Mục đích nghiên cứu của luận án nhằm tạo được các dòng dưa hấu tứ bội, tam bội. Xác định môi trường thích hợp nhân nhanh các dòng dưa hấu tứ bội, tam bội. Đánh giá sinh trưởng, năng suất và chất lượng trái của các dòng dưa hấu tam bội tạo ra trong điều kiện ngoài đồng.
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
Trang 3CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
Người hướng dẫn chính: PGS.TS Lâm Ngọc Phương
Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường
Họp tại: Hội trường …….; Khoa……… ……
………; Trường Đại học Cần Thơ
Vào lúc … giờ … ngày … tháng … năm …
Phản biện 1: ……… Phản biện 2: ………
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ
Thư viện Quốc gia Việt Nam
Trang 5DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
1 Trần Thanh Truyền, Lâm Ngọc Phương và Ngô Phương Ngọc 2014 Hiệu quả của Benzyl adenin (BA), Indole butyric acid (IBA) và than hoạt tính trên sự tạo chồi và ra rễ của cây
dưa hấu tam bội (Citrullus vulgaris Schrad.) in vitro Tạp chí
Khoa học trường Đại học Cần Thơ, pp: 168-172
2 Trần Thanh Truyền và Lâm Ngọc Phương 2017 Kết quả trồng thử nghiệm các dòng dưa hấu tam bội (3x) tại Đồng Bằng Sông Cửu Long Tạp chí Nông nghiệp Phát triển Nông thôn chuyên đề Giống cây trồng, vật nuôi, tập 1, pp: 108-114
Trang 6CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
Dưa hấu (Citrullus vulgaris L.) là loại cây trồng phổ biến nhất trên thế giới
Việt Nam có truyền thống trồng dưa hấu từ thời vua Hùng Vương thứ 18; đến nay, việc sản xuất dưa hấu ngày càng phát triển, đứng thứ 5 về xuất khẩu (FAOStat, 2012) Dưa hấu ăn rất ngon, nhất là trong những ngày hè nóng bức; tuy nhiên có điều bất tiện khi dùng dưa hấu nhị bội vì chứa nhiều hạt (Donald and Maynard, 1992) Do đó, giống dưa hấu không hạt (3X-tam bội) được nhiều người ưa chuộng,
vì không phải bỏ hạt khi ăn, đồng thời dưa còn có chất lượng tốt do ngon ngọt Người tiêu dùng có thể vui lòng mua và thưởng thức loại dưa không hạt dù giá tiền cao hơn so với dưa hấu thông thường nhị bội có hạt (Marr and Gast, 1991;
Maynard et al., 2002)
Dưa hấu tam bội được tạo thành bằng phương pháp lai tạo giữa thể tự tứ bội với
nhị bội (Andrus et al., 1971; Kihara, 1951; Guo et al., 2011) Trong đó, dưa hấu tứ
bội được tạo thành công bằng cách xử lý cây con nhị bội với colchicine hay
oryzalin, nơi vườn ươm hay trong môi trường in vitro (Kihara, 1951; Raza et al., 2003; Noh et al., 2012; Lâm Ngọc Phương và Nguyễn Kim Hằng, 2010) Tuy
nhiên, cây dưa hấu tứ bội rất ít hạt (giảm 10 lần so với hạt nhị bội), tỷ lệ nảy mầm
của hạt thấp, muốn duy trì dòng tứ bội rất đắt tiền (Trần Khắc Thi et al., 2008) Theo Compton and Gray (1992); Compton et al (1993), ứng dụng kỹ thuật nuôi
cấy mô trong tạo dòng tứ bội và tam bội là một phương pháp đã làm giảm được thời gian nhân dòng (1-2 năm) và thuận lợi cho việc bảo quản các dòng dưa hấu này thay cho phương pháp truyền thống
Ở đồng bằng sông Cửu Long, sản xuất dưa hấu không hạt ngày càng tăng nhưng chi phí sản xuất cao do chủ yếu sử dụng giống nhập nội, giá thành hạt giống cao vì hạt khó tồn trữ dễ mất sức nảy mầm (Marr and Gast, 1991) Công tác chọn tạo ra giống dưa hấu không hạt mới có xuất xứ ở Việt Nam là rất cấp thiết Vì thế,
đề tài “Nghiên cứu chọn tạo và biện pháp nâng cao năng suất, phẩm chất dòng
dưa hấu (Citrullus vulgaris L.) tam bội in vitro” được thực hiện
1.1 Mục tiêu của luận án
Mục tiêu chính: tạo được cây dưa hấu tam bội
Mục tiêu cụ thể:
i) Tạo được các dòng dưa hấu tứ bội, tam bội
ii) Xác định môi trường thích hợp nhân nhanh các dòng dưa hấu tứ bội, tam bội
iii) Đánh giá sinh trưởng, năng suất và chất lượng trái của các dòng dưa hấu tam bội tạo ra trong điều kiện ngoài đồng
1.2 Ý nghĩa của luận án:
i) Tạo được dòng dưa hấu tam bội có nguồn gốc từ Việt Nam
ii) Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào để rút ngắn thời gian chọn tạo, nhân dòng và giúp giảm giá thành cây giống tứ bội và tam bội
iii) Xác định được môi trường thích hợp để nhân giống các dòng dưa hấu tứ bội
Trang 71.3 Điểm mới của luận án:
i) Tạo cây con tứ bội bằng phương pháp nuôi cấy mô và xử lý đa bội hóa; trồng cây ra đồng
ii) Lai tạo thành công hạt tam bội từ hoa cái cây tứ bội với phấn hoa cây nhị bội
iii) Tìm được môi trường nuôi cấy in vitro thích hợp cho việc nhân chồi, tạo rễ
các dòng dưa hấu tứ bội, tam bội, nhân nhanh giống; góp phần giảm bớt chi phí đầu tư ban đầu trong sản xuất dưa hấu không hạt
iv) Khảo sát và đánh giá khả năng sinh trưởng, phẩm chất trái của 2 dòng dưa hấu tam bội tạo thành cấy mô trồng ngoài đồng tại Cần Thơ và Hậu Giang v) Bước đầu đánh giá được liều lượng phân đạm cùng mật độ trồng phù hợp cho sự sinh trưởng phát triển, năng suất và phẩm chất trái của dòng tam bội lai cấy
mô trồng ngoài đồng
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa học tạo thể đa bội bằng colchicine và oryzalin
Colchicine có công thức hóa học là C22H25O6N được chiết xuất từ cây
Colchicum autumnale L mọc nhiều ở bờ biển Địa Trung Hải Bột colchicine tinh
khiết có màu trắng ngà, dễ hòa tan trong nước, cồn, cloroform Colchicine có tính bền vững cao, dung dịch bảo quản được lâu và có thể khử trùng trong nồi hấp, tuy nhiên nó dễ phân giải ngoài ánh sáng nên cần bảo quản trong tối Colchicine là chất độc có tác dụng làm tê liệt nên cần hết sức thận trọng khi làm việc với nó (Trần Thượng Tuấn, 1992)
Oryzalin có công thức hóa học C12H18N4O6S là một loại thuốc cỏ Dinitroaniline, là một tinh thể rắn màu vàng cam với điểm nóng chảy 141-142˚C, trọng lượng phân tử là 346,35; hòa tan trong nước ở mức 2,5 ppm trong điều kiện nhiệt độ 25˚C Dễ dàng hòa tan trong các dung môi hữu cơ như acetone, ethanol, methanol và acetonitrile, ít tan trong benzen và xylene, không hòa tan trong hexane Oryzalin được dùng để kích thích sự đa bội hóa ở nhiều loại cây trồng
(Morejohn et al., 1987) Theo EPA (Environmental Protection Agency) (1994)
oryzalin có hoạt động ức chế sự phân bào ở các loài cây trồng và được đăng ký đầu tiên ở Mỹ năm 1974
Tác động của oryzalin đến sự phân bào cũng giống như colchicine tức chúng tác động lên liên kết disulphite của prôtêin và phân tử ribôse của acid ribônuclêic Trong quá trình phân bào, hóa chất này làm thoi vô sắc ngừng hoạt động do chúng hình thành phức hợp vi ống - hóa chất, ngăn cản sự phân chia tế bào và tâm động phân chia muộn hơn, trong khi sự tái bản của nhiễm sắc thể và hình thành cromatit vẫn diễn ra bình thường Ở kỳ giữa của nguyên phân, các nhiễm sắc thể không phân bố trên mặt phẳng xích đạo của thoi vô sắc, nhiễm sắc thể rút ngắn lại và dày lên Sự phân ly các nhiễm sắc thể về hai cực đối diện ở giai đoạn hậu kỳ không xảy
ra, tế bào không phân chia, mặc dù số lượng nhiễm sắc thể đã tăng gấp đôi Kích thước của các tế bào này lớn hơn các tế bào thường Khi ngưng sự tác động của hóa chất thì tế bào lại có khả năng phân chia bình thường và tạo nên các tế bào tứ
bội (Trần Thượng Tuấn, 1992; Dolezel et al., 2004) Tuy nhiên, hoạt động gắn kết
