Luận án được nghiên cứu với mục tiêu nhằm đánh giá được sự đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum cassia Presl) thu thập tại miền Bắc Việt Nam và tinh sạch được một số cấu trúc hóa học có hoạt tính kháng sinh, kháng ung thư và các gen liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces cavourensis YBQ59.
Trang 1viÖn c«ng nghÖ sinh häc
VŨ THỊ HẠNH NGUYÊN
NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG, KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH
CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY QUẾ (Cinnamomum cassia Presl) Ở VIỆT NAM VÀ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA HOẠT CHẤT TỪ CHỦNG Streptomyces cavourensis YBQ59
Chuyên ngành : Vi sinh v ật học
tãm t¾t luËn ¸n tiÕn sÜ sinh häc
hµ néi - 2019
Trang 2Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS TS Phí Quy ết Tiến
Viện Công nghệ sinh học
Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2019
Có th ể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Thư viện Viện Công nghệ sinh học
- Trang web c ủa Bộ GD&ĐT
Trang 3thấy đã sinh tổng hợp 10.400 hợp chất Vì vậy, sự đa dạng của xạ khuẩn trong tự nhiên nói chung và XKNS nói riêng rất phong phú, hứa hẹn tiềm năng khai thác và ứng dụng các hợp chất có hoạt tính sinh học sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn trong nhiều lĩnh vực của đời sống Ngoài ra, nhiều chất trao đổi thứ cấp có hoạt tính sinh học từ
xạ khuẩn được sinh tổng hợp bởi các enzyme polyketide synthase (PKS) và nonribosomal peptide synthetase (NRPS) nên việc nghiên cứu những gen pks, nrps
liên quan đến quá trình trao đổi chất thứ cấp rất hữu ích trong việc đánh giá tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng sinh (CKS) từ xạ khuẩn (Ayuso và cs., 2005) Cho đến nay,
rất ít nghiên cứu về tài nguyên XKNS trên cây dược liệu Việt Nam được công bố và
cần được nghiên cứu nhằm bảo tồn, lưu giữ và khai thác nguồn gen VSV bản địa
Trong y học cổ truyền Việt Nam tinh dầu của cây quế (Cinnamomum sp.) đã được
chứng minh có hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm và chống ung thư (Singh và cs., 1995; Tariq và cs., 2006) nhưng các nghiên cứu về XKNS trên cây quế chưa được công bố nhiều Trong nghiên cứu này, các XKNS được phân lập trên các môi trường chọn lọc và đa dạng sinh học của XKNS được đánh giá qua đặc điểm sinh học, phân bố, khả năng sinh kháng sinh và đặc điểm di truyền Các chủng XKNS có hoạt tính kháng VSV kiểm định, ức chế phát triển tế bào ung thư phổi, mang các gen
chức năng pks-I, pks-II, nrps được sàng lọc Từ đó, nghiên cứu xác định điều kiện nuôi cấy phù hợp và tách chiết, tinh sạch các hợp chất và giải trình tự, lắp ráp de novo, dự đoán và chú giải hệ gen của XKNS được tuyển chọn để tìm kiếm thông tin
về những gen liên quan đến quá trình tổng hợp kháng sinh Từ những lý do trên
nghiên cứu sinh thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sự đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum cassia Presl) ở Việt Nam
và đặc tính sinh học của hoạt chất từ chủng Streptomyces cavourensis YBQ59”
Trang 41 M ục tiêu
Đánh giá được sự đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum cassia Presl) thu thập tại miền Bắc Việt Nam và tinh sạch được một số cấu trúc hóa học có hoạt tính kháng sinh, kháng ung thư và các gen liên
