiết

nấm men, mạch nha, chuối, khoai tây, nước cà chua và nước cam cũng được bổ

sung vào môi trường nuôi cấy (Nguyễn Bảo Toàn, 2010; Molnár et al., 2011)

Những phức chất từ tảo (algal) như ở vi tảo (microalgae) và vi khuẩn lam

(cyanobacteria) có thể ảnh hưởng đến sự tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng thực

vật đã được nghiên cứu ở cây đậu (Pisum sativum L.), thuốc lá (Nicotiana

tabacum L.) và củ cải đường (Beta vulgaris L.) (Molnár et al., 2011)

2.3.5 Sự hình thành mô sẹo và chồi (cụm chồi) trong nuôi cấy thực vật

in vitro

Ahloowalia (2004) cho rằng có hai con đường hình thành cây hoàn chỉnh

trong nuôi cấy thực vật in vitro là (i) sự tái sinh cây và cơ quan (không tạo mô

sẹo) và (ii) tạo phôi soma bằng cách thông qua giai đoạn nuôi cấy mô sẹo, từ đây

tạo phôi, rồi tạo cây hoàn chỉnh Trong đó, cytokinin đóng vai trò then chốt để

tạo phôi, phân hóa chồi và nhân nhanh còn auxin tổng hợp được sử dụng cho sự

tạo mô sẹo và phôi

2.3.5.1 Sự hình thành mô sẹo trong nuôi cấy in vitro

Trong đặc tính sinh lý của cơ thể thực vật, khi bị những tổn thương về mặt

vật lý (những vết cắt trên cơ thể, những tổn thương do côn trùng tấn công) thực

vật có khả năng hình thành những tế bào mới để hàn kín những chỗ tổn thương

đó Những tế bào mới được hình thành đó là tế bào mô sẹo (Nguyễn Văn Minh,

1998) Mô sẹo còn là một khối tế bào nhu mô phát triển vô tổ chức, hiện diện

trong các giai đoạn hoá lignin khác nhau của thực vật, thường do các tế bào trong

vùng tượng tầng (vùng phân sinh) như tượng tầng liber-gỗ, tượng tầng vỏ ở gốc

của đoạn cắt tạo thành (Kenneth, 1957; Dương Công Kiên, 2000) Những tế bào

mô sẹo thường có hình cầu, màu trắng hoặc nâu nhạt Khối mô sẹo có khả năng

tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích

thích sinh trưởng tạo mô sẹo (Dương Công Kiên, 2000) Mô sẹo thường được

tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan, nhất là trong sự tạo rễ Do

đó, cây non hay những mảnh thân non của cây trưởng thành dễ tạo mô sẹo

Ngược lại, những cơ quan trưởng thành không có khả năng tạo mô sẹo Sự tạo

mô sẹo ở thực vật xảy ra khi môi trường nuôi cấy được bổ sung một lượng auxin

thích hợp (Kenneth, 1957) Sự tạo mô sẹo do tác dụng của auxin do 3 quá trình:

(1) Sự phản phân hoá của tế bào nhu mô: xảy ra ở các tế bào nhu mô mộc và libe,

nhu mô vỏ hay lõi; (2) sự phân chia của các tế bào tượng tầng: các tế bào tượng

tầng của phần lớn cây hai lá mầm dễ dàng phân chia dưới tác động của auxin; (3)

sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ) (Dương Công Kiên,

2000) Đồng thời, các biến động ở các mức độ chất điều hòa sinh trưởng nội sinh

cũng ảnh hưởng sự tạo mô sẹo (Sheldrake, 1973)

Mô sẹo được tạo thành dưới tác dụng của các chất điều hòa sinh trưởng

thực vật khác nhau với nồng độ khác nhau Auxin và cytokinin thúc đẩy sự tạo

thành cơ quan ở mô sẹo (Andreea et al., 2008) Heszky et al (1991) cũng cho

thấy ảnh hưởng của sự kết hợp nồng độ tối hảo của auxin và cytokinin thể hiện ở

kiểu hình Ở nuôi cấy mô sẹo, sự tái sinh thành công phụ thuộc vào loại môi

trường sử dụng ở mỗi giai đoạn nuôi cấy như sự tạo mô sẹo, duy trì và tái sinh

Cây con tái sinh từ mô sẹo chịu ảnh hưởng bởi kiểu gen và các loại môi trường

(Andreea et al., 2008) Những mô của thực vật có thể dùng nuôi cấy tạo mô sẹo

là: tượng tầng libe mộc, tượng tầng vỏ, phôi nhũ, tế bào diệp nhục, lá, trụ bì rễ, tử

diệp… Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ Từ một cụm tế bào

mô sẹo có thể tái sinh cho cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh

trưởng (Nguyễn Văn Uyển, 1993)

2.3.5.2 Sự hình thành chồi trong nuôi cấy in vitro

Cytokinin có vai trò trong sự tạo cơ quan thực vật, chúng kích thích mạnh

mẽ sự tạo thành các chồi non, trái lại chúng là chất đối kháng của sự tái sinh rễ

