Luận án được nghiên cứu với mục tiêu nhằm thu nhận được chủng vi khuẩn Bt bản địa có khả năng sinh chitinase cao và biểu hiện được chitinase tái tổ hợp trong E. coli phục vụ nghiên cứu sản xuất chế phẩm hỗ trợ khả năng diệt côn trùng của chế phẩm sinh học BT và ức chế nấm hại cây trồng.
Trang 2Ng ườ ướ i h ng d n khoa h c: ẫ ọ
Tr ườ ng Đ i h c Khoa h c T nhiên ạ ọ ọ ự
Lu n án s đ ậ ẽ ượ c b o v tr ả ệ ướ c H i đ ng ch m lu n án ti n s ộ ồ ấ ậ ế ỹ Phiên Chính th c t i: Vi n Công ngh sinh h c, Vi n Hàn lâm Khoa ứ ạ ệ ệ ọ ệ
h c và Công ngh Vi t Nam, 18 Hoàng Qu c Vi t, C u Gi y, Hà ọ ệ ệ ố ệ ầ ấ
N i ộ
Vào h i:……gi ngày… tháng… năm 2018 ồ ờ
Có th tìm hi u lu n án t i: ể ể ậ ạ
Trang 3 Trang web c a B GDĐT ủ ộ
Trang 41. Trinh Thi Thu Hà ̣ ̣ , Đông Văn Quyên, Đăng Văn Tiên, Ngô ̀ ̀ ̣ ́ Đinh Binh (2014). Phân l p gen ma hoa endochitinase t vi ̀ ́ ậ ̃ ́ ư ̀ khu n ẩ Bacillus thuringiensis serovar kurstaki tai Ha Nôi. ̣ ̀ ̣ T p ạ chí Công ngh Sinh h c ệ ọ , 12(4): 757763.
T i u đi u ki n bi u hi n nh m nâng cao kh năng sinh ố ư ề ệ ể ệ ằ ả
t ng h p chitinase c a ch ng vi khu n tái t h p b ng ổ ợ ủ ủ ẩ ổ ợ ằ
ph ươ ng pháp b m t đáp ng. ề ặ ứ T p chí Sinh h c ạ ọ 40(1): 115
123, DOI: 10.15625/08667160/v40n1.10495.
Trang 5M Đ UỞ Ầ
Trong nhi u năm qua, thu c tr sâu sinh h c ề ố ừ ọ Bacillus thuringiensis (Bt) đã
được nghiên c u và ng d ng đ di t tr các lo i côn trùng h i cây tr ng. Trongứ ứ ụ ể ệ ừ ạ ạ ồ
nh ng năm g n đây, m t s nhà khoa h c trên th gi i đã nghiên c u tác d ng hữ ầ ộ ố ọ ế ớ ứ ụ ỗ
tr kh năng di t côn trùng c a enzyme ngo i bào (chitinase) đ i v i protein tinhợ ả ệ ủ ạ ố ớ
th c a Bt. ể ủ
Chitinase đượ ử ục s d ng nh thu c tr sâu sinh h c trong nông nghi p nh khư ố ừ ọ ệ ờ ả năng phân h y chitin c u trúc trong thành t bào c a n m, côn trùng gây b nhủ ấ ế ủ ấ ệ , tăng ho t tính di t côn trùng c a ch ph m Btạ ệ ủ ế ẩ và x lý các ch t th i giàu chitin.ử ấ ả Ngoài ra, chitinase còn đượ ức ng d ng ụ nhi uề trong s n xu t chitooligosaccharide,ả ấ nano chitin, Nacetyl Dglucosamine. Đây là nh ng s n ph m giá tr ng d ng caoữ ả ẩ ị ứ ụ
và được s d ng trong th c ph m, nông nghi p, y dử ụ ự ẩ ệ ược. Vì v y, vi c ậ ệ tìm ra
ch ng sinh chitinase cao vàủ qui trình t o ra chitinaseạ có ho t tính cao b ng côngạ ằ ngh genệ nh m góp ph n tăng hi u qu c a ch ph m sinh h c ằ ầ ệ ả ủ ế ẩ ọ và khai thác ngứ
d ng trong các lĩnh v c khác ụ ự là r t c n thi t.ấ ầ ế
Xu t phát t nh ng lý do trên, chúng tôi ti n hành l a ch n đ tài lu n án:ấ ừ ữ ế ự ọ ề ậ
“Tách dòng, bi u hi n và nghiên c u tính ch t c a endochitinase t Bacillus ể ệ ứ ấ ủ ừ thuringiensis phân l p Vi t Nam” ậ ở ệ
M c tiêu c a đ tài:ụ ủ ề
Thu nh n đậ ược ch ng vi khu n Bt b n đ a có kh năng sinh chitinase cao vàủ ẩ ả ị ả
bi u hi n để ệ ược chitinase tái t h p trong ổ ợ E. coli ph c v nghiên c u s n xu t chụ ụ ứ ả ấ ế
ph m h tr kh năng di t côn trùng c a ch ph m sinh h c BT và c ch n mẩ ỗ ợ ả ệ ủ ế ẩ ọ ứ ế ấ
h i cây tr ng.ạ ồ
Nh ng đóng góp m i c a lu n ánữ ớ ủ ậ
1. Tuy n ch n để ọ ược 36 ch ng vi khu n ủ ẩ B. thuringiensis Vi t Nam có kh năngệ ả sinh t ng h p chitinase cao.ổ ợ