với vi ống của oryzalin chặt chẽ hơn so với colchicine Những cây trồng được xử
lý oryzalin ở nồng độ micromolar (µM) cho kết quả tương đương với những cây
trồng được xử lý bằng colchicine ở nồng độ milimolar (mM) (Dolezel et al., 2004)
Trang 8Mặt khác oryzalin chủ yếu xâm nhập thông qua bề mặt vết cắt và đi vào qua lớp tế
bào biểu bì và qua cả lớp cutin trên bề mặt tế bào lá (Allum et al., 2007)
2.2 Phương pháp xác định cây đa bội
Hình thái và đặc điểm sinh trưởng, phát triển: hình thái lá là một tiêu chí hữu
ích cho việc xác định các dòng tứ bội cùng nguồn trước khi tuyển chọn chúng ra bên ngoài Lá cây dưa hấu tứ bội lớn, dày và xanh đậm hơn so với cây lưỡng bội (Kihara, 1951) Bên cạnh đó, tỷ lệ chiều dài/chiều rộng của lá tứ bội (1,00±0,02 và 1,02±0,02) đều thấp hơn lá nhị bội (1,28±0,02 và 1,30±0,02) trên cả hai giống dưa
hấu Giza 1 và Giza 21 trong điều kiện in vivo (Nasr et al., 2004), diện tích lá tứ bội
lại lớn hơn lá nhị bội ở tất cả các giống quan sát Ngoài hình dạng và kích thước lá thì dưa hấu tứ bội TPS có hoa lớn hơn, trọng lượng trái cũng lớn, trung bình 4 kg
và có khoảng 70 hạt/quả, thịt quả màu đỏ đậm, cứng và tỷ lệ đường khoảng 12,5%
(Karchi et al., 1981) Thêm vào đó, độ dày vỏ và số hạt lép/trái của các cây tứ bội cao hơn nhị bội (Ahmad et al., 2013), nhưng tốc độ tăng trưởng lúc đầu chậm hơn
và thời gian ra hoa cũng muộn hơn so với cây nhị bội (Pradeepkumar, 2011)
Mật số khí khẩu/đơn vị diện tích lá và chiều dài khí khẩu: sự khác biệt về mật
số khí khẩu là tiêu chuẩn để phân biệt thể lưỡng bội (2n) và thể tứ bội (4n) của tế
bào thực vật, cũng như để xác định các dạng đa bội (Hamill et al., 1992) Kích
thước của tế bào khí khẩu trên dưa hấu Sugar Baby tứ bội (được xác định bằng phương pháp phân tích hàm lượng ADN nhân) lớn hơn so với các cây nhị bội
(Thayyil et al., 2016) Phương pháp này nhanh chóng, không tốn kém, không đòi
hỏi thiết bị tinh vi và có tỷ lệ chính xác khá cao (một số trường hợp lên đến 90%; Cohen and Yao, 1996) Tuy nhiên, đây chỉ là phương pháp gián tiếp để đánh giá mức độ đa bội Nếu cây trồng ở trạng thái tạp bội thì phương pháp này không đáng
tin cậy cần kết hợp thêm các phương pháp khác (Chen et al., 2006)
Đếm số lượng nhiễm sắc thể là một trong những phương pháp trực tiếp và
chính xác nhất để xác định mức độ đa bội nhưng nếu sàn lọc sớm và sơ bộ sẽ gây mất thời gian Bên cạnh đó, việc đếm nhiễm sắc thể sẽ tốn nhiều thời gian, công sức và khó thực hiện trên những loại cây trồng có số lượng nhiễm sắc thể lớn và kích thước tế bào nhỏ Đặc biệt, đối với dưa hấu phương pháp này lại khó thực hiện bởi kích thước nhiễm sắc thể nhỏ (Jaskani and Khan, 2000)
Phân tích flow cytometry (dòng chảy tế bào) bằng máy đo đa bội thể (Partec Ploidy Analyser): phương pháp phân tích dòng chảy tế bào có nhiều thuận lợi hơn
so với phương pháp đếm nhiễm sắc thể (Leus, 2005; Loureiro et al., 2005): thuận
tiện trong công tác chuẩn bị mẫu và nhanh chóng vì chỉ cần một lượng mẫu nhỏ Qui trình phân tích đơn giản, thực hiện nhiều mẫu trong cùng thời gian Có thể lấy nhiều loại mô khác nhau để phân tích như: lá, rễ, thân, cánh hoa, hạt, trái,… mà không cần xác định giai đoạn phân chia tế bào Chi phí phân tích mẫu bằng phương pháp này là chấp nhận được Chỉ cần chi phí lúc ban đầu cho máy phân tích, còn các vật liệu, hóa chất liên quan thì giá thành thấp Hiện nay trên thế giới, phương pháp phân tích dòng chảy tế bào là một trong những công cụ quan trọng trong việc đánh giá mức bội thể các mẫu giống được tạo và rất nhiều nghiên cứu sử dụng
