Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu đặc điểm sinh học và kỹ thuật nhân giống phục vụ bảo tồn hai loài lan Nghệ tâm (Dendrobium loddigesii Rolfe), Hạc vỹ (Dendrobium aphyllum (Rox

Mục đích nghiên cứu của luận án nhằm nghiên cứu đánh giá các đặc điểm sinh học cơ bản và biện pháp kỹ thuật nhân giống in vitro phục vụ công tác bảo tồn và phát triển hai loài lan quý Nghệ tâm và Hạc vỹ, từng bước góp phần vào sản xuất cây dược liệu, cây cảnh có giá trị của Việt Nam.

(Dendrobium loddigesii Rolfe), HẠC VỸ (Dendrobium aphyllum

(Roxb.) Fisher) CỦA VIỆT NAM

Chuyên ngành: Khoa học cây trồng

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học:

1 GS.TS Vũ Mạnh Hải

2 TS Phạm Hương Sơn

HÀ NỘI - 2019

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Người hướng dẫn khoa học:

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại

Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ phút, ngày tháng năm

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

1 Thư viện Quốc gia Việt Nam

2 Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

3 Thư viện………

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Nghệ tâm (Dendrobium loddigesii Rolfe) và Hạc vỹ (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher) thuộc chi Hoàng thảo (Dendrobium) là hai loài lan

rừng đẹp, có giá trị y học và giá trị thương mại cao Theo y học cổ truyền Trung Quốc, Nghệ tâm có tác dụng ngăn ngừa tế bào ung thư dạ dày, ung

thư phổi, chất chống đông máu (Tsai et al., 2010); ung thư tuyến giáp, ung

thư tuyến tiền liệt, ung thư thực quản, ung thư tuyến tụy, có tác dụng điều trị

bệnh tiểu đường (Veronika Cakova et al., 2017); làm trắng da (Ho Kyung Jung et al., 2015) Hạc vỹ dùng trị ho, đau họng, bỏng lửa, toàn cây điều trị

kinh phong trẻ em, ăn uống bị ngộ độc (Sách Đỏ Việt Nam, 2007)

Trong xu thế nhu cầu sử dụng làm cây hoa cảnh và dược liệu tăng mạnh những năm gần đây, hai loài Nghệ tâm và Hạc vỹ đã bị khai thác ồ ạt, dẫn đến nguồn nguyên liệu đang trở nên cạn kiệt Mặt khác, do tỷ lệ nảy mầm từ hạt trong tự nhiên rất thấp và vùng phân bố của Nghệ tâm và Hạc vỹ bị thu hẹp nên hai loài lan này đang trong tình trạng gần như mất dần trong tự nhiên Vì vậy, việc nghiên cứu công nghệ nhân giống phục vụ cho công tác bảo tồn và phát triển hai loài lan này là rất cần thiết Một trong các biện pháp hữu hiệu để nhân nhanh và bảo tồn các loài lan quý hiếm nói chung và Nghệ

tâm, Hạc vỹ nói riêng là kỹ thuật nhân giống in vitro và tạo hạt giống nhân

tạo, kéo dài quá trình bảo quản và cung cấp hạt giống cho sản xuất Nhằm góp phần làm phong phú nguồn dược liệu quý của Việt Nam, làm đẹp môi trường cảnh quan, nâng cao thu nhập cho người trồng lan, chúng tôi thực

hiện đề tài:“Nghiên cứu đặc điểm sinh học và kỹ thuật nhân giống phục vụ bảo tồn hai loài lan Nghệ tâm (Dendrobium loddigesii Rolfe), Hạc vỹ

(Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher) của Việt Nam”

2 Mục tiêu của đề tài

Nghiên cứu đánh giá các đặc điểm sinh học cơ bản và biện pháp kỹ

thuật nhân giống in vitro phục vụ công tác bảo tồn và phát triển hai loài lan

quý Nghệ tâm và Hạc vỹ, từng bước góp phần vào sản xuất cây dược liệu,

cây cảnh có giá trị của Việt Nam

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Ý nghĩa khoa học

Các kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp dữ liệu khoa học có giá trị

về một số biện pháp kỹ thuật nhân giống dựa trên các đặc điểm sinh học của hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ, góp phần bảo tồn, khai thác và phát triển chúng một cách phù hợp trong điều kiện Việt Nam