2. Lu n án là công trình đ u tiên Vi t Nam nghiên c u m t cách có h th ngậ ầ ở ệ ứ ộ ệ ố
v endochitinase (t nhiên và tái t h p) t ch ng ề ự ổ ợ ừ ủ B. thuringiensis serovar kurstaki
MSS1.1 c a Vi t Nam có kh năng b o v kép (Dual control) v a kháng n m ủ ệ ả ả ệ ừ ấ F. oxysporum, R. solani gây b nh th c v t v a tăng ho t tính di t côn trùng c a chệ ự ậ ừ ạ ệ ủ ế
ph m BT nh m ph c v cho phát tri n thu c tr sâu b nh sinh h c th h m i.ẩ ằ ụ ụ ể ố ừ ệ ọ ế ệ ớ
3. B sung c s d li u ngu n gen chitinase c a các ch ng ổ ơ ở ữ ệ ồ ủ ủ B. thuringiensis
Vi t Nam ph c v cho nghiên c u, đào t o và ng d ng sau này.ệ ụ ụ ứ ạ ứ ụ
C u trúc c a lu n ánấ ủ ậ
Lu n án g m 159 trang đậ ồ ược chia thành các ph n: M đ u 4 trang; Chầ ở ầ ương 1:
T ng quan tài li u 34 trang; Chổ ệ ương 2: V t li u và phậ ệ ương pháp 19 trang; Chươ ng3: K t qu 41 trang; Chế ả ương 4: Th o lu n 23 trang; K t lu n và ki n ngh 1 trang;ả ậ ế ậ ế ị
Trang 6Các công trình công b c a tác gi 1ố ủ ả trang; Tóm t t k t qu lu n án b ng ti ngắ ế ả ậ ằ ế anh 6 trang; Tài li u tham kh o 17 trang; Ph l c 13 trang. Lu n án có 15 b ng sệ ả ụ ụ ậ ả ố
li u, 44 hình và 152 tài li u tham kh o b ng ti ng Vi t và ti ng Anh.ệ ệ ả ằ ế ệ ế
l p phậ ương… Bt được phân lo i theo nhi u phạ ề ương pháp khác nhau. Trong đó,
phương pháp phân lo i theo de Barjac và Bonnefoi d a trên nguyên lý c a ph nạ ự ủ ả
Trong qua trinh sinh tŕ ̀ ưởng, phat triên vi khuân ́ ̉ ̉ Bt con san sinh chât chuyên hoà ̉ ́ ̉ ́
co tiêm năng ng dung rông rai trong nhiêu linh v c nh : môi tŕ ̀ ứ ̣ ̣ ̃ ̀ ̃ ự ư ương, th c phâm, ỳ ự ̉
tê, nông nghiêp, công nghiêp, công nghê sinh hoc… đo chinh la enzyme thuy phâń ̣ ̣ ̣ ̣ ́ ́ ̀ ̉ chitin (chitinase). Chitinase t Bt đừ ược biêt đên do tac dung t́ ́ ́ ̣ ương hô gi a chitinasẽ ữ
va thuôc tr sâu sinh hoc̀ ́ ừ ̣ Chitinase san sinh t ̀̉ ư Bt. pakistani co kha năng lam tănǵ ̉ ̀ hoat tinh diêt âu trung ̣ ́ ̣ ́ ̀ Spodoptera exigua cua chung Bt DL5789 lên 2,35 lân (Liu et̉ ̉ ̀ al., 2002). Năm 2011, Usharani phân lâp đ̣ ược gen exochitinase co kich th́ ́ ươc 1129́
bp, ma hoa 360 acid amin va khang 4 loai nâm gây bênh th c vât. Vào năm 2015,̃ ́ ̀ ́ ̣ ́ ̣ ự ̣ các nhà khoa h c Trung Qu c đã phân l p gen chi9602 mã hóa chitinase h 18 tọ ố ậ ọ ừ
ch ng ủ B. thuringiensis YBT9602, r i ti n hành gây đ t bi n gen và bi u hi nồ ế ộ ế ể ệ
trong E. coli. Ho t tính th y phân chitin c a đ t bi n ChiW50A tăng 60% v i yêuạ ủ ủ ộ ế ớ
c u v pH, nhi t đ , ion kim lo i tầ ề ệ ộ ạ ương t nh ch ng d i. H n n a, đ t bi nự ư ủ ạ ơ ữ ộ ế ChiW50A th hi n kh năng ki m soát sâu b nh và ho t đ ng kháng n m. Tácể ệ ả ể ệ ạ ộ ấ
đ ng c ng hộ ộ ưởng đáng k c a đ t bi n này v i các ch ph m bào t tinh thể ủ ộ ế ớ ế ẩ ử ể
c a ủ B. thuringiensis ch ng l i u trùng ố ạ ấ Helicoverpa armigera và Caenorhabditis elegans và kh năng c ch s phát tri n m t s n m gây b nh th c v t (Ni et al.,ả ứ ế ự ể ộ ố ấ ệ ự ậ 2015)
Qua th i gian dài phát tri n đ n năm 2016, gen ờ ể ế chiA mã hóa endochitinase c aủ
ch ng ủ B. thuringiensis subsp tenebrionis DSM 2803 đã đượ ạc t o dòng và bi uể