Cytokinin còn định hướng tế bào trong sự phân hóa và điều hòa sự sinh trưởng

của cây gồm sự phân chia tế bào và làm già hóa lá (Padhye et al., 2008)

Cytokinin có khả năng hạn chế sự ảnh hưởng của ưu thế ngọn lên chồi bên và

kích thích tạo cành từ chồi bên (Devi et al., 1994)

Skoog and Miller (1957) cho rằng sự tái sinh chồi phụ thuộc vào sự tương

tác liều lượng giữa các chất điều hòa sinh trưởng thực vật các auxin và cytokinin

Hai loại auxin như NAA và IAA được sử dụng kết hợp với Kin và BAP để tăng

hiệu quả cho sự nhân chồi Sự nhân chồi tối đa nhờ vào nồng độ chất điều hòa

sinh trưởng thích hợp Điều này tương đồng với giả thuyết sự cân bằng chất điều

hòa sinh trưởng cũng như nồng độ của chúng có tính quyết định hướng kiểu hình

(Sharief and Jagadishchandra, 1999) Nhìn chung, sự kết hợp của cytokinin và

auxin thì cần thiết cho nhân chồi in vitro (Thorpe and Patel, 1984)

2.4 Phương pháp xử lý đột biến bằng kỹ thuật chiếu xạ trong chọn tạo

giống cây trồng

2.4.1 Sơ lược về đột biến bằng kỹ thuật chiếu xạ

Trong điều kiện tự nhiên, tần số đột biến xuất hiện rất thấp và thay đổi tùy

thuộc vào loại cây trồng và từng gen chuyên biệt (Kurata et al., 2005) Tần số đột

biến tự nhiên đã rất thấp và đột biến có lợi cho sản xuất thì còn thấp hơn rất

nhiều lần Do đó, không thể chọn lọc giống dựa vào đột biến tự nhiên mà cần có

biện pháp làm tăng tần số đột biến để tạo nguồn vật liệu cho chọn giống Vì vậy,

việc chọn giống đột biến nhân tạo ngày càng được quan tâm Tuy có nhiều hạn

chế nhưng chọn giống đột biến đã và đang đóng góp vào thành công của chọn

giống Đến cuối thế kỷ 20, có hơn 2.200 giống cây trồng được tạo ra bằng

phương pháp đột biến (Maluszynski et al., 2000) De Vries (1905) đã đề nghị

dùng bức xạ để tạo thể đột biến Sau đó, tác nhân gây đột biến ngày càng được

ứng dụng nhiều hơn Tuy có nhiều tác nhân gây đột biến nhưng số lượng giống

đột biến được tạo bằng tác nhân vật lý chiếm đến 87% (Chu Thị Thơm và ctv.,

2006) Theo thống kê trong tất cả các giống chọn từ đột biến thì tia gamma (chủ

2.4.2 Đặc điểm của tia phóng xạ gamma

Tia gamma (γ) thuộc nhóm phóng xạ điện từ, có khả năng ion hoá thấp nhất

và đường đi của nó từ hàng chục cm đến hàng mét gây ra nhiều đột biến điểm

hơn Tuy nhiên việc dự đoán và kiểm soát phổ đột biến tương đối khó, đặc biệt tỷ

lệ giữa đột biến gen và biến đổi nhiễm sắc thể (Hoàng Trọng Phán và Trương Thị

Bích Phượng, 2008)

Trong các giống được tạo ra bằng phương pháp đột biến thì có phần lớn

được tạo ra bằng chiếu xạ tia gamma (Lê Ngọc Quý, 1990) Khi tia bức xạ đi qua

tế bào, sẽ tạo nên hiện tượng ion hóa trong tế bào Các electron bị tách khỏi phân

tử và ở trạng thái kích thích (trạng thái năng lượng cao) sẽ làm biến đổi ADN

(Breen and Murphy, 1995) Bên cạnh đó, tia gamma có thể tương tác với các

nguyên tử hoặc phân tử để tạo nên các gốc tự do trong tế bào và làm thay đổi cấu

trúc của tế bào Các gốc tự do này ảnh hưởng đến quá trình sinh lý, sinh hóa hay

kiểu hình của cây, điều này phụ thuộc vào liều chiếu xạ (Moghaddam et al.,

2011)

2.4.2.2 Hiệu quả của tia gamma trong chọn giống cây trồng

đã trở thành phương pháp chính dùng để gây đột biến trong cải tiến giống cây

trồng (Hoàng Trọng Phán và Trương Thị Bích Phượng, 2008) Khan et al (2000)