quan đến sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces cavourensis YBQ59
2 N ội dung nghiên cứu
- Phân lập và nghiên cứu sự đa dạng sinh học của các chủng XKNS trên cây quế
(C cassia Presl) thu thập tại các điểm thuộc tỉnh Hòa Bình, Yên Bái và Lai Châu
- Tuyển chọn xạ khuẩn sinh chất kháng sinh hoạt tính cao và xác định một số gen
liên quan đến tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn
- Nghiên cứu đặc điểm di truyền, lên men, tách chiết và xác định một số cấu trúc
kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces cavourensis YBQ59
3 Nh ững đóng góp mới của luận án
- Là nghiên cứu đầu tiên, có hệ thống về đa dạng, sinh tổng hợp chất kháng sinh của XKNS trên cây quế (C cassia Presl) tại miền Bắc Việt Nam
- Sàng lọc được chủng Streptomyces cavourensis YBQ59 sinh kháng sinh phổ
rộng và phân lập được 8 hợp chất kháng sinh: 1-monolinolein (1), bafilomycin (2), nonactic acid (3), daidzein (4 ), 3′-hydroxydaidzein (5), 5,11-epoxy-10-cadinanol (6), prelactone B (7), daucosterol (8 ), trong đó các hợp chất 1, 3-8 được phát hiện lần đầu
từ loài S cavourensis và hợp chất 1, 2 có hoạt tính kháng vi khuẩn kháng kháng sinh
cao (MIC50 8,5-30,3 µg/ml) và ức chế phát triển ba dòng tế bào ung thư A549, MCF, Hep3B (IC50 3,6-24,7 µM)
4 B ố cục của luận án
Luận án gồm 150 trang: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (32 trang, 3 bảng, 6 hình); Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (11 trang); Chương 3: Kết quả nghiên cứu (37 trang, 10 bảng, 20 hình); Chương 4: Bàn luận kết quả (28 trang, 8 hình); Kết luận và kiến nghị (2 trang); Danh mục các công trình công
bố (2 trang); Tóm tắt luận án bằng tiếng Anh (7 trang); Tài liệu tham khảo (28 trang với 7 tài liệu tiếng Việt, 243 tài liệu tiếng Anh); Phụ lục (63 trang)
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Thuật ngữ nội sinh “endophytic” được đưa ra bởi de Bary (1866), theo định nghĩa của ông, “VSV nội sinh là những VSV sống bên trong các mô thực vật và có sự khác
biệt đáng kể so với những loại VSV được tìm thấy trên bề mặt thực vật” Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ XKNS được chứng minh là rất đa dạng về mặt số lượng
và hoạt tính sinh học như các chất kiểm soát sinh học, chất kháng VSV gây bệnh, kháng nấm, tiêu diệt tế bào ung thư, kháng viêm, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất
diệt cỏ, chất kích thích sinh trưởng (Bacon và White, 2000; Qin và cs., 2011) Cho
Trang 5đến nay rất nhiều kháng sinh mới được tìm ra như munumbicin A-D (Castillo và cs., 2002), celastramycin A-B (Pullen và cs., 2002), kakadumycin (Castillo và cs., 2003)
và demethylnovobiocin (Igarashi, 2004) từ XKNS hiện đang có các ứng dụng trong nông nghiệp, công nghiệp và y dược (Golinska và cs., 2015)
XKNS là một trong những nhóm VSV rất đa dạng và còn ít được nghiên cứu, có khả năng sinh ra những chất có ích cho cây chủ (Golinska và cs., 2015; Nalini và Prakash, 2017) Theo quan niệm đó, sự đa dạng sinh học của XKNS là sự đa dạng về thành phần loài, chi về các taxon, nhưng đồng thời cũng là một sự đa dạng về các hợp chất tự nhiên có hoạt tính do chúng sinh ra XKNS rất đa dạng và mức độ đa dạng có