Trang 7hi n trong ệ E. coli. Protein tái t h p có g n thêm đo n 6Histidine đổ ợ ắ ạ ược tinh s chạ
b ng s c ký ái l c. Emzym tái t h p tinh s ch có tác d ng làm gi m s tăngằ ắ ự ổ ợ ạ ụ ả ự
trưởng c a n m ủ ấ Colletotrichium gloeosporioides – tác nhân gây b nh thán th ệ ư ở
1.2. Chitinase
Chitinase (EC 3.2.1.14) thu c nhóm enzyme th y phân, là enzyme xúc tác quáộ ủ trình phân h y c ch t chitin không tan trong nủ ơ ấ ươc thành các s n ph m chitiń ả ẩoligosaccharide hòa tan trong nước thông qua quá trình th y phân liên k t (1,4)ủ ế β glucoside gi a Cữ 1 và C4 c a hai phân t Nacetyl Glucosamine liên ti p nhau trongủ ử ế chitin. D a vào trình t amino acid đ u ni t , s đ nh v c a enzyme, đi m đ ngự ự ầ ơ ự ị ị ủ ể ẳ
đi n, peptide nh n bi t và vùng c m ng, ngệ ậ ế ả ứ ười ta phân lo i chitinase thành 5ạ nhóm: Nhóm I, nhóm II, nhóm III, nhóm IV và nhóm V. D a vao phan ng phân cătự ̀ ̉ ứ ́ chitin, chitinase được phân thành 2 dang: d ng 1 là endochitinase (EC.3.2.1.14),̣ ạ
d ng 2 là exochitinase g m 2 lo i là chitobiosidase (EC.3.2.1.29) và Nacetylạ ồ ạ glucosaminidase (EC.3.2.1.30). D a vao câu truc phân t , chitinase đự ̀ ́ ́ ử ược chia thanh̀
3 ho: glycohydrolase 18, 19 va 20.̣ ̀
Cac chitinase co nguôn gôc khac nhau co thanh phân câu tao va câu truc khać ́ ̀ ́ ́ ́ ̀ ̀ ́ ̣ ̀ ́ ́ ́ nhau. S khác nhau v c u trúc c a các enzyme còn th hi n s s p x p trongự ề ấ ủ ể ệ ở ự ắ ế không gian c a các chu i polypeptide, các trung tâm xúc tác và các vùng liên k t củ ỗ ế ơ
ch t. S khác nhau v c u trúc không gian c a các enzyme d n t i s khác nhauấ ự ề ấ ủ ẫ ớ ự
v các tính ch t hóa lý c a chúng. C u trúc đi n hình c a chitinase g m 3 vùng:ề ấ ủ ấ ể ủ ồ vùng xúc tác (catalytic domain), vùng fibronectin (fibronectinlike domain: FLD) và vùng liên k t c ch t (chitinbinding domain: CBD). ế ơ ấ
Tùy thu c vào c u trúc và ngu n g c c a chitinase ma ho t tính enzyme m nhộ ấ ồ ố ủ ̀ ạ ạ
nh t nhi t đ và pH khac nhau. Anh hấ ở ệ ộ ́ ̉ ưởng cua các ion kim lo i, ch t t y r a,̉ ạ ấ ẩ ử dung môi h u c đôi v i chitinase t cac nguôn thu nhân khac nhau cung có sữ ơ ́ ớ ừ ́ ̀ ̣ ́ ̃ ự khác nhau
D a vao phan ng phân căt chitin, chitinase đự ̀ ̉ ứ ́ ược phân thành 2 dang:̣ endochitinase và exochitinase. Endochitinase là nhóm enzyme phân c t n i m chắ ộ ạ chitin m t cách ng u nhiên t o các đo n oligosaccharide v i m c trùng h p khácộ ẫ ạ ạ ớ ứ ợ nhau, exochitinase là enzyme phân c t chitin t m t đ u cho s n ph m chính là cácắ ừ ộ ầ ả ẩ
Trang 8đ n phân NacetylDglucosamine. Do ki u phân c t đ c bi t mà endochitinaseơ ể ắ ặ ệ thích h p v i c ch t là chitin và vách t bào n m ch a chitin h n so v iợ ớ ơ ấ ế ấ ứ ơ ớ exochitinase. Vì v y, endochitinase có kh năng c ch s phát tri n c a m t sậ ả ứ ế ự ể ủ ộ ố
n m gây b nh th c v t và làm tăng ho t tính di t côn trùng c a protein tinh th Bt.ấ ệ ự ậ ạ ệ ủ ể
Đê tăng hiêu qua diêt côn trung cua đôc tô Bt va khăc phuc tinh khang thuôc cua côn̉ ̣ ̉ ̣ ̀ ̉ ̣ ́ ̀ ́ ̣ ́ ́ ́ ̉ trung gây hai, cac nha khoa h c trên th gi i đã nghiên c u s dung hôn h p gi à ̣ ́ ̀ ọ ế ớ ứ ử ̣ ̃ ợ ư ̃protein đôc t Bt v i chitinase (đ c bi t là v i endochitinase).̣ ố ớ ặ ệ ớ
