Tóm tắt Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu tạo giống gốc và thử nghiệm sản xuất vacxin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn từ chủng virus phân lập tại Việt Nam

Sản xuất thử nghiệm thành công vacxin vô hoạt PRRS từ giống gốc PRRS được tuyển chọn. Vacxin vô hoạt PRRS nghiên cứu sản xuất ra đạt các tiêu chí về vô trùng, thuần khiết, an toàn và hiệu lực.

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯

PHẠM VĂN SƠN

NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG GỐC VÀ THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TỪ CHỦNG VIRUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

Chuyên nga ̀nh: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi

Ma ̃ số: 9.64.01.02

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

HÀ NỘI, 2018

Công trình được hoàn thành tại:

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS TS Nguyễn Bá Hiên

2 TS Nguyễn Văn Cảm

Phản biện 1: GS.TS Nguyễn Quang Tuyên

Trường Đại học Nông lâm, Đại học Thái Nguyên

Phản biện 2: GS.TS Lê Thanh Hòa

Viện Công nghệ sinh học

Phản biện 3: PGS TS Phạm Công Hoạt

Bộ Khoa học và Công nghệ

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp

Học viện, họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Vào hồi 08h0 ngày 28 tháng 12 năm 2018

Có thể tìm hiểu Luận án tại thư viện:

- Thư viện Quốc gia

- Thư viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome – PRRS) hay bệnh tai xanh được đặc trưng bởi những rối loạn sinh sản của lợn nái và những vấn đề về đường hô hấp ở lợn con và lợn trưởng thành

(Meulenberg et al., 1993) Bệnh gây ra bởi virus PRRS, thuộc bộ Nidovirales, họ

Arteriviridae, chi Arterivirus (Cavanagh, 1997) Virus PRRS được nhóm thành hai kiểu gen, châu Âu (type 1) và Bắc Mỹ (type 2), các dấu hiệu lâm sàng của nhiễm trùng đều giống nhau, nhưng các chủng phân lập lại khác nhau về độc lực ở động vật nhiễm bệnh

(Halbur et al., 1995b) và khác nhau về đặc tính kháng nguyên, di truyền (Meng, 2000; Nelsen et al., 1999; Nelson et al., 1993) Dịch PRRS xuất hiện ở hầu hết các khu vực

chăn nuôi lợn quy mô lớn trên khắp thế giới Tổn thất hàng năm cho ngành chăn nuôi

lợn ở Hoa Kỳ do PRRSV gây ra ước tính khoảng 664 triệu USD (Holtkamp et al.,

2013) Đối với lợn nái, bệnh gây hậu quả nghiêm trọng như: lợn con sơ sinh yếu ớt, giảm số con sơ sinh sống sót/ổ, tình trạng bệnh âm ỉ, rối loạn sinh sản, động dục kéo dài, chậm động dục trở lại Đối với đực giống, số lượng tinh dịch giảm, chất lượng tinh

dịch kém, ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ thai và chất lượng đàn con (Pejsak et al., 1997)

Kháng thể kháng PRRSV lần đầu tiên được phát hiện ở Việt Nam năm 1997 trên một đàn lợn nhập từ Mỹ Từ năm 2007 đến nay, PRRS liên tục xảy ra và bùng phát ở rộng khắp các tỉnh thành trong cả nước gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi Tình hình PRRS ngày càng phức tạp đòi hỏi sự chủ động trong phòng chống dịch, trong đó phương pháp phòng PRRS hiệu quả nhất là sử dụng vacxin Tuy nhiên, sự đa dạng di truyền và thay đổi kháng nguyên của các chủng PRRSV là một trở ngại lớn trong việc phát triển một loại vacxin có hiệu quả để kiểm soát PRRS Các vacxin sống đã được sử dụng phổ biến để kiểm soát PRRS vì chúng có khả năng bảo vệ tốt hơn so với vacxin

đã vô hoạt hoặc các vacxin tái tổ hợp (Charerntantanakul, 2012; Hu and Zhang, 2014;