áp dụng tia gamma lên mô sẹo cây mía tạo hiệu quả lên một số chỉ tiêu như năng

suất và hàm lượng đường, chiều cao cây, màu xanh lá và chồi rễ Thêm vào đó,

có nhiều nghiên cứu chọn giống về ứng dụng chiếu xạ lên cây hoa kiểng như hoa

hồng, hoa cúc, hoa violet Châu Phi (Yamaguchi et al., 2003; Matsumara et al.,

2010; Salleh et al., 2012; Zhou et al., 2006) Việc xử lý tia gamma đã tạo nên các

giống lúa cho năng suất cao, một số giống khác thì có thời gian sinh trưởng ngắn

hơn và chiều cao cây cũng thấp hơn (Chakrabarti, 1995) Ngoài các tính trạng số

lượng thì các tính trạng về chất lượng cũng được cải tiến nhờ vào phương pháp

đột biến (Jiang et al., 2003)

2.4.2.3 Liều chiếu xạ

Một trong những yêu cầu cơ bản nhất để tạo giống đột biến thành công là

chọn liều lượng xử lý thích hợp Đối với mục đích chọn giống, mục tiêu đạt được

là có một số lượng đột biến mong muốn đối với một tính trạng quan tâm mà ít

gây phá vỡ tính toàn vẹn của bộ gen cây trồng nhất (Mba, 2013)

Thông thường, đơn vị bức xạ được tính bằng Gray (theo hệ thống quốc tế

SI), 1 Gray (Gy) = 100 rad (Vũ Đình Hòa và ctv., 2005)

Ngoài ra, liều lượng hấp thụ là năng lượng phát ra của bức xạ từ nguồn sang

đối tượng và được đối tượng hấp thụ (Gy/giây hoặc kGy/giờ)

Liều chiếu xạ được sử dụng để gây đột biến phụ thuộc vào độ mẫn cảm của

loài, cũng như cấu trúc của cây Ngoài ra, Sparow et al (1968) còn cho rằng tính

mẫn cảm của cây đối với liều chiếu xạ còn phụ thuộc vào cấu trúc nhân tế bào

như thể tích nhân, số lượng nhiễm sắc thể và mức độ bội thể Cây chuối tứ bội có

tính mẫn cảm thấp hơn cây tam bội và nhị bội (Novak et al., 1990)

Tỷ lệ chết sẽ tăng cao cùng với việc tăng liều chiếu xạ Tuy nhiên, một số

kết quả nghiên cứu cũng cho thấy rằng khả năng sinh trưởng của mẫu cây in vitro

tăng lên khi đƣợc chiếu xạ ở liều thấp (Yang and Schmidt, 1994; Ancora and

Sonnino, 1995) Khi tỷ lệ mẫu chiếu xạ chết đến 50% tổng số mẫu thì liều chiếu

Khi tỷ lệ mẫu chiếu xạ chết đến 50% tổng mẫu vật liệu chiếu xạ gọi là

khác dao động quanh liều chiếu xạ tối hảo để tăng khả năng chọn giống đột biến

trọng trong việc chọn tạo giống đột biến Tuy nhiên, mức độ mẫn cảm cũng đƣợc

đo bằng % tỷ lệ mẫu chiếu xạ còn sống và sự phát triển của mẫu (Hegde, 2006)

Sự giảm tỷ lệ nảy mầm, chiều cao cây con, tỷ lệ sống, số chồi, dạng hạt và kiểm

tra khả năng sinh sản ở thế hệ thứ 2 cũng nhƣ đột biến diệp lục tố là những thông

số đƣợc tính toán trong kiểm tra mức độ mẫn cảm khi xác định liều tối hảo (Mba,

2013) Bảng 2.1 cho thấy một số nghiên cứu về liều gây chết LD50 khi xử lý

chiếu xạ ở một số loại cây trồng

loại cây trồng

2.4.2.5 Tần số đột biến in vitro

Có thể định nghĩa tần số đột biến đƣợc tính bằng số lƣợng đột biến ở một

liều chiếu xạ trên quần thể của tế bào, sinh vật, giao tử, cây hoặc bộ phận cây ở

số lƣợng quần thể xử lý đột biến (Van Harten, 1998) hoặc tần số đột biến có thể

tính bằng phần trăm cá thể đột biến từ vật liệu đƣợc chiếu xạ (M0), cây con sống

ở thế hệ đột biến đầu tiên (M1) hoặc những cây đột biến ở thế hệ đột biến thứ 2

(M2) (Ojiewo et al., 2007) Trong khi đó, Suzuki et al (1989) định nghĩa tần số

đột biến là tần số mà ở đó có các dạng đột biến xuất hiện trong quần thể tế bào

hoặc cá thể Định nghĩa này gồm cả đột dạng đột biến có lợi và bất lợi

Lê Duy Thành (2000) cho rằng tần số xuất hiện đột biến khi sử dụng các tia

phóng xạ cao hơn trong tự nhiên khoảng 1.000 lần Tần số đột biến tăng khi tăng

liều chiếu xạ nhƣ ở cây lê từ nuôi cấy phôi và táo (Lapins et al., 1969; Zagaja et

al., 1982) Datta et al (2005) tiến hành trên cây hoa cúc cho tần số đột biến là

10-20% ở liều chiếu 5-10 Gy Mohanty and Panda (1988) cho rằng tần số đột