thể thay đổi giữa các vùng lấy mẫu và các loài thực vật khác nhau Sự đa dạng về chi
và số lượng xạ khuẩn nội sinh phần lớn phụ thuộc vào phương pháp và môi trường phân lập (Qin và cs., 2011; Nalini và Prakash, 2017) Nghiên cứu này không những
mở ra hướng nghiên cứu mới về VSV học ứng dụng ở Việt Nam, mà còn góp phần quan trọng trong việc xác định được mức độ đa dạng sinh học nguồn tài nguyên XKNS trên một số cây dược liệu của Việt Nam Việc phát hiện được các nguồn gen
xạ khuẩn mới, tiềm năng nhằm ứng dụng và phát triển các sản phẩm chuyển hóa thứ
cấp do chúng sản sinh trong lĩnh vực nông nghiệp, y dược và thực phẩm một cách
bền vững, không dẫn đến việc huỷ hoại cây chủ, bảo vệ sự đa dạng tài nguyên thực
vật cũng như VSV của Việt Nam là cấp thiết
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 V ật liệu
- M ẫu nghiên cứu: 9 mẫu (rễ, thân, lá) cây quế thu thập từ xã Thung Nai, Cao
Phong, Hòa Bình (20°47’21”N;105°21’20”E) ở độ cao 399 m, tháng 12/2013; 9 mẫu
từ xã Tân Hợp, Văn Yên, Yên Bái (21°53’14”B;104°35’9”Đ) ở độ cao 700 m, tháng 02/2014 và 9 mẫu từ xã Phăng Sô Lin, Sìn Hồ, Lai Châu (22°21’41”B;103°16’4”Đ) ở
độ cao 800 m, tháng 02/2014 Mẫu thực vật Cinnamomum cassia Presl được lưu trữ
tiêu bản và phân loại vào tháng 01/2106 bởi TS Nguyễn Thế Cường tại Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện HL KH&CN VN
- Các ch ủng VSV kiểm định: Salmonella enterica subsp enterica serovar
Typhimurium ATCC 14028 (viết rút gọn Salmonella Typhimurium ATCC 14028), Escherichia coli ATCC 11105, Sarcina lutea ATCC 9341, Bacillus cereus ATCC
11778, Proteus vulgaris ATCC 49132, Pseudomonas auroginosa ATCC 9027, Candida albicans ATCC 10231, Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Staphylococcus epidermidis kháng methicilin (MRSE) ATCC 35984 và Staphylococcus aureus kháng methicilin (MRSA) ATCC 33591 nhận từ Bộ sưu tập
Trang 6giống VSV của Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
- Các dòng t ế bào ung thư: Hep3B (tế bào ung thư gan ở người); MCF7 (tế bào
ung thư vú người) và A549 (ung thư phổi ở người) được cung cấp bởi GS Hyung Lee, trường ĐHQG Kangwon, Hàn Quốc
Jeong-2.2 P hương pháp nghiên cứu
1 Xử lý bề mặt mẫu thực vật và phân lập XKNS theo Qin và cs (2009)
2 Đánh giá sự đa dạng di truyền DNA bằng phản ứng BOX-PCR (Nurjasmi và cs., 2009)
3 Xác định hoạt tính kháng VSV kiểm định theo phương pháp của Saadoun và Muhana (2008) và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC50) theo Andrews (2001)
4 Đánh giá khả năng sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline của các chủng xạ khuẩn bằng phép thử màu theo Trease và Evans (1996)
5 Xác định gen mã hóa PKS-I, PKS-II và NRPS được khuếch đại bằng phản ứng PCR dựa trên 3 bộ mồi suy biến K1F ⁄M6R, KSaF ⁄KSaR, A3F ⁄A7R theo Li và
cs (2008)
6 Xác định hoạt tính gây độc tế bào bằng phương pháp so mầu MTT dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) theo Cree (2011)
(3-(4,5-7 Phân loại VSV bằng phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA theo Sambrook và
cs (2001); so sánh độ tương đồng bằng phần mềm Clustal W (Thompson và cs., 1997); cây phát sinh loài theo phương pháp Maximum-likelihood, thuật toán gamma và Kimura 2 với giá trị bootstrap 1000 (Felsenstein, 1985; Tamura và cs., 2013)