phương pháp này (Faten et al., 2012; Jaskani et al., 2005) Tuy nhiên, phương pháp
này đòi hỏi phải mua thiết bị đắt tiền và đặc điểm của nhiễm sắc thể không thể quan sát được
Trang 92.3 Dưa hấu tam bội (không hạt)
Dưa hấu tam bội lần đầu tiên được sản xuất bởi Kihara và Nishiyama vào năm
1939 bằng cách sử dụng colchicine tạo ra thể 4x và cho lai với hạt phấn cây nhị bội Hiện nay, đa số các dưa hấu không hạt được sản xuất theo phương pháp này và
được xem là phương pháp hữu hiệu nhất (Guo et al., 2011; Wang et al., 2013) Để
dưa hấu không hạt sinh trưởng đạt kích thước bình thường, thịt quả không có hiện tượng rỗng ruột hình trái tim thì nhất thiết phải có quá trình thụ phấn giả (Mark Arena, 2012; Johnson, 2014) Chính vì thế, khi trồng dưa tam bội nhất thiết phải trồng xen thêm 25% đến 33% các cây dưa nhị bội để đảm bảo quá trình thụ phấn
thành công, nhằm tăng tỷ lệ đậu trái (Olson et al, 2012; Fiachino and Walters,
2003) Kỹ thuật lai tạo dòng dưa hấu tam bội gồm 4 bước: (1) chọn lọc các dòng
nhị bội, (2) sản xuất các cây tứ bội, (3) phát triển các dòng tứ bội và nhị bội thuần, (4) lai tạo hạt lai tam bội (cây mẹ tứ bội x phấn hoa nhị bội) và trồng tạo trái tam bội (thụ phấn bổ khuyết hạt phấn nhị bội) (Wehner, 2008)
2.4 Vai trò của vi nhân giống đối với cây trồng
Vi nhân giống là một công cụ đắc lực để nhân đa số cây thân thảo (cây dược liệu, cây ăn quả, cây lương thực, cây cảnh…), làm giảm giá thành các cây lai F1, đặc biệt đối với các cây lai tam bội như dưa hấu không hạt, mang lại hiệu quả kinh
tế cao so với việc sử dụng các phương pháp truyền thống khác, góp phần bảo vệ an ninh lương thực và chống biến đổi khí hậu toàn cầu Do phương pháp này đã khắc phục được những hạn chế về việc sản xuất hạt giống hàng năm như: năng suất hạt kém, giá thành cao, hạt nẩy mầm kém, cây con yếu (Nguyễn Bảo Toàn, 2005; Lâm Ngọc Phương, 2012)
2.5 Ảnh hưởng của mật độ trồng và lượng phân đạm đến năng suất, phẩm chất trái dưa hấu
Mật độ trồng dưa hấu khác nhau ở mỗi vùng miền và mỗi loại giống, khoảng cách càng ngắn tức mật độ cây trồng tăng sẽ làm tăng năng suất dưa hấu không hạt
so với mật độ thấp (Motsenbocker and Arancibia, 2002; Walters, 2009; Strang et
al., 2005) Phân bón có ý nghĩa trong việc tăng năng suất và phẩm chất dưa Việc
cung cấp đầy đủ đạm làm hoạt động quang hợp cao, sinh trưởng mạnh và cho bộ lá màu xanh đậm Khi tăng nồng độ đạm sẽ làm tăng năng suất trái, độ Brix và hàm lượng lycopene trên dưa hấu Nhưng khi tăng lượng đạm quá cao dưa phát triển thân lá mạnh, cây xum xuê nhưng có thể ảnh hưởng đến độ cứng cây vì thế cây trở nên mọng nước, do đó chống chịu sâu bệnh yếu, khó đậu trái, trái chín chậm, tích nhiều nước, vị lạt và không giữ được lâu sau thu hoạch Thiếu đạm cây tăng trưởng kém, lóng ngắn, lá nhỏ và trái cũng nhỏ (Phạm Hồng Cúc, 2007)
Trang 10CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Phương pháp thí nghiệm gồm 4 giai đoạn chính (Hình 3.1) với mỗi giai đoạn có các thí nghiệm cụ thể như sau:
3.1 Cảm ứng tạo thành cây dưa hấu tứ bội in vitro bằng colchicine và
oryzalin trên các dòng dưa hấu nhị bội
3.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của thời gian xử lý colchicine lên sự sinh
trưởng của 2 dòng dưa hấu nhị bội TPS và TPT in vitro
Vật liệu: hạt dưa hấu của 2 dòng nhị bội thuần gồm TPS, TPT Trong đó: dòng
