Mục đích nghiên cứu của luận án nhằm xây dựng được quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans trong dịch não tủy. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm được tạo ra trong chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans trong dịch não tủy.
Trang 2Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương
Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS Cao Trường Sinh PGS.TS Nguyễn Thị Hương Bình
Vào hồi giờ ngày tháng năm 2019
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia
- Thư viện Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng-Trung ương
Trang 31 Tran Thi Quynh Lien, Cao Truong Sinh, Nguyen Thi Huong Binh, Do Ngoc Anh (2018), “Establish and optimization nested PCR reaction
determine Cryptococcus neoformans in cerebrospinal fluid'', Tạp chí Phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng, số 6/2018
2 Tran Thi Quynh Lien, Cao Truong sinh, Nguyen Thi Huong Binh, Nguyen Khac Luc (2018), “Evaluation sensitivity, specificity and stable
of nested-PCR kit detect cryptococcus neoformans in cerebrospinal fluid” Tạp chí Phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng, số
6/2018
3 Trần Thị Quỳnh Liên, Cao Trường Sinh, Nguyễn Thị Hương Bình,
Trần Thanh Dương (2019), "Đánh giá khả năng chẩn đoán Cryptococcus neoformans trong dịch não tủy của bộ sinh phẩm nested-PCR với kỹ thuật nuôi cấy, soi tươi và bộ sinh phẩm pcr chẩn đoán của norgen'' Tạp chí Phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng, số 61/20194.
Trang 4ĐẶT VẤN ĐỀ
Viêm não, màng não là tình trạng nhiễm trùng thần kinh trung ương gây
ra bởi các căn nguyên khác nhau như vi khuẩn, virus, vi nấm hoặc ký sinh trùng Trong một số trường hợp biểu hiện lâm sàng của viêm não, màng não do các căn nguyên khác nhau khá giống nhau nên dựa vào lâm sàng khó phân biệt Do vậy, để xác định căn nguyên gây viêm não, màng não cần phải dựa vào các xét nghiệm cận lâm sàng
Trong số các loài vi nấm gây viêm não màng não, nấm Cryptococcus neoformans được xác định là loài gây viêm màng não phổ biến nhất, đặc biệt
là ở bệnh nhân HIV/AIDS, ung thư, bệnh nhân suy kiệt
Trên lâm sàng, biểu hiện viêm màng não do nấm C neoformans rất giống
với các căn nguyên vi sinh vật khác Ngoài ra, cũng giống như các vi
nấm gây bệnh khác, viêm màng não do C neoformans thường được nghĩ
tới sau các căn nguyên khác nên thường chẩn đoán muộn, khi các triệu
chứng đã trở nên trầm trọng Trong khi, viêm màng não do nấm C neoformans là một bệnh nguy hiểm, tiến triển nhanh, nếu không được
chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời có thể để lại di chứng trầm trọng có khi tử vong nhanh
Trong các kỹ thuật chẩn đoán dựa trên phản ứng PCR, nested – PCR là một trong những kỹ thuật có độ nhạy, độ đặc hiệu cao nhất, không sử dụng trang thiết bị đắt tiền như real-time PCR do đó chúng tôi lựa chọn
tiến hành đề tài "Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ
sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans trong
dịch não tủy"
Với 02 mục tiêu:
1 Xây dựng được quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR
chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans trong dịch não tủy
2 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm được
tạo ra trong chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans trong dịch não tủy
Trang 5NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI VỀ MẶT KHOA HỌC
VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN
1 Ý nghĩa khoa học của luận án