Kim et al., 2011; Zuckermann et al., 2007) Nhưng ngày càng có nhiều quan ngại về sự

an toàn của việc sử dụng vacxin sống vì sự hồi phục nhanh chóng độc lực của PRRSV

trong quá trình sao chép ở lợn (Hu and Zhang, 2014; Mengeling et al., 2003; Pejsak et al., 1997) Hiện nay, trước tình hình nước ta đang phải tốn rất nhiều chi phí cho các loại

vacxin ngoại nhập mà hiệu quả phòng bệnh chưa được như mong muốn Nhằm chủ động trong nguồn cung cấp vacxin hiệu quả cao, an toàn và giảm chi phí nhập khẩu vacxin, thì việc sản xuất được vacxin vô hoạt từ chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam là việc làm cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao Để sản xuất được vacxin hiệu quả cần phải có chủng giống gốc đại diện cho các chủng virus PRRS lưu hành ở Việt Nam, do vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu này Với mục tiêu lựa chọn được giống gốc, sản xuất được vacxin vô hoạt PRRS đạt tiêu chí an toàn, có hiệu lực cao để phòng bệnh cho lợn

1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

1.2.1 Mục tiêu chung

Sản xuất được vacxin vô hoạt PRRS có hiệu quả từ chủng virus phân lập tại Việt Nam

1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng virus PRRS cường độc phân lập từ lợn mắc PRRSở Việt Nam

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu

Phạm vi về không gian nghiên cứu: Các chủng virus PRRS được phân lập từ lợn

mắc PRRS thu thập tại các tỉnh: Hà Nội, Thái Bình, Nam Định, Hưng Yên, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, TP Hồ Chí Minh, Tiền Giang, Cần Thơ

Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y và

phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Thời gian nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện từ 2014-2017

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

Đề tài lần đầu tiên tuyển chọn được chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam để làm giống gốc sử dụng cho sản xuất vacxin vô hoạt phòng PRRS cho lợn Giống gốc PRRS được thẩm định tại cơ quan thú y có thẩm quyền và đạt các tiêu chí vô trùng, thuần khiết, có hiệu giá cao, có khả năng kích thích miễn dịch tốt, kháng thể do vacxin tạo ra có thể trung hòa được các chủng virus PRRS đang lưu hành ở Việt Nam

Đề tài của luận án đã đưa ra được một quy trình phân lập, sàng lọc và tuyển chọn giống gốc Trên cơ sở này, có thể áp dụng để tạo ra một chủng Master seed mới thay thế những chủng cũ không còn đáp ứng tính tương đồng kháng nguyên

Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm thành công vacxin vô hoạt PRRS từ chủng virus thực địa, đây là vacxin vô hoạt đầu tiên về PRRS của Việt Nam được nghiên cứu sản xuất Quy trình sản xuất vacxin vô hoạt PRRS có thể chuyển giao để sản xuất vacxin phòng PRRS cho đàn lợn, giúp người chăn nuôi giảm thiệt hại kinh tế do PRRS gây ra

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.5.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Những kỹ thuật, quy trình được áp dụng trong đề tài góp phần nâng cao năng lực nghiên cứu cho người làm trong lĩnh vực thú y Các kết quả nghiên cứu phản ảnh đầy

đủ về đặc điểm sinh học, sinh học phân tử, đặc tính kháng nguyên và tính sinh miễn dịch của các chủng virus PRRS đang lưu hành ở Việt Nam Cung cấp các thông tin tham khảo, tham chiếu cho các nhà khoa học nghiên cứu về virus PRRS ở Việt Nam cũng như trên thế giới

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Giống gốc được tuyển chọn là chủng virus PRRS đại diện cho các chủng virus đang lưu hành ở Việt Nam có thể sử dụng để sản xuất kháng thể đơn dòng, đa dòng, phục vụ sản xuất kháng thể trị bệnh cũng như kháng thể trong chẩn đoán bệnh Giống gốc có thể sử dụng để sản xuất kháng nguyên trong chế tạo Kít ELISA chẩn đoán bệnh, Kít phát hiện nhanh bệnh, góp phần vào công cuộc phòng và chống PRRS cho toàn ngành chăn nuôi

Đề tài đã nghiên cứu sản xuất thành công vacxin vô hoạt PRRS đạt các chỉ tiêu về

vô trùng, thuần khiết, an toàn và hiệu lực, đây là cơ sở quan trọng để ứng dụng nghiên cứu sản xuất các loại vacxin virus khác giúp nâng cao năng lực sản xuất vacxin vật nuôi của ngành Thú y nước nhà, hạn chế nhập khẩu vacxin