Các kết quả nghiên cứu có tính hệ thống về đặc điểm nông sinh học,

dược tính và công nghệ tạo hạt giống nhân tạo lan Nghệ tâm và Hạc vỹ là nguồn tư liệu có giá trị, làm cơ sở cho các nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo,

bổ sung vào tài liệu giảng dạy chuyên ngành trong các trường đại học, các chương trình phổ biến kiến thức cho cộng đồng

- Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Kết quả đề tài đã góp phần tích cực vào công tác bảo tồn hai loài lan dược liệu quý Nghệ tâm và Hạc vỹ của Việt Nam thông qua việc thu thập và lưu giữ với đầy đủ các thông tin bộ giống gốc bản địa

Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro, đề tài đã nhân giống và tạo được hạt

giống nhân tạo cùng số lượng lớn cây giống sạch bệnh, khỏe với hệ số nhân cao, góp phần mở rộng diện tích trồng hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ cho mục đích sản xuất dược phẩm và mỹ phẩm phục vụ nội tiêu và hướng tới

xuất khẩu với hiệu quả kinh tế cao

4 Đóng góp mới của đề tài

- Đề tài là công trình nghiên cứu có hệ thống về các đặc điểm hình thái,

cấu trúc vi phẫu và thành phần hóa sinh của hai loài lan Nghệ tâm (D loddigesii) và Hạc vỹ (D aphyllum) có giá trị làm thuốc và làm cảnh cao

- Đã xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cho hai loài lan quý

Nghệ tâm và Hạc vỹ phù hợp với điều kiện của Việt Nam, dễ áp dụng với nguồn nguyên vật liệu trong nước nên có tính khả thi cao

- Quy trình tạo hạt giống nhân tạo và nhân giống in vitro sau bảo quản

hạt hai loài lan đã kéo dài được thời gian bảo quản với tỷ lệ hạt nảy mầm từ 68% đến 70%, chi phí thấp và giữ được đặc tính giống

- Đã xác định được các biện pháp kỹ thuật cơ bản trong sản xuất cây

giống in vitro và vườn sản xuất làm cơ sở để xây dựng quy trình công nghệ

hoàn chỉnh về kỹ thuật sản suất hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ ở Việt Nam

5 Cấu trúc của luận án

Luận án gồm 130 trang không kể tài liệu tham khảo và phần phụ lục, 36 bảng kết quả nghiên cứu, 36 hình ảnh,169 tài liệu tham khảo trong và ngoài nước Nội dung luận án gồm các phần: Mở đầu: 3 trang, Chương 1: Tổng quan tài liệu và cơ sở khoa học của đề tài 34 trang, Chương 2: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 14 trang, Chương 3: Kết quả và thảo luận

72 trang, Kết luận, đề nghị 2 trang, Tài liệu tham khảo 16 trang và phần phụ lục 25 trang

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nguồn gốc và phân bố của hai loài lan Nghệ tâm (D loddigesii) và Hạc vỹ (D aphyllum) của Việt Nam

Chi Hoàng thảo (Dendrobium) được đặt tên vào năm 1799, Dendrobium

được hiểu là lan sống trên cây, tiếng Việt Nam gọi là lan Hoàng thảo (Trần Duy Quý, 2005)

Chi lan Hoàng thảo ở Việt nam rất đa dạng và phong phú nhưng sự phân

bố của chúng khá đặc thù Lan Nghệ tâm Nam có mặt tại Thái Nguyên, Hà

Giang, Lai Châu, Nghệ An (Averyanov et al., 2005) Lan Hạc vỹ phân bố tại Lâm Đồng, Khánh Hòa, Lào Cai, Bắc Cạn, Ninh Thuận (Averyanov et al.,

2005); Sách đỏ Việt Nam, 2007)

1.2 Một số đặc điểm thực vật học chính của hai loài lan Nghệ tâm (D loddigesii) và Hạc vỹ (D aphyllum)

Bảng 1.1 Đặc điểm thực vật chính của hai loài lan nghiên cứu

Đặc điểm Nghệ tâm (D loddigesii) Hạc vỹ (D aphyllum)