Đề tài đã áp dụng các phương pháp nghiên cứu có tính khoa học chuẩn mực hiện đang áp dụng rộng rãi tại Việt Nam và Thế giới như: Hoàn
thiện được quy trình chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR định loài nấm C neoformans trong dịch não tủy của người Việt Nam;Trên cơ sở áp dụng
tổng hợp các phương pháp nghiên cứu truyền thống và hiện đại, phù hợp, bố trí thí nghiệm, tính toán thống kê một cách khoa học nên các kết quả của để tài có giá trị và độ tin cậy cao Đây là nghiên cứu đầu tiên
nghiên cứu xây dựng bộ sinh phẩm chẩn đoán nấm C neoformans trên
dịch não tủy bằng phương pháp nested-PCR ở Việt Nam Nghiên cứu đã xây dựng được quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR dựa trên sự kết hợp mới giữa 2 bộ mồi ITS1, ITS4 và CN4, CN5
2 Ý nghĩa thực tiễn của luận án
Kết quả của đề tài đã bước đầu khẳng định việc các cơ sở nghiên cứu khoa học của Việt Nam có thể sản xuất được các bộ sinh phẩm chẩn đoán có độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện tương đương với các nghiên cứu tương tự trên thế giới
Bộ sinh phẩm đã được đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu tính ổn định tại phòng thí nghiệm và tại thực địa hẹp (02 bệnh viện) đảm bảo tính chính xác và khả năng áp dụng trên diện rộng hơn của bộ sinh phẩm Là cơ
sở để tiếp tục triển khai, sản xuất, ứng dụng bộ sinh phẩm trong chẩn
đoán nhiễm nấm C neoformans tại các đơn vị xét nghiệm chẩn đoán lâm
sàng, cung cấp kết quả xét nghiệm nhanh, chính xác từ đó đề xuất phương án điều trị sớm, hiệu quả phù hợp Qua đề tài này, các cán bộ nghiên cứu có thể tiếp tục mở rộng xây dựng các bộ sinh phẩm chẩn đoán với các đối tượng nghiên cứu khác dựa trên kỹ thuật sinh học phân
tử
Trang 6CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN
Luận án có 134 trang (không kể phụ lục) bao gồm các phần: Đặt vấn đề (2 trang); chương 1: Tổng quan tài liệu (34 trang); chương 2: Đối tượng
và phương pháp nghiên cứu (31 trang); chương 3: Kết quả nghiên cứu (41 trang); chương 4: Bàn luận (24 trang); Kết luận (2 trang); các công trình đã công bố của tác giả có liên quan đến nội dung luận án (1 trang); những đóng góp mới của luận án (1 trang); tài liệu tham khảo 113 (13 trang, gồm 10 tài liệu tiếng việt, 103 tài liệu tiếng Anh) và phụ lục (35 trang) Luận án được trình bày với 39 bảng, 17 hình
Trang 7Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Đặc điểm sinh học và vai trò y học của nấm C neoformans
Giống nấm Cryptococcus có khoảng hơn 70 loài được định loại dựa vào hình thái nhưng loài gây bệnh chủ yếu là C neoformans chiếm 80% [18],[19] Bệnh do nấm C neoformans gây ra gọi là
Cryptococcosis Triệu chứng bệnh được Zenker miêu tả đầu tiên năm
1861, nhưng đến năm 1864, hai nhà bác học Busse và Buschkle người
Đức đã phân lập và nuôi cấy được nấm C neoformans từ bệnh nhân có
triệu chứng giống như đã được Zenker miêu tả [18],[20],[21] Ngoài
C.neoformans, loài C albidus và C laurentii cũng có khả năng gây bệnh
nhưng ít gặp [19]
1.1.1 Đặc điểm sinh học của nấm C neoformans
1.1.1.1 Đặc điểm hình thể
C neoformans là nấm men, đường kính tế bào khoảng 5-10 µm, được
bao ngoài bởi một nang (capsule) hình cầu hoặc hình bầu dục, kích thước nang thay đổi từ 2-40µm
1.1.1.2 Môi trường sống
C neoformans là sinh vật sống hoại sinh, ngoài cơ thể vật chủ, có thể
sống tự do bên ngoài môi trường Nấm phân bố toàn cầu có thể tìm thấy trong chất thải của gia cầm, chim bồ câu, vẹt, yến Trong các hang động, nước trái cây lên men, sữa, đường ruột của một số động vật ăn cỏ, trên
cơ thể dơi, gián, trong đất và các hốc cây khác nhau Nấm còn được tìm thấy trong thân gỗ mục của một số loài cây như: cây bạch đàn, cây cao