Vacxin vô hoạt PRRS có thể chuyển giao sản xuất trên quy mô công nghiệp, tạo

ra một vacxin có hiệu quả và rẻ so với các vacxin nhập ngoại trên thị trường, góp phần khống chế dịch bệnh, giảm thiệt hại cho ngành chăn nuôi

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 LỊCH SỬ VÀ TÌNH HÌNH DỊCH PRRS Ở LỢN

2.1.1 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn trên thế giới

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn được ghi nhận lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1987 với tên là "bệnh bí hiểm" (Mystery swine disease) bởi tính tự nhiên khó hiểu của bệnh nguyên Hội nghị quốc tế về bệnh này được tổ chức tại St Paul, Minnesota đã nhất trí dùng tên PRRS và đã được Tổ chức Thú y thế giới công nhận chính thức gọi là

"Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên lợn" (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome-PRRS), căn nguyên bệnh được gọi là virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus - PRRSV)

2.1.2 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn tại Việt Nam

Lần đầu tiên trong lịch sử vào năm 1997, kháng thể kháng PRRSV được phát hiện trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh miền Nam Kết quả kiểm tra thấy, 10/51 lợn giống nhập khẩu có huyết thanh dương tính với PRRS Toàn bộ số lợn này đã được xử

lý vào thời gian đó Tuy nhiên, trong những năm tiếp theo, các nghiên cứu về bệnh trên những trại lợn giống tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau từ 1,3% cho tới 68,29% (Cục Thú y, 2008)

2.2 CĂN BỆNH

2.2.1 Cấu trúc virus PRRS

Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRSV) thuộc chi Arterivirus,

họ Arteriviridae, bộ Nidovirales Hạt virus thường có hình oval với đường kính xấp xỉ

60nm và bề mặt có gai được cấu tạo từ phức hợp protein màng Virus PRRS là virus sợi đơn dương với kích thước phân tử 15,1- 15,5 kb (Dokland, 2010) Genome của virus PRRS có kích thước khoảng 15kb, gồm ít nhất 10 khung đọc mở ORF (open reading frames): ORF1a, ORF1b, ORF2, ORF2b, ORF3, ORF4, ORF5, ORF5a, ORF6, ORF7

mã hóa cho các protein cấu trúc và phi cấu trúc

2.2.2 Phân loại virus PRRS

Hiện nay, PRRSV đã được xác lập với 2 kiểu gen chính là kiểu gen có nguồn gốc

từ châu Âu (EU) và kiểu gen có nguồn gốc từ Bắc Mỹ (NA) Việc so sánh chuỗi gen đã cho thấy sự khác biệt di truyền quan trọng giữa 2 nhóm này

2.2.3 Khả năng gây bệnh và sức đề kháng của virus PRRS

Về mặt độc lực, người ta thấy PRRSV tồn tại dưới 2 dạng:

▪ Dạng cổ điển: có độc lực thấp, ở dạng này khi lợn mắc bệnh thì tỷ lệ chết thấp, chỉ từ 1% - 5% trong tổng đàn

▪ Dạng biến thể độc lực cao: gây nhiễm và chết nhiều lợn

2.3 TRUYỀN NHIỄM HỌC

2.3.1 Loài vật mắc bệnh

Lợn ở mọi lứa tuổi, người và các động vật khác không mắc bệnh, tuy nhiên trong các loài thuỷ cầm chân màng, vịt trời (Mallard duck) lại mẫn cảm với virus

2.3.2 Chất chứa mầm bệnh và quá trình truyền lây

Virus có trong dịch mũi, nước bọt, phân, nước tiểu của lợn ốm, hoặc mang trùng

và phát tán ra môi trường Tinh dịch của lợn đực giống cũng được xác định là nguồn phát tán mầm bệnh

2.3.3 Cơ chế sinh bệnh, phương thức truyền lây và đáp ứng miễn dịch

2.3.3.1 Cơ chế sinh bệnh

Virus có ái lực cao với đại thực bào, đặc biệt là đại thực bào phế nang Vì vậy, virus nhân lên trong đại thực bào, sau đó giết chết đại thực bào Có tới 40% đại thực bào bị phá hủy PRRSV loại bỏ phần lớn cơ chế bảo vệ của cơ thể, cho phép vi khuẩn, virus khác tăng sinh và gây hại