TPS có nguồn gốc từ giống Sugar Baby với dạng trái tròn hay oval, vỏ quả xanh đen, ruột đỏ Dòng TPT có nguồn gốc lai tạo từ giống Thành Long với dạng trái oval, vỏ quả xanh lá có sọc xanh đậm, ruột đỏ Các dòng này được phòng thí nghiệm bộ môn Sinh lý-Sinh hóa cung cấp Hạt dưa hấu của 2 dòng nhị bội này
được khử trùng và nuôi cấy trong môi trường MS in vitro
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức 1 nhân tố kiểu hoàn
toàn ngẫu nhiên gồm 3 mức độ thời gian xử lý colchicine (4, 6, 8 ngày) và 1 đối
chứng (không xử lý) với 5 lần lặp, mỗi lần lặp 2 keo, mỗi keo 10 mẫu chồi đỉnh in
vitro Các chỉ tiêu theo dõi: số lượng khí khẩu/mm2, tỷ lệ cây có kiểu hình đa bội,
tỷ lệ cây tứ bội được kiểm tra bằng phân tích dòng chảy tế bào
3.1.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian xử lý oryzalin lên sự sinh
trưởng của 4 dòng dưa hấu nhị bội in vitro
Vật liệu: hạt dưa hấu của 4 dòng nhị bội thuần gồm TPS, TPB, TPT, TPX
Trong đó:dòng TPS và dòng TPT như thí nghiệm 1 Dòng TPB có nguồn gốc từ giống Bảo Long với dạng trái oval, vỏ màu xanh đen có sọc, ruột đỏ Dòng TPX có nguồn gốc lai tạo từ giống Xuân Lan với dạng trái oval, vỏ màu xanh lá nhạt có sọc xanh đậm, ruột vàng Các dòng này được phòng thí nghiệm bộ môn Sinh lý-Sinh hóa cung cấp Hạt dưa hấu của 4 dòng nhị bội thuần được khử trùng và nuôi cấy
trong môi trường MS in vitro
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức thừa số 2 nhân tố kiểu
hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 4 dòng dưa hấu nhị bội TPS, TPB, TPT, TPX và 2 mức thời gian xử lý oryzalin (48 và 54 giờ) và 1 đối chứng (không xử lý) với 5 lần lặp, mỗi lần lặp 2 keo, mỗi keo 10 mẫu chồi đỉnh Chỉ tiêu theo dõi: tương tự thí nghiệm 1
3.2 Thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng tạo chồi và sinh trưởng của hai dòng
tứ bội TPT và TPS trong môi trường có bổ sung BA
Vật liệu: các chồi đơn cấy mô của 2 dòng dưa hấu tứ bội TPT và TPS được
chọn lọc bằng phương pháp phân tích dòng chảy tế bào, nuôi cấy trên môi trường
MS 3 tuần trước khi làm vật liệu thí nghiệm Chọn các chồi có chiều cao, số lá tương đối đồng nhất giữa các nghiệm thức
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức thừa số 2 nhân tố kiểu
hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức gồm 2 dòng dưa hấu tứ bội TPT, TPS và 3 mức nồng độ BA (0; 0,5; 1 mg/L) với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 2 keo, mỗi keo
cấy 4 mẫu Các chỉ tiêu theo dõi: số chồi/mẫu, chiều cao chồi, số lá/mẫu gia tăng
3.3 Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng tạo chồi và sinh trưởng của hai dòng
tứ bội TPB và TPX trong môi trường có bổ sung BA
Vật liệu: chồi đơn dưa hấu của hai dòng tứ bội TPB và TPX cấy mô (tương tự
thí nghiệm 3)
Trang 11Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức thừa số 2 nhân tố kiểu
hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức gồm 2 dòng dưa hấu tứ bội TPB, TPX và
2 mức nồng độ BA (0,5; 1 mg/L) với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 2 keo, mỗi keo cấy 4 mẫu Các chỉ tiêu theo dõi: tương tự thí nghiệm 3
3.4 Thí nghiệm 5: Đánh giá khả năng tạo rễ, sinh trưởng của dòng tứ bội
TPT trên môi trường có bổ sung IBA và NAA
Vật liệu: chồi đơn dưa hấu tứ bội TPT cấy mô trên môi trường MS sau 3 tuần
nuôi cấy với chiều cao và số lá tương đối đồng nhất
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức thừa số 2 nhân tố kiểu