Chitinase đượ ạc t o ra t nhi u loài vi sinh v t trong t nhiên, trong đó vi khu nừ ề ậ ự ẩ
được xem là đ i tố ượng s n sinh chitinase phong phú nh t. Trong các loài vi khu nả ấ ẩ thì Bt luôn s n sinh chitinase v i ho t tính cao và chitinase c a vi khu n Bt thíchả ớ ạ ủ ẩ
h p nh t v i c ch t là b t chitin t v tôm. Tuy nhiên, chitinase t các ch ng tợ ấ ớ ơ ấ ộ ừ ỏ ừ ủ ự nhiên thường t o ra v i hàm lạ ớ ượng r t th p. Các nhà khoa h c đã nghiên c u sấ ấ ọ ứ ử
d ng công ngh protein tái t h p đ s n xu t chitinase qui mô công nghi p.ụ ệ ổ ợ ể ả ấ ệ
Hướng đi này giúp nâng cao năng su t sinh t ng h p enzyme đ ng th i lấ ổ ợ ồ ờ ượ ngenzyme thu được d dàng tinh s ch h n khi s d ng ch ng t nhiên. H bi u hi nễ ạ ơ ử ụ ủ ự ệ ể ệ
E. coli thường đượ ực l a ch n đ bi u hi n gen ngo i lai do ọ ể ể ệ ạ E. coli d nuôi c yễ ấ trên môi trường r ti n, t c đ sinh trẻ ề ố ộ ưởng nhanh nên co kha năng tông h p ĺ ̉ ̉ ợ ượ ng
l n protein tai tô h p. Hàm lớ ́ ̉ ợ ượng protein tái t h p thu đổ ợ ược ph thu c r t nhi uụ ộ ấ ề vào đi u ki n lên men ch ng tái t h p: nhi t đ và th i gian c m ng, lo i ch tề ệ ủ ổ ợ ệ ộ ờ ả ứ ạ ấ
c m ng và n ng đ ch t c m ng, m t đ t bào t i th i đi m cám ng. Khiả ứ ồ ộ ấ ả ứ ậ ộ ế ạ ờ ể ứ
bi u hi n đi u ki n t i u nh t thì hàm lể ệ ở ề ệ ố ư ấ ượng protein tái t h p s thu đổ ợ ẽ ượ ở c
m c t i đa, đ ng nghĩa v i vi c h giá thành s n ph m tái t h p. ứ ố ồ ớ ệ ạ ả ẩ ổ ợ
M t s chitinase t vi khu n Bt và nh ng loài khác đã độ ố ừ ẩ ữ ược bi u hi n thànhể ệ
công trong E. coli. Vào năm 2013, hai gen chitinase LbCHI31 và LbCHI32 từ Limonium bicolor đã được bi u hi n trong ể ệ E. coli BL21, enzyme tái t h p t o raổ ợ ạ
dưới 2 hình th c là n i bào và ngo i bào. Protein tái t h p ngo i bào đứ ộ ạ ổ ợ ạ ược ti tế vào môi trường nuôi c y giúp thu n l i trong vi c thu h i s n ph m và đ c bi tấ ậ ợ ệ ồ ả ẩ ặ ệ protein ngo i bào có ho t tính enzyme cao h n so v i protein tái t h p n i bàoạ ạ ơ ớ ổ ợ ộ (Liu et al., 2013). Cũng trong th i gian này, tác gi CastanedaRamirez đã bi u hi nờ ả ể ệ gen mã hóa chitinase t vi khu n Bt, chiA74 vào ch ng ừ ẩ ủ E. coli K12. K t qu thuế ả
được protein tái t h p có ho t tính enzyme tăng g p kho ng 500 l n so v i ổ ợ ạ ấ ả ầ ớ E. coli DH5 (CastanedaRamirez et al., 2013). G n đây, FuenteSalcido và c ng sα ầ ộ ự
đã t o dòng và bi u hi n gen ạ ể ệ chiA mã hóa endochitinase t ch ng vi khu n Btừ ủ ẩ
tenebrionis DSM2803 trong E. coli. Protein tái t h p có kích thổ ợ ước kho ng 74ả kDa được tinh s ch qua c t s c ký ái l c có kh năng c ch s phát tri n c aạ ộ ắ ự ả ứ ế ự ể ủ
n m ấ Colletotrichium gloeosporioides gây b nh thán th th c v t (FuenteSalcidoệ ư ở ự ậ
et al., 2016)
Nh v y, chitinase co y nghia quan trong trong đ i sông, đăc biêt v i xu hư ậ ́ ́ ̃ ̣ ờ ́ ̣ ̣ ớ ươ nǵphat triên môt nên nông nghiêp sach, bên v ng thi cac loai phân bon, thuôc bao vế ̉ ̣ ̀ ̣ ̣ ̀ ữ ̀ ́ ̣ ́ ́ ̉ ̣