2.3.3.2 Phương thức truyền lây

Bệnh có thể lây lan trực tiếp thông qua sự tiếp xúc giữa lợn ốm, lợn mang trùng với lợn khoẻ và có thể lây gián tiếp qua các nhân tố trung gian bị nhiễm virus như: dụng cụ, thiết bị chăn nuôi; các phương tiện vận chuyển; các loài côn trùng; các loài có

vú khác và gia cầm (Tô Long Thành, 2007)

2.3.3.3 Đáp ứng miễn dịch

Về khả năng bảo hộ chéo của các type PRRSV vacxin với các type PRRSV khác cũng còn nhiều ý kiến chưa thống nhất Kovacs and Schagemann (2003) báo cáo rằng vacxin sống Ingelvac- PRRS MLV (chủng Bắc Mỹ) có khả năng bảo hộ chéo khi công cường độc bằng virus PRRS chủng châu Âu Tài liệu hướng dẫn sử dụng vacxin JXA1-

R (Ngô Thanh Long, 2011) cũng cho biết, vacxin này (chứa virus Bắc Mỹ biến đổi) có khả năng bảo hộ lợn phòng PRRS do chủng Bắc Mỹ cổ điển gây ra

2.4 TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH

2.4.1 Triệu chứng lâm sàng

Triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PRRS rất thay đổi và phụ thuộc vào chủng virus, trạng thái miễn dịch của đàn, điều kiện quản lý chăm sóc Thời gian nung bệnh từ 3-5 ngày Các dấu hiệu đầu tiên là bỏ ăn, sốt, xanh da Các triệu chứng tiếp theo tùy thuộc vào tuổi lợn và giai đoạn mang thai (Tô Long Thành, 2007)

2.4.2 Bệnh tích

Bệnh tích biến đổi chủ yếu ở phổi Thuỳ phổi bị bệnh màu đỏ xám, có mủ và đặc chắc (nhục hoá) Bề mặt cắt ngang của thuỳ phổi lồi ra, khô và xuất hiện những nốt loét trên các cơ quan nội tạng (Lê Văn Năm, 2007)

2.5 CHẨN ĐOÁN VÀ PHÒNG TRỊ BỆNH

2.5.1 Chẩn đoán

2.5.1.1 Chẩn đoán lâm sàng

Chẩn đoán lâm sàng dựa vào hai nhóm triệu chứng:

+ Triệu chứng đường sinh sản: Trong giai đoạn đầu của ổ dịch có thể thấy hiện tượng sảy thai ở cuối thời kỳ mang thai, lợn nái đẻ non, thai yếu, thai chết lưu hoặc thai

gỗ, lợn con đẻ ra yếu, lợn chết trước khi cai sữa

+ Triệu chứng đường hô hấp: Lợn có triệu chứng viêm phổi và lây lan rất nhanh trong đàn

2.5.1.2 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

+ Phân lập virus trên một số tế bào: Tế bào phế nang của lợn, tế bào MA- 104,

CL 2621, CRL-17171, MARC-145

+ Phương pháp bệnh lý miễn dịch

+ Phương pháp huỳnh quang gián tiếp phát hiện kháng nguyên

+ Phương pháp nhân gen (PCR)

+ Phương pháp lai phân tử tại chỗ (institu hybridization)

- Giải trình tự gen NSP2 và ORF5 của PRRSV

- Gây bệnh thực nghiệm: Sử dụng lợn con 21 ngày tuổi trong cùng một đàn; không mang PRRSV (PRRSV-Ag) và không có kháng thể PRRSV (PRRSV-Ab); tiêm

cơ 0,5 ml/con; nhỏ mũi 1 ml/con

2.5.2 Các biện pháp phòng trị bệnh

2.5.2.1 Điều trị PRRS

Hiện nay chưa có thuốc đặc trị với PRRS, để làm giảm thiệt hại của bệnh, chủ yếu theo hướng nâng cao sức đề kháng cho vật nuôi, chữa các triệu chứng lâm sàng, giảm nhẹ và tập trung vào điều trị các bệnh kế phát