8 Xác định đặc điểm sinh học của xạ khuẩn và định tên xạ khuẩn theo Sổ tay phân
loại VSV của Bergey (Holtet và cs., 1989) và Chương trình xạ khuẩn quốc tế (ISP) (Shirling và Gottlieb, 1966)
9 Tách chiết và giải trình tự hệ gen xạ khuẩn bằng máy giải trình tự gen thế hệ mới IonTorrent PGM; hệ gen được lắp ráp phần mềm VelvetOptimiser (Gladman và Seemann, 2012); dự đoán gen theo phần mềm Prodigal (Hyatt và cs., 2010), GeneMarkS (Besemer và cs., 2001) và antiSMASH (Blin và cs., 2013; Weber và cs., 2015)
10 Xác định cấu trúc của các CKS từ dịch lên men xạ khuẩn theo các phương pháp
đo phổ, phân tích cấu trúc bằng các phổ ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT, HSQC, HMBC theo Nguyễn Đình Triệu (2005)
11 Xử lý thống kê: dùng toán thống kê, phần mềm Excel 2010 và phần mền XLSTAT 2016 để phân tích độ sai lệch một chiều (ANOVA) được thực hiện để phân tích những khác biệt đáng kể (P=0,05)
Trang 7CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 S ự đa dạng và khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế
(C cassia Presl)
3.1.1 Phân l ập xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C cassia Presl)
Từ 27 mẫu cây quế (C cassia Presl) thu thập được từ vùng Tây Bắc, Việt Nam,
sau khi xử lý bề mặt và nuôi cấy trên các môi trường phân lập đặc hiệu (TWYE, STA, HV, TA, SA, CA, SPA, RA và ISP5), trong 6-8 tuần ở 28°Ccho thấy tỷ lệ các chủng XKNS phân bố không đều (Hình 3.1)
Bái (C) phân lập trên một số môi trường đặc hiệu sau 4-6 tuần nuôi cấy
Nhìn chung, các chủng xạ khuẩn phát triển khá chậm trên 9 loại môi trường với số lượng đạt 2-3 chủng/mẫu Sau thời gian nuôi cấy từ 4-6 tuần, 297 chủng XKNS đã phân lập và thuần khiết từ các bộ phận của cây, trên môi trường phân lập đặc hiệu khác nhau (Phụ lục 5) Trong đó, 111 chủng từ các mẫu quế Hòa Bình, chiếm 37,3%;
81 chủng từ Lai Châu, chiếm 27,3% và 105 chủng từ Yên Bái, chiếm 35,4% Đặc điểm hình thái và màu sắc khuẩn lạc XKNS đĩa thạch trên môi trường YIM38 cho
thấy, số lượng xạ khuẩn khác nhau tùy thuộc vào khu vực lấy mẫu
3.1.2 Đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C cassia Presl)
3.1.2.1 S ự đa dạng xạ khuẩn nội sinh theo bộ phận của cây quế (C cassia Presl)
Trong số 297 chủng xạ khuẩn được phân lập ở Hòa Bình số lượng xạ khuẩn thu được từ thân, rễ, lá lần lượt đạt 60,4% (n=67), 26,1% (n=29) và 13,5% (n=15) trên
Trang 8tổng 111 chủng XKNS; ở Yên Bái số lượng xạ khuẩn thu được từ thân cao nhất 38,2% (n=40), rễ 35,2% (n=37) và lá thấp nhất 26,7% (n=28) trên tổng 105 chủng XKNS (Hình 3.2A) Ngược lại số lượng xạ khuẩn phân lập từ quế tại Lai Châu đạt cao nhất ở rễ 43,2% (n=35), tiếp đến là thân 34,6% (n=28) và thấp nhất ở lá 22,2% (n=18) trên tổng 81 chủng XKNS Tuy nhiên, theo số liệu tổng hợp tại 3 khu vực cho thấy, số lượng XKNS cao nhất ở thân 45,5% (n=135) tiếp theo rễ 34,0% (n=101) và thấp nhất ở lá 20,5% (n=61) (Hình 3.2B)
vùng lấy mẫu (A); số liệu thống kê theo vùng lấy mẫu (B)
3.1.2.2 S ự đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C cassia Presl) theo môi trường phân l ập