Thân

Lan sống phụ sinh, mọc bụi nhỏ, thân mềm buông xuống dài 10 - 20 cm, có đốt thưa (Trần Hợp, 1998)

Lan sống phụ sinh, thân buông xuống, mảnh dài 100 cm (Trần Hợp, 1998)

Lá

Lá thuôn hình giáo, dài 4 - 6

cm, rộng 1 - 2 cm, dễ rụng (Trần Hợp, 1998)

Lá xếp thành hình mác nhọn, dài 6 - 8 cm, rộng 1,5 - 2 cm (Sách Đỏ Việt Nam, 2007)

Hoa

Cụm hoa mọc ở nách lá, 1 - 2 hoa, mọc trên các thân mang

lá, màu hơi đậm (gân đỏ) có đốm đậm Cánh môi tròn, mép

có nhiều lông mịn và ở giữa

có màu vàng nghệ Mùa hoa tháng 4 - 8 (Trần Hợp, 1998;

Zhu Guanghua et al., 2009)

Cụm hoa bên, 1 - 3 hoa, mọc suốt dọc chiều dài thân không mang lá, màu tím nhạt hay hơi trắng Cánh môi màu vàng nhạt có 3 gân Mùa hoa tháng

4 - 5 (Trần Hợp, 1998; Sách

Đỏ Việt Nam, 2007)

1.3 Giá trị sử dụng và thực trạng khai thác hai loài lan Nghệ tâm (D loddigesii) và Hạc vỹ (D aphyllum) ở Việt Nam

Theo y học cổ truyền Trung Quốc, Nghệ tâm có tác dụng ngăn ngừa tế

bào ung thư dạ dày, ung thư phổi, chống đông máu (Tsai et al., 2010); ung

thư tuyến giáp, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư thực quản, ung thư tuyến tụy,

có tác dụng điều trị bệnh tiểu đường (Veronika Cakova et al., 2017); làm trắng da (Ho Kyung Jung et al., 2015) Lan Hạc vỹ có tác dụng bổ âm thanh nhiệt, tạo nước bọt giúp tiêu hóa, bổ phế và giảm ho (Zhao Yong Ling et al.,

1994)

Do có giá trị làm hoa cảnh, dược liệu và giá trị kinh tế cao nên lan Nghệ tâm và Hạc vỹ trong một số năm gần đây đã bị khai thác quá mức dẫn đến

nguy cơ mất hẳn trong tự nhiên

1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên

thế giới và ở Việt Nam

Với hoa lan, thị trường thương mại toàn cầu chủ yếu là hoa chậu và hoa cắt cành, ước tính khoảng 10% hoa tươi cắt cành được tiêu thụ trên thị trường quốc tế với giá trị trung bình trong giai đoạn từ năm 2007 đến năm

2012 là 483 triệu USD (Jayarama Reddy, 2016)

Hà Lan là nước dẫn đầu thế giới về sản xuất và xuất khẩu hoa lan (39,7%), tiếp theo là Thái Lan (28,4%), Đài Loan (10%), Singapore (10%)

và New Zealand (6%) Các nước nhập khẩu chủ yếu là Nhật Bản (30%), Anh (12%), Ý (10%), Pháp (7%) và Mỹ (6%) Lan cắt cành được trao đổi thương

mại trên thế giới chủ yếu là các loài lan Dendrobium (chiếm 85%) và Phalaenopsis, Cymbidium (chiếm 15%) (Cheamuangphan et al., 2013; De et al., 2014) Tại Hà Lan, việc sản xuất hoa lan Dendrobium trong chậu đã tăng phổ biến đạt 40 đến 50 triệu cây (De et al., 2014)

Ở Việt Nam diện tích trồng hoa lan còn rất khiêm tốn, chỉ chiếm 10% diện tích các loại hoa đang được trồng Sản xuất hoa lan ở Việt Nam tập trung theo 2 hướng chính là sản xuất theo quy mô công nghiệp các loài lan mới lai tạo hoặc được nhập nội (lan công nghiệp) và khai thác, nuôi trồng các loài hoa lan bản địa (lan rừng)