2.5.2.2 Một số chế phẩm vacxin PRRS được dùng để phòng bệnh hiện nay

Hiện nay, tại Việt Nam có 8 loại vacxin PRRS đã và đang được phép lưu hành

2.6 GIỐNG GỐC TRONG SẢN XUẤT VACXIN

2.6.1 Định nghĩa

Giống gốc (Master seed - MS) là một lượng virrus cụ thể đủ lớn mà sự thuần khiết, an toàn và tính kháng nguyên của chính cũng như của các thế hệ sau đã được thử nghiệm, chứng minh và được dùng làm giống để chế tạo vacxin

2.6.4 Các phương pháp bảo quản giống gốc PRRSV trong phòng thí nghiệm

2.6.4.1 Phương pháp cấy chuyển virus PRRS liên tục trên tế bào MARC-145

Virus PRRS rất thích hợp phát triển trên tế bào MARC-145, sau khi cấy chuyển

có thể bảo quản ở nhiệt độ thích hợp Phương pháp này chỉ được lặp lại trong thời hạn nhất định, thường được áp dụng trong các trường hợp dùng liên tục virus PRRS để nghiên cứu và làm thí nghiệm (thường chỉ cấy chuyển 4 đời sau đó sẽ chuyển thành giống sản xuất - working seed)

2.6.4.2 Phương pháp đông khô virus

Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các đối tượng vi sinh vật khác nhau trong đó có virus PRRS

2.6.4.3 Phương pháp đông khô dịch thể trực tiếp

Phương pháp này nhanh và thuận lợi cho các đợt bảo quản số lượng mẫu lớn Thông thường theo phương pháp này, virus có thể được bảo quản từ 10-20 năm

2.6.4.4 Phương pháp bảo quản lạnh sâu

Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì virus được bảo quản trong môi trường dịch thể ở nhiệt độ lạnh sâu (-196°C -> -80°C)

2.7 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACXIN PHÒNG PRRS

2.7.1 Sản xuất vacxin bằng phương pháp vô hoạt virus

Vacxin vô hoạt thường được sử dụng nhằm phòng chống bệnh tai xanh ở các đàn lợn nái, hoặc ở các trại lợn chưa từng xuất hiện bệnh tai xanh Việc sản xuất vacxin vô hoạt được thực hiện bằng cách phân lập và nuôi cấy các chủng PRRSV thực địa trong môi trường tế bào và tiến hành vô hoạt chúng bằng một số chất vô hoạt như BEI, formaline hoặc β propiolactone

2.7.2 Sản xuất vacxin bằng phương pháp nhược độc virus trên môi trường tế bào

Về nguyên lý chung, để tạo được chủng virus PRRS nhược độc dùng làm vacxin, các chủng virus PRRS cường độc được cấy truyền nhiều đời trên môi trường

tế bào Cụ thể, để làm chủng virus PRRS cường độc thành chủng virus PRRS nhược độc, công ty Boehringer–Ingelheim Corp đã cấy truyền 37 đời, công ty Hippra Corp

đã cấy truyền 20 đời

2.7.3 Phương pháp sản xuất vacxin thế hệ mới

Vacxin DNA, sử dụng các khung đọc mở, từ ORF1 cho đến ORF7 để chế tạo vacxin Vacxin dưới đơn vị (subunit): dùng protein của virus để chế vacxin, ví dụ như dùng GP5 Vacxin peptide tổng hợp: GP5.Vacxin vector: dùng nhiều loại virus, vi khuẩn làm vector tái tổ hợp Tất cả các vacxin thử nghiệm này đều không cho kết quả vượt trội nào, đều chưa đạt được mục tiêu phòng bệnh của một vacxin

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y, phòng thí nghiệm bộ môn

Vi sinh vật truyền nhiễm, Khu nuôi động vật thí nghiệm - Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Thời gian nghiên cứu từ năm 2014 đến năm 2017

3.2 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Lợn nghi mắc PRRS, các chủng virus PRRS cường độc phân lập từ các lợn mắc PRRS ở Việt Nam

3.2.2 Vật liệu nghiên cứu

Máy móc, thiết bị được sử dụng trong đề tài : Box an toàn sinh học Cấp II (Esco), tủ