Theo các nghiên cứu về XKNS, phương pháp xử lý mẫu và thành phần môi trường là yếu tố chính quyết định đến kết quả phân lập, đánh giá sự đa dạng của XKNS và tìm ra các loài xạ khuẩn mới (Okazaki, 2003) Kết quả đánh giá đa dạng xạ khuẩn phân lập trên 9 loại môi trường được thể hiện trên Hình 3.3 Số lượng XKNS
tại 3 vùng lấy mẫu đạt cao nhất trên các môi trường CA, STA lần lượt đạt 20,5% và 19,2%, số lượng XKNS trên các môi trường còn lại chỉ đạt từ 3,0-16,5% trên tổng số
chủng xạ khuẩn phân lập được (n=297)
hợp tại ba vùng lấy mẫu (A); số liệu thống kê theo vùng lấy mẫu (B)
HV ISP5
TWYE RA STA
Trang 93.1.2.3 S ự đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C cassia Presl) theo nhóm
m ầu khuẩn ty
Mầu khuẩn ty được coi là tiêu chí cơ bản để chọn lọc các chủng xạ khuẩn trên các môi trường phân lập, tránh chọn lọc các chủng có cùng đặc điểm hình thái, màu sắc giống nhau Sự khác biệt về màu sắc hệ khuẩn ty xạ khuẩn được hình thành do nhiều nguyên nhân khác nhau như: khí hậu, nhiệt độ, độ ẩm, chất dinh dưỡng, pH, (Shirling và Gottlieb, 1966) Số lượng xạ khuẩn phân lập trên cả 3 khu vực có màu sắc hệ khuẩn ty thuộc 6/7 nhóm mầu xuất hiện với tỷ lệ khác nhau Trong đó, tỷ lệ các chủng xạ khuẩn phân lập thuộc nhóm màu xám là cao nhất (42,1%; n=125), tiếp theo là vàng (22,6%; n=67), trắng (17,8%; n=53), đỏ (14,5%; n=43), xanh (2,00%; n=6)và tím(1,00%; n=3) trên tổng số chủng xạ khuẩn (n=297) (Hình 3.4)
lấy mẫu (A); số liệu thống kê theo vùng lấy mẫu (B)
3.1.2.4 S ự đa dạng di truyền DNA của một số chủng xạ khuẩn nội sinh
Trên cơ sở 297 chủng XKNS chọn ngẫu nhiên 16 chủng XKNS phân lập trên cây
quế HBQ7; HBQ8; HBQ9; HBQ10; HBQ11; HBQ16; HBQ19; HBQ33; HBQ40; HBQ43; HBQ46; HBQ47; HBQ49; HBQ55; HBQ56; HBQ62 được lựa chọn để đánh giá đa dạng di truyền DNA bằng phản ứng BOX-PCR Phân tích sản phẩm phản ứng BOX-PCR của 16 chủng xạ khuẩn được lựa chọn cho 15 băng có kích thước khác nhau trên bản điện di tương ứng với 15 vùng gen khác nhau trên hệ gen của các
chủng xạ khuẩn (Hình 3.5) Xác định quan hệ di truyền cho thấy đa số các chủng xạ khuẩn có độ tương đồng di truyền <90%, chỉ có hai cặp xạ khuẩn (HBQ46 và HBQ47) và (HBQ9 và HBQ33) có hệ độ tương đồng di truyền >90%, chứng tỏ các
chủng XKNS nghiên cứu có độ sai khác về di truyền trong hệ gen của XKNS Kết
quả nghiên cứu trên bước đầu đánh giá đa dạng XKNS, cho thấy các chủng XKNS phân lập từ cây quế có độ đa dạng di truyền cao hay tần suất phân lập các chủng trùng
Trang 10lặp về di truyền thấp Ngoài ra, đặc điểm hình thái của 16 xạ khuẩn trên cũng cho thấy tính đa dạng về mầu sắc khuẩn lạc, hình dạng tế bào
3.1.3 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn nội sinh
Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng 09 VSV kiểm định của 297 chủng XKNS được tổng hợp trong Bảng 3.1
khuẩn nội sinh phân lập từ cây quế
Chủng vi sinh vật kiểm định
Số chủng xạ khuẩn kháng
vi sinh vật kiểm định Tỷ lệ (%) Hòa
Bình (111)
Lai Châu (81)
Yên Bái (105)
Hòa Bình
Lai Châu
Yên Bái
Trang 11Trong số 297 chủng xạ khuẩn được thử nghiệm, có 96 chủng (chiếm 32,3%) kháng ít nhất một VSV kiểm định, chiếm đa số là các chủng xạ khuẩn Hòa Bình (n=40; 41,7%), tiếp đến Yên Bái (n=36; 37,5%) và Lai Châu (n=20; 20,8%) Tổng số
