Mục đích nghiên cứu của luận án nhằm nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh PED tại 10 tỉnh/ thành phố khu vực phía Bắc; Làm rõ được đặc điểm di truyền, đặc điểm dịch tễ học phân tử của các genotype PEDV đang lưu hành ở miền Bắc.
Trang 1HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
NGUYỄN TRUNG TIẾN
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC
CỦA BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH Ở LỢN (PED)
TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM
Chuyên nga ̀nh: Dịch tễ học thú y
Ma ̃ số: 9.64.01.08
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Hµ NéI, 2018
Trang 2Công trình được hoàn thành tại:
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Bá Hiên
Phản biện 1: PGS.TS Đinh Duy Kháng
Viện Công nghệ sinh học
Phản biện 2: PGS.TS Bùi Trần Anh Đào
Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Phản biện 3: PGS.TS Trương Văn Dung
Viện Thú y
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện, họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Vào hồi ngày tháng năm 2018
Có thể tìm hiểu Luận án tại thư viện:
- Thư viện Quốc gia
- Thư viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Trang 3PHẦN I MỞ ĐẦU
1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm do một loại virus thuộc họ
Coronaviridae Dịch PED xuất hiện lần đầu tiên ở châu Âu vào năm 1971,
sau đó bệnh lây lan ra nhiều Quốc gia khác ở châu Á như Trung Quốc, Đài
ở lợn lần đầu tiên được phát hiện vào cuối năm 2008, đầu năm 2009
Mặc dù đã lưu hành ở Việt Nam gần 10 năm, đến nay bệnh tiêu chảy thành dịch do PEDV gây ra vẫn là chủ đề mới mẻ Các nghiên cứu tìm hiểu đặc điểm dịch tễ học của bệnh PED và đặc điểm dịch tễ học phân tử của virus lưu hành ở Việt Nam hiện còn hạn chế Bên cạnh đó, sự xuất hiện và lưu hành của PEDV nhóm mới nổi (thuộc genogroup 2) từ 2010 đã làm giảm hiệu lực của vacxin (sản xuất từ chủng PEDV thuộc genogroup 1) Do vậy, việc làm rõ đặc điểm dịch tễ của bệnh cũng như dịch tễ học phân tử của virus là cơ sở quan trọng cho đề xuất các biện pháp phòng (đặc biệt là lựa chọn đúng loại vacxin)
và chống phù hợp
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
- Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh PED tại 10 tỉnh/ thành phố khu vực phía Bắc;
- Làm rõ được đặc điểm di truyền, đặc điểm dịch tễ học phân tử của các genotype PEDV đang lưu hành ở miền Bắc
1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Trang trại nuôi lợn tại 10 tỉnh miền Bắc có lợn mắc tiêu chảy nghi
do PEDV Các tỉnh này được chia làm 2 khu vực: đồng bằng châu thổ sông Hồng (Hà Nội, Hải Dương, Hưng Yên, Hải Phòng, Thái Bình và Vĩnh Phúc)
và trung du- miền núi (Hòa Bình, Bắc Giang, Thái Nguyên và Lào Cai)
1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
- Đây là một nghiên cứu có hệ thống về PED và PEDV ở Việt Nam
- Đã làm rõ đặc điểm dịch tễ học bệnh PED trên địa bàn 10 tỉnh/ thành phố của miền Bắc Việt Nam Trên cơ sở xác định những biểu hiện bệnh lý của bệnh, đặc điểm dịch tễ học phân tử của căn bệnh, đã khẳng định sự lưu hành phổ biến của PED trong các trang trại chăn nuôi
- Nghiên cứu này đã giải mã được 15 trình tự gen S hoàn chỉnh và 8 trình
tự gen ORF3, so sánh và chứng minh được những chủng PEDV đang lưu hành tại thực địa không có cùng nguồn gốc với các chủng vacxin đang sử dụng
- Xác định được một số đặc điểm dịch tễ học phân tử, từ đó chứng minh được nguồn gốc đa dạng của các chủng PEDV đang lưu hành tại Việt nam
Trang 41.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