Trang 9th c vât h u c hoăc co nguôn gôc sinh hoc đang đự ̣ ữ ơ ̣ ́ ̀ ́ ̣ ược đê cao nghiên c u va phat̀ ứ ̀ ́ triên. Vi t Nam, các nghiên c u v chitinase ch y u t p trung vào quá trình t ỉ Ở ệ ứ ề ủ ế ậ ố
u sinh t ng h p chitinase m t s loài vi sinh v t nh m thu nh n l ng enzym
cao nh t, nghiên c u tính ch t c a chitinase và bi u hi n gen chitinase trong th cấ ứ ấ ủ ể ệ ự
v t giúp cây tr ng có kh năng ch ng l i m t s n m gây b nh. Do đó quá trìnhậ ồ ả ố ạ ộ ố ấ ệ
bi u hi n gen mã hóa chitinase t Bt nh m thu enzym có ho t tính cao, có tác d ngể ệ ừ ằ ạ ụ
c ch s phát tri n c a m t s n m gây b nh cây tr ng, đ ng th i h tr ho t
tính di t sâu c a protein tinh th Bt là m t hệ ủ ể ộ ướng nghiên c u m i và r t c n thi tứ ớ ấ ầ ế
Vi t Nam. H ng nghiên c u này góp ph n nâng cao hi u qu c a ch ph m
sinh h c b o v cây tr ng.ọ ả ệ ồ
CHƯƠNG 2. V T LI U VÀ PHẬ Ệ ƯƠNG PHÁP NGHIÊN C UỨ
2.1. V t li uậ ệ
Các m u đ t và lá (320 m u), kit huy t thanh, n m ẫ ấ ẫ ế ấ F. oxysporum và R. solani,
sâu t (ơ Plutella xylostella), sâu khoang (Spodoptera litura), c p m i chi F và chi Rặ ồ
đ khu ch đ i gen ể ế ạ chiA mã hóa chitinase. Plasmid pGEM®Teasy (Promega) đượ c
s dung trong thi nghiêm tach dong gen. Vector pET28b(+) (Novagen) đử ̣ ́ ̣ ́ ̀ ược sử dung đê thiêt kê vector biêu hiên gen ̣ ̉ ́ ́ ̉ ̣ chiA trong E. coli.
2.2. Phương pháp
Phân l p vi khu n Bt theo phậ ẩ ương pháp c a ủ Thiery và Frachon (1997)
Phân lo i vi khu n Bt theo phạ ẩ ương pháp c a de Barjac va Bonnefoi (1990)ủ ̀
Ho t tính chitinase đạ ược đ nh tính theo phị ương pháp khu ch tán trên đĩaế
th chạ
Đ nh lị ượng chitinase theo phương pháp Miller (1959)
Hàm lượng protein được xác đ nh theo phị ương pháp Bradford (1986)
Tách chi t DNA c a vi khu n đế ủ ẩ ược ti n hành theo phế ương pháp c aủ Sambrook và Russell (2001)
T i u đi u ki n bi u hi n theo phố ư ề ệ ể ệ ương pháp b m t đáp ng, s d ng ề ặ ứ ử ụ ph nầ
m m ề Design expert 10.0.6
Quá trình đi n di protein đệ ược th c hi n theo phự ệ ương pháp Laemli (1970)
Thí nghi m Zymogram (đi n di không bi n tính) theo phệ ệ ế ương pháp c aủ BarbozaCorona (2003) có c i ti n.ả ế
Trang 10 Th sâu theo phử ương pháp c a Park và c ng s (1997)ủ ộ ự
Th kh năng kháng n m và ki m tra s th y phân thành t bào n m theoử ả ấ ể ự ủ ế ấ Harighi và c ng s (2007).ộ ự
2.3. S đ nghiên c uơ ồ ứ
Toàn b quá trình nghiên c u độ ứ ược tóm t t b ng s đ sau:ắ ằ ơ ồ
Hình 2.1. S đ nghiên c uơ ồ ứ
CHƯƠNG 3. K T QU NGHIÊN C UẾ Ả Ứ
3.1. Phân l p vi khu n ậ ẩ Bacillus thuringiensis có kh năng sinh chitinase Vi tả ở ệ Nam
3.1.1. Phân lâp vi khuân B. thuringiensis ̣ ̉
T 320 m u đ t và lá thu th p t 7 t nh thành khác nhau c a Vi t Nam đã phânừ ẫ ấ ậ ừ ỉ ủ ệ
l p đậ ược 1026 khuân lac v i cac đăc tinh cua nhom ̉ ̣ ớ ́ ̣ ́ ̉ ́ Bacillus cereus. Trong đó, đã
xác đ nh đị ược 452 khu n l c là vi khuân Bt nh kh năng hình thành tinh th cùngẩ ạ ̉ ờ ả ể
v i bào t Đã xác đ nh đớ ử ị ược ch s Bt là 0,44; t n su t xu t hi n Bt là 60,94%;ỉ ố ầ ấ ấ ệ
ch ng sinh tinh th hình lủ ể ưỡng tháp chi m s lế ố ượng nhi u nh t ề ấ (38,93 %), hinh̀ câu (̀ 38,49%) va hinh lâp ph̀ ̀ ̣ ương (1,54%). Môt sô chung (̣ ́ ̉ 4,64%) tao tinh thê dang̣ ̉ ̣ không xac đinh. Hâu hêt cac chung đêu sinh môt loai tinh thê đăc tr ng nh ng môt́ ̣ ̀ ́ ́ ̉ ̀ ̣ ̣ ̉ ̣ ư ư ̣