ấm CO2 (Memmert), kính hiển vi soi ngược (Leica), máy PCR (Biorad), máy giải trình tự gen (Backman Counter), máy điện di, máy votex (IKa), máy ly tâm (eppendorf), tủ -80oC (Sanyo), máy đồng hóa tạo nhũ, hệ thống Bioreactor, máy lọc tiếp tuyến, máy đọc ELISA (Bioteck), kính hiển vi thường (Zeiss)

Dụng cụ: Pipet (Eppendorf), đầu típ các loại (Corning), bình nuôi cấy tế bào T25, T75, T225 (Corning), màng lọc (corning), khay 96 (Corning), ống eppendorf, ống ly tâm 15ml, 50ml (corning), bơm tiêm, găng tay, khẩu trang

Hóa chất: môi trường nuôi cấy tế bào DMEM (Gibco), tế bào dòng MARC-145, kít tách chiết RNA, DNA (Qiagen), Kít PCR/RT-PCR (Invitrogen), kít Realtime - PCR (Invitrogen), kít giải trình tự gen (Backman Counter), Kít ELISA (Idexx), hóa chất cho nuôi cấy tế bào, hóa chất cho kỹ thuật IPMA, hóa chất vô hoạt virus (Merk), nhũ dầu (Seppic)

3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu biến đổi bệnh lý của lợn ở những ổ dịch PRRS và thu thập mẫu

- Phân lập và tuyển chọn chủng giống gốc PRRSV

- Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt nhũ dầu phòng PRRS

3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.4.1 Phương pháp mổ khám

Trong nghiên cứu này, quá trình mổ khám được thực hiện theo TCVN 8402:2010

3.4.2 Phương pháp RT – PCR

Quy trình tách chiết RNA của virus dùng KIT của hãng Qiagen Sản phẩm của phản ứng RT - PCR sẽ được kiểm tra bằng phương pháp điện di Kết thúc điện di, bản gel được lấy ra nhuộm Ethidium bromide hoặc SYBR green trong khoảng 5 đến 7 phút Sau khi nhuộm bản gel được chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết quả điện di Vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng những vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả

3.4.4 Phương pháp nuôi cấy tế bào

Tế bào MARC-145 được nuôi cấy trong môi trường đầy đủ DMEM, 10% FBS

3.4.5 Phương pháp nhân virus PRRS

Tiến hành nhân virus trên tế bào MARC-145 khi tế bào được nuôi cấy trong bình nuôi T25 có độ che phủ đáy bình 60 - 70% Loại bỏ môi trường nuôi cấy cũ và rửa tế bào 2 lần bằng PBS1X Bổ sung 0,5ml virus gốc/T25 Ủ virus và tế bào trong 1h ở

370C Sau khi ủ loại bỏ dịch ủ và bổ sung 5 ml môi trường duy trì DMEM 2% FBS Nuôi virus trong tủ ấm 370C, 5% CO2, quan sát biến đổi bệnh tích tế bào MARC-145 dưới kính hiển vi soi ngược sau 24h, 48h, 60h, 72h Thu virus khi bệnh tích tế bào đạt 80%

3.4.6 Phương pháp xác định hiệu giá virus

TCID50 được xác định theo phương pháp của Spearman Kaber

Lg TCID50 = (Xo + d/2) - d × (∑ri/n) Trong đó: Xo là lg của bậc pha loãng virus cao nhất

d: là lg của bậc pha loãng ri: là số giếng tế bào âm tính ở mỗi bậc pha loãng n: là số giếng tế bào được gây nhiễm ở mỗi bậc pha loãng

3.4.7 Phương pháp xác định quy luật sinh trưởng của virus

Tế bào MARC-145 được chuẩn bị vào những khay 96 giếng (5×104 tế bào/giếng)

và được nuôi như mô tả ở trên Virus PRRS được gây nhiễm lên tế bào ở MOI 0,01 Sau một giờ ủ, để virus bám vào tế bào, huyễn dịch chứa virus được hút bỏ và môi trường nuôi dưỡng được rửa sạch một lần với 0,5ml PBS Sau đó, dung dịch nuôi dưỡng thiết yếu được bổ sung vào môi trường nuôi cấy 100µl/giếng Virus được thu từ dịch nổi và phần tế bào ở các thời điểm 24, 48, 60, 72, 84, 96 giờ sau gây nhiễm virus Tiến hành xác định hiệu giá những ống virus đã thu để định lượng virus Đường biểu biễn sự nhân lên của virus được xây dựng có biến là log của TCID50 tại mỗi thời điểm thu virus