hoàn toàn ngẫu nhiên, với 6 nghiệm thức, gồm 2 nồng độ IBA (0 và 1 mg/L) và 3 nồng độ NAA (0; 0,2; 0,5 mg/L) mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 2 keo, mỗi keo cấy 4 mẫu Các chỉ tiêu theo dõi: số rễ (rễ), chiều dài rễ (cm)
3.5 Thí nghiệm 6: Đánh giá khả năng tạo rễ, sinh trưởng của dòng tứ bội
TPS trên môi trường có bổ sung IBA và NAA
Vật liệu: chồi đơn dưa hấu tứ bội TPS cấy mô trên môi trường MS sau 3 tuần
nuôi cấy có chiều cao và số lá tương đối đồng nhất
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức thừa số 2 nhân tố kiểu
hoàn toàn ngẫu nhiên, với 6 nghiệm thức, gồm 2 nồng độ IBA (0 và 1 mg/L) và 3 nồng độ NAA (0; 0,2; 0,5 mg/L) mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 2 keo, mỗi keo cấy 4 mẫu Các chỉ tiêu theo dõi: tương tự thí nghiệm 5
3.6 Thí nghiệm 7: Đánh giá khả năng tạo rễ, sinh trưởng của bốn dòng tứ bội trên môi trường có bổ sung IBA
Vật liệu: chồi đơn của bốn dòng dưa hấu tứ bội cấy mô trên môi trường MS
sau 3 tuần nuôi cấy với chiều cao và số lá tương đối đồng nhất
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức 1 nhân tố kiểu hoàn
toàn ngẫu nhiên gồm 4 dòng dưa hấu tứ bội với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 2 keo, mỗi keo cấy 4 mẫu Các chỉ tiêu theo dõi: tương tự thí nghiệm 5
3.7 Thí nghiệm 8: Đánh giá, chọn lọc các dòng tứ bội cấy mô và lai tạo hạt tam bội ngoài đồng
Vật liệu: cây con của bốn dòng dưa hấu tứ bội cấy mô được thuần dưỡng tại
trại thực nghiệm Đại Học Cần Thơ
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm bố trí theo thể thức 1 nhân tố kiểu khối hình
vuông la tinh gồm 4 dòng dưa hấu tứ bội cấy mô với 4 lần lặp lại sao cho mỗi lần lặp có đủ 4 dòng dưa hấu tứ bội cấy mô tương ứng với 10 cây/dòng/lần lặp lại Địa điểm bố trí: tỉnh Hậu Giang Các chỉ tiêu theo dõi: chỉ tiêu sinh trưởng (chiều dài dây dưa, số lá/dây), chỉ tiêu trái (số trái lai thành công, khối lượng trái, năng suất)
và phẩm chất trái (độ dày vỏ, độ Brix, số hạt tam bội chắc/trái/dòng)
3.8 Thí nghiệm 9: Đánh giá khả năng tạo chồi và sinh trưởng của các dòng tam bội cấy mô trên môi trường có bổ sung BA
Vật liệu: chồi đơn từ hạt dưa hấu tam bội thu từ thí nghiệm 8 được khử trùng
và chuyển vào môi trường MS in vitro Trong đó, các dòng TriP1, TriP2, TriP3,
TriP4 là hạt lai tương ứng từ các dòng mẹ tứ bội TPX, TPT, TPB và TPS
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức thừa số 2 nhân tố kiểu
hoàn toàn ngẫu nhiên với 16 nghiệm thức, gồm 4 mức độ BA (0; 0,5; 1 và 2 mg/L)
và 4 dòng dưa hấu tam bội, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 2 keo,
mỗi keo cấy 4 mẫu Các chỉ tiêu theo dõi: số chồi gia tăng, chiều cao chồi gia tăng
Trang 123.9 Thí nghiệm 10: Đánh giá khả năng tạo chồi, sinh trưởng của dòng dưa hấu tam bội TriP1 trên môi trường có bổ sung BA và than hoạt tính
Vật liệu: dòng dưa hấu tam bội TriP1 cấy mô
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức thừa số 2 nhân tố kiểu
hoàn toàn ngẫu nhiên, với 8 nghiệm thức, gồm 4 mức độ BA (0; 0,5; 1 và 2 mg/L)
và 2 mức độ than hoạt tính (0 và 2 g/L), mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp
lại 2 keo, mỗi keo cấy 4 mẫu Các chỉ tiêu theo dõi: số chồi gia tăng, chiều cao chồi
gia tăng (cm)
3.10 Thí nghiệm 11: Đánh giá khả năng tạo rễ, sinh trưởng của 3 dòng dưa
hấu tam bội in vitro trên môi trường có bổ sung IBA
Vật liệu: 3 dòng dưa hấu tam bội TriP2; TriP3; và TriP4 cấy mô
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo 1 nhân tố kiểu hoàn toàn ngẫu