khu n l cẩ ạ kiêm trả (chi sô ́̉ Bt)
Tinh thể
hình
lưỡng tháp
Tinh
thể
hình không xác
Trang 11đ nhị
Hòa Bình/
Tây B c B ắ ộ
38/48 (79,2)
146/356 (0,46)
63/146 (43,15)
70/146 (47,94)
3/146 (2,05)
5/146 (3,42)
5/146 (3,42)
48/158 (30,38)
35/158 (22,15)
1/158 (9.4)
69/158 (43,67)
5/158 (4.3)
Th a Thiên ừ
Hu /B c ế ắ
Trung Bộ
10/46 (21,7)
12/36 (0,33)
6/12 (0,50)
6/12 (0,50)
56/136 (0,41)
33/56 (58,92)
20/56 (35,71)
46/154 (0,30)
10/46 (21,73)
27/46 (58.69)
1/46 (2,17)
18/52 (0,23)
12/18 (66,66)
4/18 (22,22)
2/18 (11,11)
16/36 (0,44)
4/16 (25,0)
12/16 (75.0)
T ng sổ ố 195/320
(60,94)
452/1026 (0,44)
176/452 (38,93)
174/452 (38,49)
7/452 (1,54)
74/452 (16,37)
21/452 (4,64)
3.1.2. Phân lo i d ạ ướ i loài các ch ng B. thuringiensis phân l p ủ ậ
Ti n hành phân lo i 452 ch ng Bt phân l p thu đế ạ ủ ậ ược k t qu : 29,2% (132ế ả
ch ng) s ch ng thu c typ huy t thanh 3a, 3b, 3c (dủ ố ủ ộ ế ươi loai ́ ̀kurstaki), 16,4% thuôc̣
dươi loai ́ ̀aizawai va 16,4% thuôc d̀ ̣ ươi loai ́ ̀ morrisoni. Dươi loai ́ ̀novosibirsk và pondicheriensis la nh ng chung kha hiêm Viêt Nam v i ty lê 0,6% môi d̀ ữ ̉ ́ ́ ở ̣ ớ ̉ ̣ ̃ ươi loai,́ ̀
Trang 12Hình 3.1. Hình d ng tinh th và bào t c a m t s ch ng Bt ch p d i kính hi nạ ể ử ủ ộ ố ủ ụ ướ ể
vi đi n t quét v i đ phóng đ i 5000 l nệ ử ớ ộ ạ ầ
1. Hình l ưỡ ng tháp, 2. Hình c u, 3. Hình c u, hình l ầ ầ ưỡ ng tháp và hình kh i l p ố ậ
ph ươ ng, 4. Hình l p ph ậ ươ ng, C. Tinh th (Crystal), S. Bào t (Spore) ể ử
Theo các nghiên c u trên th gi i, các ch ng vi khu n thu c dứ ế ớ ủ ẩ ộ ưới loài B. thuringiensis var. kurstaki (Btk) v a có kh năng ch ng l i u trùng b Canh vâyừ ả ố ạ ấ ộ ́ ̉ (Lepidoptera) v a co kha năng sinh endochitinase – enzyme co kha năng khang nâmừ ́ ̉ ́ ̉ ́ ́ gây bênh th c vât va lam tăng hoat tinh diêt côn trung cua Bt (Barboza, 2008;̣ ự ̣ ̀ ̀ ̣ ́ ̣ ̀ ̉ Gomaa, 2012). Vi vây, các ch ng Btk đ̀ ̣ ủ ược s d ng đ ki m tra kh năng thuyử ụ ể ể ả ̉ phân chitin nh m tìm ra ch ng có ho t tính m nh nh t.ằ ủ ạ ạ ấ
3.1.3. Sang loc hoat tinh thuy phân chitin cua cac chung B. thuringiensis serovar̀ ̣ ̣ ́ ̉ ̉ ́ ̉
kurstaki
T 132 chung Btk, tiên hanh sang loc kha năng sinh enzym thuy phân chitin trênừ ̉ ́ ̀ ̀ ̣ ̉ ̉ môi trương thach co bô sung chitin nh nguôn cac bon (Kamil et al., 2007), thù ̣ ́ ̉ ư ̀ ́
được 99 chung sinh chitinase v i đ̉ ớ ường kính vòng phân gi i 3 29 mm, trong đóả
ch ng MSS1.1 có đủ ường kính vòng phân gi i l n nh t 29 mm và ho t tínhả ớ ấ ạ chitinase cao nh t đ t 0,54 U/ml (Hình 3.2A, B).ấ ạ
B
B
Trang 13Hinh 3.2.̀ Hinh anh sang loc hoat tinh thuy phân chitin cua m t s chung Bt (A)̀ ̉ ̀ ̣ ̣ ́ ̉ ̉ ộ ố ̉
và ho t tính chitinase c a 11 ch ng Bt có đạ ủ ủ ường kính vòng phân gi i ≥ 25mm (B). ả
3.1.4. Sang loc gen endochitinase (chiA) cua cac chung B. thuringiensis serovar̀ ̣ ̉ ́ ̉
kurstaki
S d ng c p m i đ c hi u chi F và chi R đ khu ch đ i gen ử ụ ặ ồ ặ ệ ể ế ạ chiA (Hình 3.3) từ