3.4.8 Phương pháp giải trình tự gen

Sử dụng máy giải trình tự gen tự động Beckman Coulter CEQ 8000 (Mỹ) thí nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm trung tâm Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Nguyên tắc chung của máy giải trình tự gen tự động là dựa theo cơ

sở của phương pháp Sanger Khi sợi DNA được tổng hợp sẽ sử dụng các nucleotide

có gắn thuốc nhuộm huỳnh quang, các nucleotide khác nhau tiếp nhận thuốc nhuộm huỳnh quang khác nhau khi đọc bằng tia laser cho hiển thị màu tương ứng, trong đó Adenin cho màu đỏ, Thymine cho màu xanh, Guanine cho màu xanh lá cây, Cytosine cho màu đen

3.4.9 Phương pháp tinh chế kháng nguyên virus và định lượng protein

Hỗn hợp dịch kháng nguyên thu được để trong khay đá vảy để đảm bảo chất lượng kháng nguyên, ly tâm ở tốc độ cao 35.000 vòng/4oC/2 giờ để thu cặn virus Lấy cặn thu được hoà tan trong PBS 1X được hỗn dịch kháng nguyên Hỗn dịch này sẽ được ly tâm tốc độ cao (35.000 vòng/4oC/2 giờ) qua gradient đường với các nồng độ khác nhau (10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%) Thu vạch band xuất hiện sau khi ly tâm, đây chính là kháng nguyên virus

3.4.10 Phương pháp gây tối miễn dịch trên chuột

Hỗn hợp kháng nguyên/nhũ dầu với tỷ lệ 1/1,5 Kháng nguyên gốc được pha trong PBS 1x theo tỷ lệ tùy mẫu kháng nguyên

Nhũ dầu (Adjuvant) loại complete hoặc incomplete, loại complete dùng cho lần gây nhiễm virus đầu tiên với từng lô thí nghiệm, loại incomplete thì dùng cho những lần gây nhiễm tiếp theo (lần 2, lần 3) Tiêm dưới da vùng lưng, hông (đối với chuột lang) của từng chuột thí nghiệm, phân bố tiêm ở 2, 3 vị trí khác nhau với lượng kháng nguyên đã chuẩn bị

Sau khi tiêm thì tiến hành đánh dấu và ghi chép lại để theo dõi Hai tuần sau, gây nhiễm lần 2 để tăng cường đáp ứng miễn dịch trên chuột, hai tuần tiếp theo gây nhiễm lần 3 Cuối cùng sau 2 tuần tiếp thì tiến hành gây mê, lấy máu, thu kháng thể và mổ khám chuột thí nghiệm

3.4.11 Phương pháp trung hòa virus (phương pháp virus cố định và huyết thanh pha loãng)

Tiến hành pha loãng huyết thanh theo cơ số 2 và sử dụng virus trung hòa ở nồng độ 100TCID50/mL Huyết thanh đã pha loãng trộn với virus và giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, mỗi độ pha loãng gây nhiễm cho 5 giếng tế bào MARC-145 Đọc kết quả: hiện tượng trung hòa được xác định theo bệnh tích trên tế bào một lớp cảm thụ Virus được trung hòa khi không có bệnh tích tế bào trên tế bào cảm thụ MARC-145 Virus không được trung hòa khi xuất hiện bệnh tích tế bào trên giếng tế bào MARC-145

3.4.12 Phương pháp IPMA

Phát hiện kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh bằng phản ứng kháng nguyên kháng thể trên môi trường tế bào MARC-145

3.4.13 Phương pháp kiểm tra vô trùng của giống PRRS (Master seed và Working seed)

Phương pháp kiểm tra

Mỗi mẫu giống gốc hoặc virus được cấy vào các loại môi trường thạch thường, nước thịt, thạch máu, nước thịt gan yếm khí và thạch nấm Mỗi loại môi trường cấy 4 ống/mẫu Đến cuối quá trình theo dõi mà tất cả các ống thử đều trong suốt, mầu sắc môi trường không đổi, kết quả là âm tính