nhiên gồm 3 dòng dưa hấu tam bội (TriP2; TriP3; và TriP4) trên môi trường MS có
bổ sung IBA 2 mg/L với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 2 keo, mỗi keo cấy 4 mẫu
Các chỉ tiêu theo dõi: số rễ/mẫu, chiều dài rễ, chiều cao chồi
3.11 Thí nghiệm 12: Đánh giá khả năng tạo rễ, sinh trưởng của dưa hấu tam bội TriP1 trên môi trường có bổ sung IBA và than hoạt tính
Vật liệu: dòng dưa hấu tam bội TriP1 cấy mô
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thừa số 2 nhân tố kiểu hoàn
toàn ngẫu nhiên với 10 nghiệm thức, gồm 5 mức độ IBA (0; 0,2; 0,5; 1 và 2 mg/L)
và 2 mức độ than hoạt tính (0 và 2 g/L), mỗi nghiệm thức 3 lần lặp, mỗi lần lặp 2 keo, mỗi keo cấy 4 mẫu Các chỉ tiêu theo dõi: số rễ/mẫu, chiều dài rễ, chiều cao chồi
3.12 Thí nghiệm 13: Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển, năng suất
và phẩm chất trái của 2 dòng dưa hấu tam bội (3x) cấy mô ngoài đồng Vật liệu: cây con dưa hấu tam bội TriP1, TriP2, TriĐC (đối chứng) cấy mô
được thuần dưỡng tại trại thực nghiệm Đại học Cần Thơ Trong đó, TriĐC là hạt giống Mặt Trời Đỏ thuộc công ty Syngenta (thời gian sinh trưởng 60-62 ngày (mùa nắng) hoặc 65-67 ngày (mùa mưa), trọng lượng trung bình 3-4 kg/trái, độ Brix 12-13%, thịt quả màu đỏ, khả năng thích ứng rộng, có thể trồng quanh năm, dễ đậu trái)
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức 1 nhân tố khối hoàn
toàn ngẫu nhiên gồm 3 nghiệm thức tương ứng với 2 dòng dưa hấu tam bội được lai tạo (TriP1, TriP2) và 1 giống đối chứng (TriĐC) cấy mô sau 3 tuần thuần dưỡng, với 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 20 cây tại 2 điểm Cần Thơ (vụ thu đông, 2013) và Hậu Giang (vụ đông xuân, 2013) Các chỉ tiêu theo dõi: tương tự thí nghiệm 8
3.13 Thí nghiệm 14: Khảo sát ảnh hưởng của lượng phân đạm (N) và mật
độ trồng lên năng suất, phẩm chất dưa hấu tam bội TriP1 cấy mô
Vật liệu: cây con dưa hấu tam bội TriP1 cấy mô được thuần dưỡng tại trại thực
nghiệm Đại học Cần Thơ
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức thừa số 2 nhân tố khối
hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 4 nghiệm thức với 2 liều lượng phân N (150 và 200 kg N/ha) và 2 mật độ trồng 8.750 cây/ha và 10.000 cây/ha, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp, mỗi lần lặp 7- 8 cây tương ứng với từng mật độ trồng Phân N bón như bố trí thí nghiệm kết hợp với P (200 kg P/ha), K (150 kg K/ha) và chia 3 lần bón: bón lót: ¼
Trang 13tổng lượng; bón thúc lần 1: ½ tổng lượng; bón thúc lần 2: ¼ tổng lượng còn lại Cụ thể, phân đạm sử dụng nguồn phân đạm Phú Mỹ (46% N), phân Kali loại hạt to Phú Mỹ (61% K), phân lân mịn Long Thành (16% P) Các chỉ tiêu theo dõi: tương
tự thí nghiệm 8
3.4 Phương pháp phân tích số liệu: các số liệu được xử lý trên excel và dùng
chương trình SPSS 16 để phân tích thống kê số liệu thí nghiệm, so sánh các trung bình nghiệm thức bằng phép thử Duncan cho các kiểu bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên và khối hoàn toàn ngẫu nhiên; kiểm định LSD cho các thí nghiệm 1, 7,
8 và 13
3.5 Sơ đồ tóm tắt các thí nghiệm
(1) Tạo cây dưa hấu tứ bội in vitro
2) Nhân dòng dưa hấu tứ bội in vitro
(2) Khảo sát 4 dòng tứ bội cấy mô ngoài đồng và lai tạo hạt tam bội (1 thí
nghiệm)
(3) Nhân dòng dưa hấu tam bội in vitro
(3) Khảo sát 2 dòng dưa hấu tam bội cấy mô ngoài đồng
(Cần Thơ, Hậu Giang) (2 thí nghiệm)
(4) Khảo sát liều lượng phân đạm (N) và mật độ trồng trên dòng dưa
hấu tam bội TriP1 cấy mô (1 thí nghiệm).