- Luận án đã phân tích và chỉ ra một số đặc điểm dịch tễ học của PED tại 10 tỉnh/ thành phố thuộc miền Bắc Việt Nam và mức độ lưu hành của bệnh, chứng minh được nguồn gốc của các chủng PEDV đang lưu hành tại thực địa
- Là tài liệu tham khảo tốt phục vụ cho nghiên cứu về PED và PEDV; là
tư liệu tham khảo cho giảng dạy của chuyên ngành Thú y và Chăn nuôi-Thú y
- Từ kết quả phân tích dịch tễ học phân tử của PEDV đã chỉ rõ mức tương đồng trình tự gen giữa những chủng PEDV phân lập từ thực địa và những chủng vacxin đang sử dụng, từ đó giúp cho việc hoạch định các biện pháp phòng chống bệnh, trong đó có lựa chọn vacxin phòng bệnh phù hợp
PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 GIỚI THIỆU CHUNG
Dịch tiêu chảy cấp ở lợn (Porcine Epidemic Diarrhea- PED) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm do một loại virus thuộc giống
Alphacoronavirus, họ Coronaviridae gây ra Dịch PED thường xảy ra ở lợn
con dưới 7 ngày tuổi với tỷ lệ ốm và tỷ lệ chết có thể lên đến 100% Dịch PED đã và đang gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng đối với ngành chăn nuôi lợn ở nhiều quốc gia trên thế giới Dịch PED lần đầu tiên được phát hiện ở Anh vào năm 1971, sau đó các ổ dịch liên tục được phát hiện và xảy ra phổ biến ở các quốc gia châu Âu khác như Bỉ, Đức, Pháp, Hà Lan, Thụy Sỹ, và
ở châu Á như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan Ở Việt Nam, dịch PED lần đầu tiên được phát hiện vào năm 2008 và từ đó đến nay dịch bệnh thường xuyên xảy ra và gây ra ảnh hưởng nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn trong cả nước
2.2 ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA PEDV
Để xác định mối quan hệ giữa các chủng PEDV, các phân tích về cây phả
hệ (phylogenetic tree) và đặc điểm di truyền được tiến hành dựa trên các trình tự gen S, M, và ORF3 đôi khi cả gen E Nghiên cứu trên một phần của gen S và toàn bộ gen M đã gợi ý chia PEDV thành 3 nhóm (G1, G2, và G3), mỗi nhóm cũng được chia thành các nhóm nhỏ hơn (G1-1, G1-2, và G1-3) Phân tích cây phả hệ dựa trên trình tự gen S và M đều chỉ ra rằng các chủng PEDV phân lập được ở Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan và Việt Nam có độ tương đồng cao và khác biệt với các chủng PEDV phân lập được từ các Quốc gia Châu Âu Phân tích mối liên hệ gen giữa các chủng PEDV có thể được thực hiện trên cơ sở phân tích toàn bộ hệ gen của virus Nhiều nghiên cứu cho thấy trình tự của gen mã hóa spike protein hoặc phân đoạn gen mã hóa vùng S1 của spike protein (amino acid 1- 735) là phù hợp để phân tích đặc điểm tiến hóa của virus Theo tác giả Lee (2015), mặc dù chỉ có 1 serotyp duy nhất,
Trang 5PEDV có thể được chia làm 2 genogroup: nhóm G1 cổ điển (G1, classical)
và nhóm G2 (field epidemic/ pandemic) Mỗi nhóm lại được chia thành nhiều dưới nhóm: 1a, 1b và 2a, 2b Nhóm G1a bao gồm chủng nguyên mẫu CV777, chủng virus vacxin và các chủng virus thích nghi trên tế bào Nhóm G1b bao gồm một số biến chủng mới được phát hiện lần đầu tiên ở Trung Quốc vào năm 2011, sau đó được phát hiện ở Mỹ vào năm 2014, ở Hàn Quốc năm
2013 và một số nước châu Âu Nhóm G2 được chia thành dưới nhóm 2a (gây
ra các vụ dịch PED ở châu Á trước đây) và dưới nhóm 2b (gây ra các vụ dịch
ở châu Á và bắc Mỹ gần đây)
Nhóm cổ điển G1a lưu hành ở Trung Quốc có thể xuất phát từ việc sử dụng các chủng virus vacxin hoặc do nhập lậu chủng virus vacxin nhược độc
từ Hàn Quốc Nhóm G2a bắt nguồn từ Hàn Quốc, lây lan sang Trung Quốc
và sau đó lây sang các nước Đông Nam Á như: Thái Lan, Việt Nam Nhóm G2a ở các nước Đông Nam Á cũng có thể bắt nguồn trực tiếp từ Hàn Quốc Nhóm di truyền mới nổi G1b và G2b hình thành ở Trung Quốc có thể là kết quả của quá trình tái tổ hợp giữa virus thuộc nhóm G1a và G2a lưu hành tại nước này Cả 2 nhóm này sau đó lây lan gần như đồng thời sang Mỹ, và sau