3.4.14 Phương pháp kiểm tra thuần khiết của giống (Master seed và Workingseed) bằng kỹ thuật PCR/RT-PCR

Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện các loại virus Lở mồm long móng, PCV2, dịch tả lợn, PED, TGE

3.4.15 Phương pháp nuôi cấy tế bào MARC-145 trên hệ thống Bioreactor

Virus PRRS được nhân sinh khối lớn trên hệ thống túi nuôi có điều chỉnh nhiệt độ

và tốc độ lắc

3.4.16 Phương pháp cô đặc virus PRRS bằng máy lọc tiếp tuyến

Virus sau khi được nhân lên với số lượng lớn được cô đặc bằng máy lọc tiếp tuyến Sau cô đặc tiến hành xác định lại hiệu giá virus Mỗi một lần cô đặc có thể lọc tiếp tuyến tối đa một lít virus, sau khi lọc thu được 500µl virus đã cô đặc và hiệu giá virus thường tăng 101 so với trước lọc

3.4.17 Phương pháp vô hoạt virus

Virus vacxin PRRS thu hoạch từ môi trường tế bào Marc 145 được lọc, cô đặc và vô hoạt bằng formalin ở nồng độ thích hợp nhất Dung dịch virus sau khi vô hoạt được đánh giá kết quả vô hoạt theo quy trình kiểm tra sau vô hoạt nêu dưới đây

3.4.18 Phương pháp kiểm tra sau vô hoạt

Sau khi trung hoà lấy 0,1 ml dung dịch virus đã vô hoạt cấy vào môi trường tế bào MARC-145, để ở 370C và theo dõi bệnh tích tế bào trong 12h, 24h, 36h, 48h, 60h, 72h Nếu mẫu dung dịch virus nào có gây bệnh tích tế bào thí có nghĩa là virus chưa được vô hoạt hoàn toàn cần tiến hành vô hoạt lại Mẫu nào không gây bệnh tích

tế bào có nghĩa là virus đã được vô hoạt cần lặp lại thí nghiệm lần 2 để có kết luận chính thức

3.4.19 Phương pháp nhũ hóa vacxin

Sau khi vô hoạt thành công tiến hành phối trộn hỗn dịch virus đã vô hoạt với chất

bổ trợ Hỗn dịch virus vacxin được phối trộn với chất bổ trợ theo tỉ lệ 1:1 Đồng hóa hỗn hợp này trong máy trộn tá dược (máy đồng hóa T18D của hãng IKA) ở 40C trong thời gian tối thiểu 30 phút Kiểm tra hỗn hợp vacxin vô hoạt bằng cách để ở 20C -80C qua đêm Hỗn hợp đồng nhất, không phân lớp, không lắng cặn không tách nước là đạt yêu cầu Nếu hỗn hợp vẫn tách nước và phân lớp thì tiếp tục chạy máy đồng hóa cho đến khi đạt

3.4.20 Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết của vacxin

Theo TCVN8684:2011

3.4.21 Kiểm tra chỉ tiêu an toàn

Theo TCVN8684:2011

3.4.22 Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của vacxin

trên phần mềm Excel 2010

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ BIỂU HIỆN BỆNH LÝ CỦA LỢN MẮC PRRS 4.1.1 Kết quả thu thập mẫu bệnh phẩm

Để phục vụ việc tuyển chọn virus PRRS làm giống sản xuất vacxin, chúng tôi tiến hành thu thập mẫu lợn nghi mắc PRRS từ thực địa Kết quả thu được 57 lợn nghi mắc PRRS Kết quả cho thấy các nhóm lợn được nghiên cứu đều biểu hiện các triệu chứng như sốt cao, bỏ ăn, thân ửng đỏ, tiêu chảy, tai thâm tím, chảy nước mũi

4.1.2 Kết quả chẩn đoán PRRS bằng phương pháp RT-PCR

Từ 57 lợn được thu thập, để khẳng định chính xác lợn mắc PRRS chúng tôi sử dụng kỹ thuật RT- PCR Kết quả chẩn đoán PRRS bằng kỹ thuật RT - PCR được trình bày ở bảng 4.1

Bảng 4.1 Kết quả phản ứng RT-PCR chẩn đoán PRRS

(con)

Dương tính (con)