96 chủng xạ khuẩn có 37 chủng thể hiện phổ kháng khuẩn rộng (cùng kháng nhiều hơn 6 loại vi sinh vật kiểm định) Trong số 96 chủng phân lập, tác dụng ức chế tác nhân gây bệnh cao nhất đối với MRSE (n = 60, 62,5%), P vulgaris (n = 54, 56,3%), tiếp đến là B cereus (n = 51, 53,1%), E coli và E aerogenes (n = 40, 41,7%), S
lutea (n = 36, 37,5%), S Typhimurium (n = 26, 27,1%), C albicans (n = 25, 26,0%)
và P aeruginosa (n = 22, 22,9%)
3.1.4 Phân tích trình t ự gen 16S rDNA của xạ khuẩn nội sinh sinh kháng sinh
Trong khuôn khổ của luận án đã phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA của 82/96 chủng XKNS sinh kháng sinh và xác định được trình tự của 82 chủng XKNS
có độ tương đồng cao (97,9 - 100%) so với các trình tự tương ứng trên GenBank (NCBI) 82/96 chủng XKNS đã được phân loại tới loài và đã được đăng ký trên GenBank (NCBI)
Kết quả phân loại các chủng được tập hợp theo các chi, họ thuộc ngành xạ khuẩn (Actinobacteria) trên Bảng 3.2 cho thấy, 82 chủng XKNS được phân thành 6 chi thuộc 6 họ khác biệt: Streptomyces thuộc họ Streptomycetaceae, Microbacterium
thuộc họ Microbacteriaceae, Brevibacterium thuộc họ Brevibacteriaceae, Micromonospora thu ộc họ Micromonosporaceae, Saccharothrix thuộc họ Actinosynnemataceae và Nocardia thu ộc họ Nocardiaceae Trong đó, số chủng thuộc chi Streptomyces chi ếm tỷ lệ cao nhất (92,7%), tiếp theo là chi Microbacterium (2,5%), còn các chi Micromonospora, Nocardia và Saccharothrix chiểm tỷ lệ thấp
nhất (mỗi loại chiếm 1,2%)
và Yên Bái dựa trên kết quả phân tích trình tự gen 16S rDNA
XKNS trên cây quế có sự đa dạng mức độ loài tương đối cao, chi Streptomyces là
chi phổ biến nhất tại Hòa Bình, Lai Châu và Yên Bái, chi Microbacterium xuất hiện
Trang 12tại ở tại hai khu vực Hòa Bình và Lai Châu, còn chi Nocardia chỉ xuất hiện ở Hòa Bình Tuy nhiên, một số chủng thuộc các chi hiếm Saccharothrix chỉ phân lập được
từ Lai Châu (Bảng 3.2) Điều này cho thấy, số lượng XKNS khác nhau giữa các vị trí lấy mẫu có khả năng bị ảnh hưởng bởi điều kiện khí hậu khác nhau
3.1.5 Khu ếch đại gen mã hóa polyketide synthases (PKS-I, PKS-II) và nonribosomal peptide synthetase (NRPS) tham gia sinh t ổng hợp kháng sinh
Theo nhiều tài liệu trên thế giới công bố, một số sản phẩm trao đổi chất bậc hai có hoạt tính kháng sinh, kháng ung thư… của xạ khuẩn được tổng hợp bởi 3 nhóm enzyme chính là PKS-I, PKS-II và NRPS Nhiều nghiên cứu đã chứng minh ba gen
pks-I, pks-II và nrps mã hóa enzyme có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp kháng sinh (Minotti và cs., 2004)
khuẩn nội sinh cây quế Hòa Bình, Lai Châu và Yên Bái
Trong nghiên cứu này, xác định sự có mặt của các gen liên quan đến tổng hợp kháng sinh là một trong những đặc điểm sinh học của XKNS sinh kháng sinh Kết quả cho thấy, sản phẩm PCR khuếch đại các gen của 96 chủng xạ khuẩn cho băng
DNA có kích thước khoảng 1400 bp (đối với gen pks-I), 600 bp (pks-II) và 750 bp (nrps), tương ứng với kích thước mồi sử dụng khuếch đại gen pks-I, pks-II, nrps đã
đưa ra Điều đó cho thấy, 03 cặp mồi suy biến (K1F/M6R; A3F/A7R; KSαF/KSαR)
sử dụng trong thí nghiệm là phù hợp Tỷ lệ mang gen pks-I, pks-II và nrps lần lượt là 38,5% (n=37/96), 61,5% (n=59/96) và 36,5% (n=35/96) (Hình 3.6) Hoạt tính kháng VSV kiểm định và khả năng tổng hợp các hoạt chất sinh học (PKS-I, PKS-II và NRPS) là khác nhau Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt tính sinh học của các chủng XKNS có thể liên quan trực tiếp tới sự có mặt của các gen mã hóa PKS-I, PKS-II và NRPS và các chủng XKNS trên cây quế có thể là nguồn sinh các chất kháng sinh và kháng ung thư quan trọng