su màu đỏ [18], [24], [26]
1.1.1.3 Tính chất nuôi cấy
Nấm C neoformans có thể mọc trên thạch Sabouraud dextrose, thạch máu
cừu, thạch chocolate và các môi trường khác ở nhiệt độ từ 20-370C, nấm bắt đầu mọc trong vòng khoảng 72 giờ, nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm phát triển là 300C [27] C neoformans triển tốt trong môi trường chứa khoảng 5
% CO2, pH hơi kiềm và một lượng nhỏ chất sắt [28]
Trang 8Trên môi trường thạch Sabouraud dextrose ở 25-370C, nấm C neoformans
mọc thành các khuẩn lạc lồi, mịn, nhày, màu trắng hoặc màu kem, đường kính có thể đến vài milimet [28]
1.1.2 Vai trò y học
Do tế bào nấm C neoformans có thể có mặt trong không khí, trong đất và trong phân gia cầm nên người rất dễ bi ̣ nhiễm loa ̣i nấm này khi hít vào qua đường hô hấp Tuy nhiên, không phải cơ thể nào bi ̣ nhiễm cũng biểu hiê ̣n thành bê ̣nh mà bê ̣nh thường biểu hiê ̣n ở những cơ thể có hê ̣ thống miễn di ̣ch bi ̣ tổn thương như bệnh nhân AIDS, phải dùng
các thuốc ức chế miễn dịch, ung thư, ghép tạng, ghép tủy xương Mức
độ nặng của các triệu chứng lâm sàng phụ thuộc vào tình trạng suy giảm miễn dịch của cơ thể ngườ i nhiễm [3], [18], [22], [30]
Nấm thường gây bệnh ở não màng não do nấm có đặc tính ưa tổ chức thần kinh Ngoài ra nấm có thể gây bệnh ở các cơ quan bộ phận khác như phổi, da, hệ tiết niệu…
1.1.3 Tình hình viêm màng não do nấm C neoformans ở trên thế
giới và Việt Nam
1.1.3.1 Viêm màng não do nấm C neoformans ở trên thế giới
Từ cuối những năm 1970 đến đầu những năm 1980, sự gia tăng mạnh các
trường hợp nhiễm nấm C neoformans tại Kinshasa và ở những người
Zairian nhập cư tại Châu Âu
Hiện nay, viêm màng não do nấm C neoformans trên bệnh nhân
HIV/AIDS vẫn còn là vấn đề ở các nước phương Tây Tại Nam và Trung châu Phi nhất là vùng sa mạc cận Sahara [11], [20], [36], ngoài việc là nguyên nhân hàng đầu gây viêm màng não, nó còn 13-44% tổng
số ca tử vong liên quan đến AIDS
Theo kết quả một loạt các nghiên cứu của Park và cs (2009) thấy tỉ
lệ mắc thay đổi từ 0,04-12% mỗi năm trên các bệnh nhân HIV/AIDS Một số vùng như Đông Âu, Trung Á, Bắc Phi và Trung Đông có tỉ lệ tương tự nhau (1,7% mỗi năm) Vùng biển Caribbean và Mỹ Latin có tỉ
Trang 9lệ khoảng 3,4% mỗi năm Trên toàn cầu hàng năm có khoảng 957.900 trường hợp nhiễm bệnh [20]
Ước tính rằng có khoảng 624.725 ca (từ 124.956-1.124.494) tử
vong bởi viêm màng não do nấm C neoformans [20] Châu Đại Dương
ít nhất (9 ca tử vong) trong khi khu vực châu Phi cận Sahara nhiều nhất (504.000 ca (từ 100.800 - 907.200)) [20]
Rajasingham và cs, (2017) mặc dù đã được điều trị bằng thuốc chống nấm, nhưng năm 2007 ước tính có đến 223.100 trường hợp viêm màng não do cryptococcus và 181.100 ca tử vong do bệnh này trên toàn thế giới [38], [39]
1.1.3.2 Viêm màng não do nấm C neoformans ở Việt Nam
Ở Việt Nam, chưa có con số thống kê rõ ràng về tình hình viêm
màng não do nấm C neformans của bệnh nhân AIDS trên cả nước Năm 1928, tại BV Bệnh Nhiệt Đới có 1 ca nhiễm C neoformans đầu
tiên được báo cáo với biểu hiện viêm màng não;
Trong một nghiên cứu của Trần Phủ Mạnh Siêu và cs, (2006) về tình hình nhiễm vi nấm nội tạng trên bệnh nhân HIV/AIDS tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Thành phố - Hồ Chí Minh từ năm 2003-2005 đã cho
thấy C neoformans là căn nguyên phổ biến (chiếm trên 90% nhiễm
trùng thần kinh ở bệnh nhân HIV/AIDS) [41]
Thực tế tình hình nhiễm nấm nội tạng ở bệnh nhân HIV/AIDS tại Bệnh viện Nhiệt đới Tp HCM từ 11/2008 đến 6/2009 có 98 trường hợp viêm
não, màng não do C neoformans [41]