Đối với thị trường trong nước, sản lượng hoa phong lan cũng chưa đáp ứng được nhu cầu của người tiêu dùng, chỉ khoảng 30 - 40% nhu cầu lan cắt cành còn lại phải nhập từ các nước khác

1.5 Tình hình nghiên cứu thực vật học và nhân giống lan Hoàng thảo

(Dendrobium) trên thế giới và ở Việt Nam

1.5.1 Nghiên cứu thực vật học lan Hoàng thảo (Dendrobium)

Shi-Jian Yang et al., (2016), nghiên cứu đặc điểm giải phẫu và sinh lý của lá và giả hành của 4 loài D chrysotoxum, D officinale D crystallinum

và D crystallinum liên quan đến sự cân bằng nước Metusala et al., (2017)

đã nghiên cứu vi phẫu lá và thân của hai loài D capra và D arcuatum ở các

môi trường sống khác nhau liên quan đến khả năng thích ứng của hai loài trong điều kiện khô hạn

Theo y học cổ truyền, lan Nghệ tâm (D loddigesii) có tác dụng chống

tế bào ung thư dạ dày và ung thư phổi, chất chống đông máu (Tsai et al., 2010), điều trị bệnh tiểu đường type 2 (Zhang et al., 2011) Trong lan Nghệ

tâm có chứa shihunine, 9,10 dihydrophenanthrene 2,4,7 triol, moscatin,

loddigesiinols C, moscatilin, gigantol và tristin (Li Chunyan et al., 2013)

Theo nghiên cứu của Ho Kyung Jung et al., (2015) chất chiết xuất từ lan

Nghệ tâm có hiệu quả ức chế melanin, ức chế hoạt động tyrosinase và phát triển dendrite, có tác dụng làm trắng da

Veronika Cakova et al., (2017) cho rằng moscatilin trong Nghệ tâm có

tác dụng ngăn ngừa tế bào ung thư tuyến giáp, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư thực quản, ung thư tuyến tụy Loddigessinol G-J, Crepidatuol B có tác dụng điều trị bệnh tiểu đường Trong thân lan Hạc vỹ có polysaccharides và các hợp chất phenol như: moscatin, moscatilin và tricetin 3', 4', 5'-trimetyl ete 7-O--glucopyranoside, ức chế sản xuất NO, có hoạt động điều hòa miễn dịch

Các chất chống oxy hoá peptide được chiết xuất từ Hạc vỹ (D aphyllum) bao gồm superoxidedismutase, catalase và glutathione peroxidase

Các axit amin: Ala, Val, Ile, Leu, Tyr, Phe, Try, Pro, Met và Cys chỉ ra rằng peptit DA-P có hàm lượng chất dinh dưỡng cao và có hoạt động chống oxy

hoá tối ưu (Huifan Liu et al., 2017)

Ở Việt Nam, trong những năm gần đây hầu hết các công trình nghiên cứu đều tập trung về hình thái học của thân, lá, hoa, rễ (Trần Hợp, 1998; Sách Đỏ Việt Nam, 2007; Dương Đức Huyến, 2007), các nghiên cứu về vi phẫu, phân loại dựa trên chỉ thị hình thái với lan Hoàng thảo còn rất hạn chế Cao Phi Bằng và cs., (2017) đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh

trưởng, giải phẫu và thoát hơi nước của cây phong lan Phi điệp tím (D anosmum Lindl.) trong quá trình luyện cây ex vitro Nguyễn Thị Mỹ Duyên

và cs., (2012) đã nghiên cứu phân loại dựa trên đặc điểm hình thái và tìm ra được ba loài D pulchellum, D gatton Sunray, D moschatum có mối quan hệ

rất gần nhau mức tương đồng lần lượt là 96,5% và 95% Trần Duy Dương, (2015) đã kết hợp chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử để đánh giá đa dạng di truyền của 32 mẫu giống Hoàng thảo bản địa của Việt Nam trong đó có những loài có giá trị làm thuốc như Hoàng thảo Vảy rắn, Vảy rồng, Hạc vỹ…