DNA h gen c a 99 ch ng sinh chitinase, thu đệ ủ ủ ược 73 ch ng mang gen ủ chiA
(chi m 73,74%).ế
Hinh 3.̀ 3. Kêt qua sang loc gen ́ ̉ ̀ ̣ chiA t cac chung Btk phân lâp Ha Nôi.ừ ́ ̉ ̣ ở ̀ ̣
18: cac chung Bt1.43, Bt1.55, Bt1.56, Bt1.58, Bt6.12, CM2.3, CM3.3, CM5.9;́ ̉ 1017: HN1.2, TQ3.3, MSS1.1, MSS6.1, HDC4.7, RH2.15, MSS6.3, AV125.9, 9: DNA chuân (hang Thermo scientific, kich th ̉ ̃ ́ ươ c 10kb).́
3.1.5. Sang loc hoat tinh khang nâm cua cac chung B. thuringiensis serovar̀ ̣ ̣ ́ ́ ́ ̉ ́ ̉
kurstaki
T 36 chung Bt có đừ ̉ ường kính vòng th y phân chitin l n (1729 mm), đ ngủ ớ ồ
th i có ho t tính chitinase cao (0,31 0,54 U/ml) và có mang gen ờ ạ chiA, tiên hanh́ ̀
th hoat tinh khang nâm ử ̣ ́ ́ ́ F. oxysporum va ̀R. solani thu được 5 chung co kha năng̉ ́ ̉ khang nâm. ́ ́ Trong đó, ch ng MSS1.1 có đủ ường kính vòng c ch đ i v i 2 lo i n mứ ế ố ớ ạ ấ
F. oxysporum (Hình 3.4) va ̀R. solani l n lầ ượt là 13 và 8 mm. Ch ng MSS1.1 đủ ượ c
l a ch n đ kh o sát đi u ki n sinh t ng h p chitinase, nhân dòng và bi u hi nự ọ ể ả ề ệ ổ ợ ể ệ chitinase tái t h p.ổ ợ
Hình 3.4. nh kháng n m Ả ấ F. oxysporum c a m t s ch ng Btkủ ộ ố ủ
2kb 3kb
1,5kb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Trang 143.2 Khao sat điêu kiên sinh tông h p chitinase c a ch ng ̉ ́ ̀ ̣ ̉ ợ ủ ủ Bacillus thuringiensis MSS1.1
Qua quá trình kh o sát đi u ki n sinh t ng h p chitinase c a ch ng Btkả ề ệ ổ ợ ủ ủ MSS1.1 thu được k t qu nh sau: Ch ng MSS1.1 khi đế ả ư ủ ược lên men trong môi
trường t i u ố ư g m các thành ph n (g/l): ồ ầ b t ngô 10, Kộ 2HPO4 1, KH2PO4 1, b t đ uộ ậ
tương 10, NaCl 2, MgSO4 0,5, CaCl2 1, MnSO4 0,01, ZnSO4 0,01, FeSO4 0,01; bổ sung chitin huy n phù 0,5%ề , pH môi trường 7, nhi t đ nuôi 28ệ ộ oC thì sau 96 gi lênờ men ho t tính chitinase thu đạ ược là 0,87 U/ml, tăng 1,36 l n so v i môi trầ ớ ường cơ
s ban đ u.ở ầ
3.3. Nhân dong gen ̀ chiA ma hoa chitinase t chung vi khuân ̃ ́ ừ ̉ ̉ B. thuringiensis var. kurstaki MSS1.1
Gen chiA được nhân dòng trong vector pGEM®Teasy. K t qu đ c trình t choế ả ọ ự
th y, đo n gen ấ ạ chiA t DNA c a ch ng vi khu n MSS1.1 có chi u dài 2031ừ ủ ủ ẩ ề nucleotide, co đô t́ ̣ ương đông 99% so v i đoan gen ̀ ớ ̣ chiA cua ch ng ̉ ủ B. thuringiensis serovar kurstaki HD73 trên GenBank có mã s EF581163.2 v i 10 vi tri sai khac vaố ớ ̣ ́ ́ ̀ xuât hiên vi tri căt cua enzym gi i han ́ ̣ ̣ ́ ́ ̉ ớ ̣ BamHI (GGATCC) trong kho ng gi a đo nả ữ ạ gen do s sai khác v trí nucleotide C915T. Trinh t amino acid do gen ự ở ị ̀ ự chiA mã
hoa có đ t́ ộ ương đ ng 99% so v i trinh t amino acid c a ch ng HD73 có mã sồ ớ ̀ ự ủ ủ ố ABQ65137.2 v i s thay đ i c a 5 amino acid.ớ ự ổ ủ
Phân tích trình t gen ự chiA c a ch ng Bt MSS1.1 cho th y gen ủ ủ ấ chiA có 34
amino acid đ u N là peptide tín hi u (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), v iầ ệ ớ
v trí c t gi a amino acid th 34 và 35.ị ắ ở ữ ứ
Phân tích c u trúc d đoán c a protein ChiA t ch ng Bt MSS1.1 cho th y,ấ ự ủ ừ ủ ấ chitinase ChiA có c u trúc 3 vùng đ c tr ng cho h glycosyl hydrolase 18: vùngấ ặ ư ọ
th y phân, vùng fibronectin và vùng g n k t chitin.ủ ắ ế