1.2 Các phương pháp chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans
1.2.1 Soi phát hiện nang nấm dưới kính hiển vi
Phát hiện nang polysaccharide của nấm Cryptococcus trong mẫu xét
nghiệm khi quan sát dưới kính hiển vi thấy C neoformans là những tế
bào nấm men, hình cầu hoặc hình bầu dục, bao quanh là một lớp vỏ dày
1.2.2 Nuôi cấy phát hiện nấm trên môi trường chọn lọc
Trang 10Nuôi cấy được coi là một phương pháp quan trọng để chẩn đoán viêm màng não do Cryptococcus, nhưng có một số nhược điểm như: Đòi hỏi
cơ sở hạ tầng phòng thí nghiệm, điện, và kỹ thuật viên được đào tạo bài bản [13] Nuôi cấy cần ít nhất 2 ngày để nấm phát triển và đến 10 ngày
để có được số liệu đáng tin cậy Các phương pháp nuôi cấy cũng có thể tạo ra kết quả âm tính giả khi mật độ nấm thấp Sử dụng 100 μL dịch não tủy không pha loãng so với 10 μl pha loãng ở tỷ lệ 1:10 đã làm tăng độ nhạy từ 82,4% đến 94,2%, với mức tối thiểu đơn vị khuẩn lạc CFU cần thiết cho sự tăng trưởng giảm từ 100 xuống còn 10 CFU/ml [43]
1.2.2 Chẩn đoán miễn dịch học phát hiện kháng nguyên
Độ nhạy của phương pháp này là cao nhất khi xét nghiệm trên mẫu dịch não tủy, đặc biệt là mẫu dịch não tủy của các bệnh nhân nhiễm
HIV Hầu hết các bệnh nhân HIV có nhiễm C neoformans đều có
phản ứng dương tính khi xét nghiệm miễn dịch bằng dịch não tủy [43] Tuy nhiên tỷ lệ này chỉ đạt 60% ở các bệnh nhân nhiễm nẫm không có HIV
Những phương pháp xét nghiệm miễn dịch học thông thường có: Thử nghiệm đông kết latex (Latex agglutination assay - LAT); thử nghiệm miễn dịch enzym (enzym immunoassay – IEA), thử nghiệm miễn dịch dòng chảy (Lateral Flow Assay - LFA)
1.2.3 Chẩn đoán bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Sinh học phân tử là một trong những công cụ chẩn đoán bệnh với độ nhạy, độ đặc hiệu cao và thời gian chẩn đoán nhanh Các kỹ thuật này có tính đặc hiệu cao do việc thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho từng đối tượng nghiên cứu và có độ nhạy cao vì chỉ cần một lượng rất nhỏ (vài picrogam) ADN cũng có thể cho kết quả chẩn đoán Có nhiểu phương
pháp sinh học phân tử có thể áp dụng để chẩn đoán nấm C neoformans
Mitchell và cs (1994) là những người đầu tiên sử dụng kỹ thuật PCR để
định loại nấm C neoformans [46] Prariayachatigul và cs (1996) dùng PCR
để định loại nấm này dựa trên trình tự gen đích 18S [47]
Trang 11SH Mirhendi và cs (2001) áp dụng kỹ thuật RFLP-PCR xác định, phân
biệt một số nấm men Candida spp., nấm Aspergillus và nấm C.neoformans gây bệnh ở người Leal AL và cs, (2008) đã ứng dụng kỹ thuật multiplex-PCR để xác định và phân biệt 2 loài C neoformans và
C gattii Veron và cs, (2009); Satoh và cs, (2011) đã phát triển kỹ thuật
PCR thời gian thực TaqMan để chẩn đoán cryptococcosis có độ nhạy và
độ đặc hiệu cao Trong số các kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR thì nested-PCR được sử dụng nhiều nhất để phân biệt C.neoformans và C gattii Theo Shahindokht (2006) và Paola (1998) ngưỡng phát hiện nấm C.neoformans trong dịch não tủy là trên 102 tế bào nấm/ml [52], [54]
1.3 Nghiên cứu xây dựng và chuẩn hóa các bộ sinh phẩm PCR chẩn đoán tác nhân gây bệnh
Nguyên lý chung khi phát triển các bộ sinh phẩm PCR để chẩn đoán tác nhân gây bệnh mong muốn cụ thể như sau [72]:
- Thiết kế mồi để xác định tác nhân gây bệnh mong muốn;
- Xây dựng quy trình tiến hành phản ứng PCR (nhiệt độ bám mồi, thời gian của mỗi giai đoạn trong chu kỳ tiến hành phản ứng, nồng độ của các loại hóa chất trong cùng một hỗn hợp phản ứng: dNTPs, Taq polymerase, MgCl2, đệm phản ứng);
- Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện của phản ứng PCR;