Ở Việt Nam cho tới nay chưa có công trình nào công bố về thành phần hóa sinh của lan Hoàng thảo

1.5.2 Nghiên cứu về nhân giống lan Hoàng thảo (Dendrobium)

trên thế giới

1.5.2.1 Nghiên cứu về nhân giống in vitro

Trên thế giới có rất nhiều tác giả nghiên cứu nhân giống in vitro Dake Zhao et al., (2013) nghiên cứu nhân giống và tạo hoa trong ống nghiệm loài

lan D wangliangii Xin Qian et al., (2014) nghiên cứu sản xuất hoa và hạt giống loài lan D officinate trong ống nghiệm đã tạo được calluses từ các

đỉnh chồi trên môi trường MS bổ sung 0,2 mg/l BA + 0,05 mg/l αNAA, nhiều chồi được tái sinh từ các mẫu PLBs khi cấy trong môi trường MS + 1

mg/l αNAA Các cây con in vitro cao 2 - 4 cm, có khả năng ra hoa cao

(83,2%) với tỷ lệ hoa bình thường 73,6% khi cấy trên môi trường MS + 15% nước dừa + 0,1 mg/l TDZ trong 9 tuần

Mohammad Musharof Hossain et al., (2013) nghiên cứu nhân giống lan

Hạc vỹ cho rằng môi trường Phytamax (Sigma) + 1 mg/l BA giúp cho hạt

nảy mầm tốt trong lúc hệ số nhân protocorm trên môi trường Phytamax + 1 mg/l BA + 1 mg/l αNAA khá cao Đối với loài lan D jerdonianum Wight (Sagaya Mary et al., 2016) cho rằng môi trường MS thích hợp cho nuôi cấy

từ hoa, môi trường KC phù hợp với nuôi cấy từ lá, môi trường VW phù hợp với nuôi cấy từ đốt thân

Tapash Kumar Bhowmik et al., (2017) kết luận: môi trường Phytamax (PM) có bổ sung 20 g/l sucro đem lại tỷ lệ hạt nảy mầm loài D palpebra, cao hơn so với gluco và fructo Thejaswini et al., (2017) cho rằng nước ép cà chua và nước dứa 15% cho tỷ lệ nảy mầm tốt nhất khi gieo hạt in vitro lan D ovatum (Willd.) Theo Edy Setiti WidaUtami et al., (2017), bổ sung 2 g/l

peptone trong môi trường VW đã được chứng minh là hàm lượng thích hợp

cho sự nảy mầm của hạt, hình thành chồi với sự phát triển của protocorm

Nghiên cứu về nuôi cấy cắt lát mỏng đã được các tác giả thực hiện trên

một số đối tượng: nuôi cấy cắt lát mỏng ngang thân cây con in vitro lan D chrysotoxum (chiều dày 2 mm) Saranjeet Kaur, (2017);

Paromik Bhattacharyya et al., (2018) nhân giống lan D aphyllum từ các lớp

tế bào lát mỏng cắt ngang (t-TCL); Parthibhan et al., (2018) nghiên cứu tái

sinh phôi soma được hình thành từ các lớp tế bào lát mỏng cắt ngang (tTCL)

của lan D aqueum Lindley

Ở Việt Nam, Nguyễn Thanh Tùng và cs., (2010) nghiên cứu lát cắt

mỏng đoạn thân theo chiều ngang của chồi in vitro lan Hoàng thảo thân gãy (D aduncum), một số nghiên cứu nhân giống từ hạt in vitro cũng được tiến hành trên D nobile Lindl (Vũ Ngọc Lan và cs., 2013), D officinale (Nguyễn Thị Sơn và cs., 2014), D lituiflorum Lindley (Nguyễn Văn Việt, (2017), D transparens (La Việt Hồng và cs., 2017), D officinale (Lê Thị Diễm và Võ

Thị Bạch Mai, 2017),…

1.5.2.2 Nghiên cứu tạo hạt giống nhân tạo hoa lan

Các nghiên cứu tạo hạt giống nhân tạo hoa lan chủ yếu sử dụng

protocorm (Bunnag et al., 2010; Zhang et al., 2011; Mohanty et al., 2013; Bustam Suryanti et al., 2013; Sukhumpinij et al., 2015) hoặc từ PLBs (Nhut và cs., 2005; 2007; Trần Thị Ngọc Lan, 2013)