Xử lý với colchicine (4, 6, 8 ngày) Xử lý với oryzalin (48, 54 giờ)
Tạo chồi: môi trường có BA
(nồng độ khác nhau) (2 thí nghiệm)
Tạo rễ: môi trường có IBA và NAA
(nồng độ khác nhau) (3 thí nghiệm)
Tạo chồi: môi trường có BA (nồng
độ khác nhau) +/- than hoạt tính
(2 thí nghiệm)
Tạo rễ: môi trường có IBA (nồng
độ khác nhau) +/- than hoạt tính
(2 thí nghiệm)
Hình 3.1: Sơ đồ tóm tắt các thí nghiệm
Trang 14CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 Cảm ứng tạo thành cây dưa hấu tứ bội in vitro bằng colchicine và
oryzalin trên các dòng dưa hấu nhị bội
4.1.1 Mật số khí khẩu của các chồi dưa hấu đa bội: mật số khí khẩu trung
bình ở cây dưa hấu nhị bội đều cao hơn cây có hình thái đa bội ở cả 4 dòng dưa hấu Cụ thể: dòng TPS có số khí khẩu trung bình trên cây nhị bội là 233,7±24,4 khí khẩu/mm2, dòng TPB là 333,3±24,3 khí khẩu/mm2; dòng TPT là 273,3±17,8 khí khẩu/mm2; dòng TPX là 324,2±25,7 khí khẩu/mm2; trong khi số khí khẩu trung bình của cây có hình thái đa bội thấp hơn: dòng TPS là 139,5±19,1 khí khẩu/mm2, dòng TPB là 187,6±27,5 khí khẩu/mm2, dòng TPT là 184,4±27,6 khí khẩu/mm2, dòng TPX là 208±27,2 khí khẩu/mm2 Kết quả trên cho thấy cây có hình thái đa bội có mật số khí khẩu ít hơn do chiều dài khí khẩu dài hơn cây nhị bội Kết quả này phù hợp với nghiên cứu Lâm Ngọc Phương và Nguyễn Kim Hằng (2010), Nguyễn Văn Hiển (2000) cũng ghi nhận mật số khí khẩu của cây dưa hấu TPS nhị bội cao hơn so với cây đa bội, nhưng kích thước khí khẩu lại ngắn hơn
4.1.2 Tỷ lệ (%) cây dưa hấu TPS và TPT có hình thái đa bội sau khi xử lý colchicine: tỷ lệ cây đa bội được xác định dựa vào kiểu hình đa bội (thân to, lá to
và lá có màu xanh đậm) kết hợp với việc đếm mật số khí khẩu để xác định các cây
đa bội Kết quả cho thấy tỷ lệ khá cao ở các nghiệm thức xử lý colchicine và ở nghiệm thức không xử lý colchicine thì không xảy ra hiện tượng đa bội Cụ thể:
đối với dòng TPS, tỷ lệ cây đa bội đạt cao nhất ở nghiệm thức xử lý colchicine 4
ngày (32%) và tỷ lệ này giảm dần khi tăng thời gian xử lý colchicine Trong đó,
nghiệm thức 6 ngày đạt 18% và 8 ngày đạt 12% Đối với dòng TPT, tỷ lệ cây đa
bội đạt cao nhất ở nghiệm thức xử lý colchicine 6 ngày (25%), ở nghiệm thức xử lý colchicine 4 ngày đạt tỷ lệ cây đa bội thấp hơn (19%) và nghiệm thức 8 ngày cho
Cụ thể: dòng TPS, ở mức 48 giờ đạt 20,7% tỷ lệ cây có hình thái đa bội và 54 giờ đạt 29,1% Tương tự, dòng TPB, đạt 12,9% ở mức 48 giờ xử lý và 16,7% ở mức 54 giờ Dòng TPT, ở mức 48 giờ đạt 12,5% và mức 54 giờ đạt 19,3% Dòng TPX, 48 giờ xử lý đạt 15,1% và 54 giờ đạt 21,4%
4.1.4 Xác định cây dưa hấu tứ bội bằng phân tích dòng chảy tế bào
Xử lý với oryzalin: sau khi kiểm tra bằng phương pháp dòng chảy tế bào các
mẫu lá ở nghiệm thức không xử lý oryzalin đem phân tích có đỉnh 1C là 62,78-nội dung ADN trung bình trong tế bào trong tổng số 5 cây phân tích Ở nghiệm thức 54 giờ cho được cây tứ bội chiếm 4% với đỉnh 1C là 121,67 (nội dung ADN tăng gấp đôi so với nhị bội) là đa bội tạp chiếm 7% trong tổng số 74 cây đa bội phân tích Ở nghiệm thức xử lý oryzalin 48 giờ không cho được cây tứ bội mà chỉ toàn cây bội tạp chiếm 12% trong tổng số 59 cây đa bội phân tích
Xử lý với colchicine: kết quả phân tích cho thấy ở nghiệm thức không xử lý
colchicine các mẫu đều là cây nhị bội Ở nghiệm thức có xử lý colchicine 4 và 6