- Tạo chuẩn dương cho bộ kit;
- So sánh độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện của kỹ thuật và bộ sinh phẩm với các phương pháp đã đang được sử dụng với bộ kit chuẩn đã được thương mại hóa trên thị trường;
- Đóng gói bộ sinh phẩm với thành phần và số lượng phù hợp Thông thường đóng gói bộ sinh phẩm cho 25, 50 hoặc 100 phản ứng
1.4 Nghiên cứu đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ sinh phẩm PCR chẩn đoán tác nhân gây bệnh
Để đánh giá một phương pháp xét nghiệm cũng như một bộ sinh phẩm trước khi áp dụng vào chẩn đoán lâm sàng thì các chỉ số về độ nhạy, độ
Trang 12đặc hiệu, ngưỡng phát hiện và tính ổn định của xét nghiệm và bộ sinh phẩm được coi là các chỉ số tiên phong, bắt buộc phải có
- Độ nhạy (Se - sensitivity) [79], [80]: Là tỷ lệ người mang bệnh có kết quả xét nghiệm dương tính
- Độ đặc hiệu (Sp - specificity) [77], [81]: Là tỷ lệ người không mang
bệnh có kết quả xét nghiệm âm tính
Để xác định Se, Sp người ta so sánh kết quả chẩn đoán của phương pháp cần xác định với phương pháp chuẩn (được gọi là chuẩn vàng, gold standard) [77]
Hetal và cs, (2011) đã xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp nhuộm mực tàu là 83,3% và 96,49% Trong khi đó các giá trị này ở phương pháp Latex là 100% và 94,7% so với phương pháp chuẩn vàng
là phương pháp nuôi cấy [84]
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu
- 01 chủng nấm C neoformans chuẩn mã số ATCC® 90113
- 51 chủng nấm C neoformans được phân lập từ dịch não tủy ở Bệnh viện
Quân y 103, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương, Bệnh viện Chợ rẫy
và Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch
- 30 mẫu DNT của bệnh nhân có biểu hiện VMN nhưng không nhiễm
nấm C neoformans
- 120 mẫu dịch não tủy của bệnh nhân có triệu chứng lâm VMN thu thập
ở Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch
2.2 Địa điểm nghiên cứu
Bệnh viện Quân y 103, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện Chợ
Rẫy, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương
2.3 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 3/2014 đến tháng 10/2017
2.4 Nội dung nghiên cứu
Trang 132.4.1 Xây dựng quy trình chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn
đoán nấm C neoformans
- Xây dựng quy trình kỹ thuật nested-PCR xác định nấm C neoformans
- Xây dựng bộ sinh phẩm nested-PCR xác định C neoformans
2.4.2 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ sinh phẩm
- Chuẩn bị mẫu để đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu
- Thực hiện kỹ thuật nested – PCR để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, độ tương đồng với các xét nghiệm khác, độ ổn định của bộ sinh phẩm
2.5 Phương pháp nghiên cứu: NC thực nghiệm phòng thí nghiệm
Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu:Thu thập dịch não tủy, nuôi
cấy, soi tươi nhuộm mực tàu, tách chiết AND, tạo panel, kỹ thuật PCR,
kỹ thuật điện di…
2.6 Phân tích và xử lý số liệu: phần mềm Blast và ClustalX, BioEdit,
nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans
3.1.2.1 Kết quả lựa chọn trình tự cặp mồi cho phản ứng nested PCR
Cặp mồi cho phản ứng PCR1 theo Mitchell TG và CS, 1994; SH Mirhendi và CS, 2001:
- ITS1 F: 5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’
- ITS4 R:5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’
Khuếch đại đoạn gen có kích thước 555-556 bp đặc trưng cho nấm C neoformans
Cặp mồi cho phản ứng PCR 2 theo Guizhen Luo và CS, 2002:
- CN4 F: 3’-ATC ACC TTC CCA CTA ACA CAT T-5’
- CN5 R: 3’-GAA GGG CAT GCC TGT TTG AGA G-5’