1.5.2.3 Nghiên cứu sinh trưởng và phát triển của cây từ hạt nhân tạo có

và không qua bảo quản

Sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá đặc tính di truyền loài Cineraria maritana, Srivastava et al., (2009) kết luận không có sự khác biệt về di truyền giữa cây gieo hạt không bảo quản và cây từ hạt bảo quản 6 tháng Kết quả tương tự cũng được Mishra et al., (2011) ghi nhận trên Picrorhiza kurrooa (bảo quản 3 tháng); Mohanty et al., (2013) trên D densiflorum (bảo

quản 60 ngày)

1.5.2.4 Các nghiên cứu về nuôi trồng lan Hoàng thảo

Mohammad Musharof Hossain et al., (2013) cho rằng giá thể thích

hợp trồng cây con D aphyllum là hỗn hợp mảnh gạch, than, xơ dừa và chất

khoáng (1: 1: 0,5: 0,5) Winarto et al., (2015) khuyến cáo với cây D ‘Zahra

FR 62’ và D ‘Gradita 31’: trồng cây trên giá thể Cycas rumphii trong 2 tháng, sau đó chuyển sang giá thể than : C rumphii (1:1), giảm cường độ ánh sáng (100-150 μmol⋅m-2⋅s-1) bằng cách che lưới 50% với độ ẩm tương đối 85 - 95% Tỷ lệ cây sống đạt 90 -100%

Theo Selvaraju Parthibhan et al., (2015), trồng cây D aqueum Lindley

trên giá thể mảnh gạch và than củi (1:1), để rêu trên bầu và chụp túi polyethylene giữ ẩm, tỷ lệ cây con sống cao Abdul Aziz Mirani et al., (2017) nghiên cứu loài lan D nobile, kết luận: cây con cấy trên môi trường

MS + 3 mg/l αNAA, sau đó đem trồng trên giá thể hỗn hợp than bùn xừa: cát: đá trân châu (1,0: 1,0: 0,2) cho tỉ lệ sống 100% sau 120 ngày

Bên cạnh phân bón, một số chế phẩm sinh học và chất kích thích sinh trưởng cũng đã được sử dụng để kích thích sinh trưởng, phát triển của lan

Dendrobium Với loài lan D cv sonia -17 trồng trong nhà kính, Bhatt et al.,

(2012) cho rằng khi phun GA3 ở nồng độ 15 mg/l, số lượng chồi, chiều dài chồi và số lượng hoa đạt tối đa trên cây, trong khi BA với nồng độ 15 mg/l lại có tác dụng làm tăng số lượng lá/cây trong ở tháng thứ nhất và thứ hai…

Ở Việt nam, các nghiên cứu về chăm sóc và nuôi trồng lan Hoàng thảo sau ống nghiệm còn rất hạn chế Phạm Thị Liên và cs., (2010) đề xuất quy

trình trồng một số giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) ở miền Bắc với giá

thể than củi + xơ dừa tỷ lệ 1:1, sử dụng phân bón tan chậm N:P:K tỷ lệ

20:20:20 và phân bón lá Grow more Vũ Ngọc Lan (2012) xác định giá thể

phù hợp trồng 2 loài D.nobile và D.chrysanthum là bột xơ dừa, phun chế phẩm dinh dưỡng Komix 2 ml/l, 7 - 10 ngày/lần sau khi đưa cây in vitro ra

vườn ươm một tháng Hoàng Xuân Lam (2014) cho rằng thời vụ ra ngôi tháng 4, giá thể than + xỉ bọt núi lửa + rong biển (2:2:1); sử dụng phân bón

lá Growmore (N:P:K = 30:10:10) và chất điều tiết sinh trưởng Atonik 1,8 SL

(0,1%) có tác dụng tốt đến sinh trưởng, phát triển của lan D cherry red

Nguyễn Thế Cường và cs., (2018) cho rằng trồng cây ở mật độ 44 cây/m2 và

sử dụng phân bón lá Growmore có tác dụng tốt đến sinh trưởng phát triển

của lan D officinale

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

- Mẫu giống sử dụng trong đánh giá đặc điểm hình thái, vi phẫu và phân

tích thành phần hóa sinh là mẫu lan Nghệ tâm (D loddigesii) được thu thập ở Định Hóa - Thái Nguyên và Hạc vỹ (D aphyllum) được thu thập ở