0 10 20 30 40 50 60
Trang 133.1.6 Kh ả năng sinh chất kháng sinh thuộc nhóm anthracycline
Kháng sinh thuộc nhóm anthracycline sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn phần lớn cho
thấy độc tính đối với các khối u ở người hoặc các dòng tế bào ung thư (Minotti và cs., 2004; Nakashima và cs., 2013) Ngoài ra, nhóm chất anthracycline từ xạ khuẩn là một trong nhóm chất có hiệu quả nhất được sử dụng phổ biến trong điều trị nhiều loại ung thư (McGowan và cs., 2017) Trong số 96 chủng XKNS tuyển chọn có 70 chủng (72,9%) có khả năng sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline (chuyển màu cam với môi trường acid và tím trong môi trường kiềm) Trong đó, các chủng phân lập được
từ cây quế ở Yên Bái sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline chiếm tỷ lệ cao nhất (31,3%), tiếp theo là Hòa Bình (28,1%), Lai Châu (13,5%) Đặc biệt, 14/96 chủng XKNS không có khả năng sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline, nhưng 14
chủng này lại có hoạt tính kháng khuẩn chống lại ít nhất 3 VSV kiểm định, do các hợp chất được tạo ra bởi các xạ khuẩn có thể không thuộc nhóm anthracycline
3.2 Đặc điểm sinh học và điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh kháng sinh của
chủng Streptomyces cavourensis YBQ59
Từ các kết quả sàng lọc hoạt tính kháng VSV kiểm định cũng như khả năng mang các gen liên quan tới quá trình sinh tổng hợp kháng sinh và sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracyclin, trong luận án này nghiên cứu sinh đã lựa chọn chủng S cavourensis YBQ59 thể hiện phổ kháng rộng, kháng mạnh với 8/9 chủng VSV kiểm định cho các nghiên cứu tiếp theo Đồng thời, chủng YBQ59 mang gen mã hóa PKS-
I, PKS-II, NRPS và sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline Trong đó các vi khuẩn gây bệnh như E coli, P vulgaris, S Typhimurium và P aeruginosa là những
tác nhân gây bệnh cần ưu tiên kiểm soát và phát triển kháng sinh điều trị theo khuyến cáo của tổ chức y tế thế giới (WHO) công bố vào tháng 2/2017 Ngoài ra, chủng YBQ59 thể hiện tính kháng khuẩn mạnh với S epidermidis kháng methicillin gây
bệnh cơ hội phổ biến ở người khó điều trị (Otto, 2009) Vì vậy, chủng YBQ59 được tuyển chọn cho những nghiên cứu về đặc điểm sinh học, khai thác hệ gen, điều kiện lên men, thu hồi và tách chiết các chất có hoạt tính sinh học
3.2.1 Đặc điểm sinh học của chủng S cavourensis YBQ59
Chủng YBQ59 phát triển tốt trên môi trường ISP2 ở pH 7,0, nhiệt độ 30°C với
nồng độ NaCl là 2% Nhiệt độ, pH, nồng độ muối là đặc điểm có ý nghĩa quan trọng đối với việc ứng dụng xạ khuẩn trong lên men thu nhận các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn Kết quả nghiên cứu khả năng sử dụng nguồn carbon, nitơ của chủng YBQ59 cho thấy, chủng YBQ59 sử dụng được hầu hết các nguồn carbon (11/13) thử nghiệm ngoại trừ D-glucosamine, D-sorbitol, nhưng chỉ sử dụng được 6/13 nguồn nitơ thử nghiệm (L-asparagin monohydrat, L-arginin, L-valin, L-methionin, L-threonin, L-cystein) và chủng YBQ59 còn có khả năng sinh một số enzyme ngoại bào