3.4. Biêu hiên gen ̉ ̣ chiA trong vi khuân ̉ E. coli BL21
3.4.1. Thi t k vector bi u hi n và bi u hi n gen chiA trong vi khu n E.coli BL21 ế ế ể ệ ể ệ ẩ
(DE3)
Đo n gen ạ chiA được g n vào vector bi u hi n pET28b(+) t i v trí c t c aắ ể ệ ạ ị ắ ủ
EcoRI và XhoI, s n ph m ghép n i đả ẩ ố ược bi n n p vào t bào ế ạ ế E. coli ch ngủ DH10B kh bi n. Plasmid tái t h p có ch a gen ả ế ổ ợ ứ chiA được tách, tinh s ch tạ ừ
ch ng DH10B và bi n n p vào t bào ủ ế ạ ế E. coli BL21(DE3) kh bi n b ng phả ế ằ ươ ngpháp s c nhi t và c y tr i trên môi trố ệ ấ ả ường LB th ch b sung 50 µg/ml kanamycin,ạ ổ nuôi 37oC qua đêm. Khu n l c mang gen ẩ ạ chiA được nuôi trong môi trường LB l ngỏ
ch a 50 µg/ml ứ kanamycin, 37ở oC và c m ng b i IPTG n ng đ cu i 0,5 mM. M cả ứ ở ồ ộ ố ứ
đ bi u hi n protein c a dòng t bào đ c ki m tra b ng đi n di trên gelộ ể ệ ủ ế ượ ể ằ ệ polyacrylamide (Hình 3.5A). K t qu xu t hi n m t băng protein kho ng 70 kDa đ mế ả ấ ệ ộ ả ậ
h n so v i m u còn l i.ơ ớ ẫ ạ
Trang 15Đ kh ng đ nh, ti n hành ki m tra b ng Western blot s d ng kháng th đ cể ẳ ị ế ể ằ ử ụ ể ặ
hi u kháng đuôi His tag. K t qu (hình 3.5B) cho th y xu t hi n băng tín hi uệ ế ả ấ ấ ệ ệ
đ m kho ng 70 kDa tậ ả ương ng v i k t qu bi u hi n. Ngoài ra trên ph Westernứ ớ ế ả ể ệ ổ blot cũng th y xu t hi n m t s băng tín hi u th p h n so v i băng đ m chính (70ấ ấ ệ ộ ố ệ ấ ơ ớ ậ kDa) và hoàn toàn không th y xu t hi n băng nào cao h n băng đ m chính này. Sấ ấ ệ ơ ậ ự
xu t hi n c a băng th p h n có th gi i thích là do protein chitinase tái t h p bấ ệ ủ ấ ơ ể ả ổ ợ ị
th y phân không đ c hi u b i protease trong quá trình chu n b m u. Xác đ nhủ ặ ệ ở ẩ ị ẫ ị
ho t tính enzyme c a protein tái t h p qua ph n ng DNS, thu đạ ủ ổ ợ ả ứ ược k t qu 1,10ế ả
± 0,02 U/ml, cao h n ho t tính c a ch ng t nhiên 1,26 l n.ơ ạ ủ ủ ự ầ
Hình 3.5. Ph đi n di protein trên gel SDSPAGE (A) và ổ ệ phân tích Western blot (B)
Hình A. Băng 1: Protein t ng s t ch ng E. coli BL21(DE3)pET28b/chiA sau ổ ố ừ ủ
c m ng IPTG; Băng 2: Protein t ng s t ch ng E. coli BL21(DE3)pET28b/chiA ả ứ ổ ố ừ ủ không c m ng IPTG; Hình B: Băng 1: D ch chi t protein t E. coli BL21(DE3) ả ứ ị ế ừ mang pET28chiA sau c m ng; Băng 2: D ch chi t protein t E. coli BL21(DE3) ả ứ ị ế ừ mang pET28chiA không c m ng;M: Thang protein chu n ả ứ ẩ
3.4.2. Nghiên c u đi u ki n bi u hi n gen chiA c a ch ng tái t h p ứ ề ệ ể ệ ủ ủ ổ ợ
3.4.2.1. Nhi t đ c m ng ệ ộ ả ứ
K t qu th hi n hình 3.ế ả ể ệ ở 6A cho th y, các đi u ki n nhi t đ 28, 30, 34 vàấ ở ề ệ ệ ộ
37oC b n đi n di đ u cho băng đ m kích thả ệ ề ậ ước kho ng 70 kDa. Đ c bi t, m c đả ặ ệ ứ ộ
bi u hi n 30, 34 và 37ể ệ ở oC không khác nhau nhi u. Tuy nhiên, ho t tính enzym thuề ạ
được có s khác bi t đáng k Ho t tính chiA thu đự ệ ể ạ ược khi bi u hi n 30ể ệ ở oC là cao nh t (B ng 3.3)ấ ả , đ ng th i protein tái t h p th tan thu đồ ờ ổ ợ ể ược khi bi u hi n ể ệ ở 30ºC cũng cao nh t (Hình 3.ấ 6B)
B ng 3.3ả Sinh trưởng c a t bào và ho t tính enzyme các nhi t đ c mủ ế ạ ở ệ ộ ả
ng khác nhauứ
Nhi t đ c mệ ộ ả M t đ t bàoậ ộ ế Ho t tínhạ
B A