Hòn Bà - Khánh Hòa

- Vật liệu nuôi cấy mô chồi ngọn của mẫu lan Nghệ tâm và mẫu Hạc vỹ có chiều cao 7 - 10 cm

- Vật liệu tạo phôi sinh dưỡng: Các PLBs (protocorm like bodies) tạo thành

sau 6 tuần, hình thành từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Sau 6 tuần nuôi cấy, các PLBs đồng nhất sẽ được cắt ra với kích thước 3 - 4 mm để làm nguyên liệu tạo hạt nhân tạo

- Giai đoạn vườn ươm: Cây in vitro được nhân giống từ hạt nhân tạo: đạt

chiều cao 5 - 6 cm, có 4 - 6 lá và 3 - 5 rễ

- Giai đoạn vườn sản xuất: Cây có chiều cao 6 -7 cm, 6 - 7 lá/cây, 3 - 4 rễ mới

- Dịch chiết hữu cơ từ các loại củ quả: Cà chua, tảo, bí ngô…

- Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân nhanh in vitro: saccaroza, than hoạt tính

- Các giá thể: Rêu, vỏ thông đỏ, xơ dừa sợi, đá bọt núi lửa và dớn bảng

- Các chế phẩm dinh dưỡng: Orchid Focus grow, Seaweed (Rong biển) 95%, Đầu trâu 502, B1 Thái Lan, Growmore

- Chất kích thích sinh trưởng Superthrive

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hai loài lan Nghệ tâm (D loddigesii)

và Hạc vỹ (D aphyllum)

- Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống in vitro, kỹ thuật tạo hạt nhân tạo và nhân giống in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản lan Nghệ tâm (D loddigesii) và Hạc vỹ (D aphyllum) phục vụ cho công tác bảo tồn

- Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc cây con lan Nghệ tâm (D loddigesii) và Hạc vỹ (D aphyllum) in vitro giai đoạn vườn ươm

- Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc lan Nghệ tâm (D loddigesii) và Hạc vỹ (D aphyllum) giai đoạn vườn sản xuất

2.3 Phương pháp nghiên cứu và bố trí thí nghiệm

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu

* Phương pháp nghiên cứu hình thái hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ

- Mô tả hình thái theo phương pháp của Nguyễn Nghĩa Thìn, (2007) bao gồm các đặc điểm, thân lá, hoa và cấu tạo hoa,…

- Phân tích mẫu giống và xác định tên loài theo phương pháp so sánh hình thái dựa trên các tài liệu Hoa lan Việt Nam (Trần Hợp, 1998), Thực vật chí Việt Nam (Dương Đức Huyến, 2007)

* Phương pháp nghiên cứu cấu tạo vi phẫu hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ

- Đặc điểm vi phẫu rễ, thân, lá theo phương pháp cải tiến của Nguyễn Nghĩa Thìn (2007)

* Phương pháp phân tích một số thành phần hóa sinh cơ bản của lan Nghệ tâm (D loddigesii) và Hạc vỹ (D aphyllum)

- Xác định hàm lượng alkaloids toàn phần: theo phương pháp acid - base (Dược điển Việt Nam IV, 2009)

- Xác định hàm lượng flavonoids toàn phần: theo phương pháp đo quang

UV-VIS (Mudasir Sultana et al., 2012)

- Xác định hàm lượng polysaccharids toàn phần: theo phương pháp đo quang UV-VIS (Dược điển Trung Quốc, 2010)

- Xác định hàm lượng chất khoáng (Ca, Mg, Fe): theo phương pháp quang phổ hấp thu nguyên tử (AAS)

2.3.2 Bố trí các thí nghiệm theo nội dung nghiên cứu

- Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng NaOCl và thời

gian khử trùng lên mẫu cấy

- Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng cefotaxime tới

tỷ lệ sống vô trùng của mẫu cấy

- Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng tạo PLBs lát

mỏng tế bào nằm ngang (tTCL)

- Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và αNAA đến khả

năng tạo PLBs lát mỏng tế bào nằm ngang (tTCL)

- Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp (BA + IBA) đến khả

năng tái sinh chồi từ PLBs

- Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nghiền bí ngô đến khả

năng tái sinh chồi từ PLBs

- Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của tảo Spirulina đến khả năng tái

- Thí nghiệm 10: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate (%)

và CaCl2.2H2O (mM) khác nhau đến khả năng tạo hạt và nảy mầm của hạt nhân tạo

- Thí nghiệm 11: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với dung

dịch CaCl2.2H2O đến khả năng nảy mầm của hạt nhân tạo

- Thí nghiệm 12: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA, tổ hợp (BA + IBA) đến

khả năng nảy mầm và sinh trưởng của hạt nhân tạo

- Thí nghiệm 13: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian bảo quản của hạt nhân tạo

- Thí nghiệm 14: Nghiên cứu ảnh hưởng của ABA đến thời gian bảo quản của hạt nhân tạo

- Thí nghiệm 15: Nghiên cứu ảnh hưởng của natri benzoat, carbendazim

và topsin - M đến khả năng bảo quản hạt nhân tạo

- Thí nghiệm 16: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp (BA + PAA) đến khả

năng nhân nhanh protocorm và chồi

- Thí nghiệm 17: Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nghiền cà chua đến khả

năng nhân nhanh protocorm và chồi

- Thí nghiệm 18: Nghiên cứu ảnh hưởng của PAA đến khả năng tạo cây in

vitro hoàn chỉnh sau bảo quản

- Thí nghiệm 19: So sánh khả năng sinh trưởng của cây nhân giống in

vitro truyền thống và cây nhân giống in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản

ở giai đoạn vườn ươm

- Thí nghiệm 20: Nghiên cứu xác định thời vụ ra ngôi cây con in vitro giai

đoạn vườn ươm

- Thí nghiệm 21: Nghiên cứu xác định giá thể cho cây con in vitro giai

đoạn vườn ươm

- Thí nghiệm 22: Nghiên cứu bổ sung chế phẩm dinh dưỡng cho cây con

in vitro giai đoạn vườn ươm

- Thí nghiệm 23: Nghiên cứu xác định giá thể cho cây ở giai đoạn vườn

- Số rễ (rễ/cây), chiều dài rễ (cm)

Chỉ tiêu giải phẫu: Kích thước vỏ, kích thước trụ, số bó dẫn và kích thước bó dẫn…

- Các chỉ tiêu giải phẫu: Dày hậu mô, số lượng bó dẫn, tỷ lệ bó to/bó nhỏ, kích thước bó

- Chỉ tiêu vi phẫu: bao phấn,…

+ Các chỉ tiêu theo dõi trong nuôi cấy in vitro và tạo hạt nhân tạo

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%), Tỷ lệ cây sống (%), Số PLBs/tTCL (PLBs), tỷ lệ

tạo PLBs (%), Tỷ lệ mẫu tạo protocorm (%), Hệ số nhân protocorm (lần),

Chiều cao chồi (cm); số lá/chồi (lá), tỷ lệ hạt nảy mầm (%), số chồi/hạt (chồi), chiều dài chồi (mm), tỷ lệ hạt ra rễ (%), số rễ/chồi (rễ)

+ Các chỉ tiêu về sinh trưởng phát triển (giai đoạn vườn ươm và vườn sản xuất)

- Tỷ lệ cây sống (%), chiều cao cây (cm), đường kính thân cây (cm), số lá/cây (lá), chiều dài lá (cm), chiều rộng lá (cm), số nhánh/cây, số rễ trung bình/cây (rễ)

2.4 Điều kiện thí nghiệm

Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Nghiên cứu đặc điểm hình thái của các mẫu lan Hoàng thảo được thực hiện tại Trung tâm Sinh học Thực nghiệm, Viện Ứng dụng Công nghệ, năm 2013 - 2014

- Nghiên cứu cấu tạo vi phẫu được thực hiện tại: Phòng thí nghiệm Bộ