đó xuất hiện ở Hàn Quốc, một số nước bắc Mỹ, nam Mỹ và có thể cả Nhật Bản và Đài Loan
Dựa vào hiện tượng thêm – xóa (insertion- deletion) ở gen mã hóa spike protein (S INDEL), có thể chia PEDV làm 2 nhóm: NON- S INDEL
và S INDEL Ở Mỹ, những biến thể thuộc nhóm S INDEL gây ra các ổ dịch
có triệu chứng lâm sàng nhẹ Các chủng PEDV phân lập được ở châu Âu (Đức, Ý, Bỉ, Hà Lan và Pháp) vào năm 2014 và 2015 đều thuộc nhóm S INDEL cùng với nhóm lưu hành ở Mỹ
PHẦN 3 NỘI DUNG- NGUYÊN LIỆU- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.1.1 Tình hình dịch PED tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam
- Điều tra tình hình PED từ năm 2013 – 2015 tại 10 tỉnh miền Bắc,
- Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và bệnh tích của lợn mắc PED
3.1.2 Phân tích đặc điểm về trình tự gen
- Giải trình tự gen S và ORF3 của các chủng PEDV lưu hành
- Phân tích đặc điểm trình tự gen S và gen ORF3 của các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam
3.1.3 Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học phân tử
- Nghiên cứu đặc điểm về sự lưu hành theo nhóm di truyền
- Nghiên cứu hiện tượng tái tổ hợp của PEDV lưu hành ở Việt Nam
Trang 6- Nghiên cứu sự phát tán theo không gian và thời gian của các chủng PEDV dựa vào trình tự gen S và gen ORF3 của hai genogroup
3.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
- Mẫu phân hoặc mẫu ruột của lợn nghi mắc tiêu chảy do PEDV
- Bộ kít tổng hợp cDNA, bộ kít PCR
- Trình tự gen S và gen ORF3 của các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam và trên thế giới có đầy đủ thông tin về địa điểm và thời gian phân lập
- Cặp mồi đặc hiệu được thừa hưởng từ các nghiên cứu trước đây
3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1 Phương pháp điều tra một số đặc điểm dịch tễ
Thu thập thông tin các đàn lợn có triệu chứng của bệnh PED từ các trại trên địa bàn nghiên cứu thông qua các kỹ thuật viên của trại
3.3.2 Phương pháp theo dõi lâm sàng
Dựa vào quan sát triệu chứng lâm sàng và bệnh tích để bước đầu xác định bệnh
3.3.3 Phương pháp mổ khám
Mổ khám nhằm xác định được các biến đổi đại thể của các cơ quan,
tổ chức của lợn mắc PED, cần tiến hành mổ khám những lợn có biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh Lợn bệnh được cố định cẩn thận, tiến hành lấy máu từ vịnh tĩnh mạch cổ Lột da và bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, tách các cơ quan nội tạng khỏi cơ thể để quan sát và chụp ảnh
3.3.4 Phương pháp lấy mẫu
Mẫu được thu thập trên thực địa từ những lợn có biểu hiện lâm sàng tiêu chảy cấp tại các trại chăn nuôi ở một số địa phương thuộc miền Bắc Việt Nam, bao gồm: (i) các đoạn ruột và hạch ruột, (ii) phân Mẫu được bảo quản lạnh sau khi lấy và trong suốt quá trình vận chuyển
3.3.5 Phương pháp tách ARN tổng số và tổng hợp cDNA
- ARN tổng số được tách bằng TRIzol
- cDNA được tổng hợp từ RNA đã được tách chiết nhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase), sử dụng kit SuperScript (Invitrogen) và oligo dT
3.3.6 Phương pháp RT-PCR phát hiện PEDV
- Các mẫu bệnh phẩm này sau đó được dùng chẩn đoán PED bằng phản ứng RT-PCR với các cặp mồi đặc hiệu của PEDV
3.3.7 Phương pháp giải trình tự gen
Sản phẩm PCR tinh sạch được giải trình tự theo hai chiều (xuôi và ngược) bằng phương pháp Sanger Trình tự nucleotide tiếp tục được phân tích bằng chương trình tin sinh học BioEdit v7.1.3.0 trên cơ sở đối chiếu so sánh (i) giữa trình tự nucleotide được giải trình tự theo chiều xuôi và chiều ngược, và (ii) với trình tự gen S hoặc ORF3 tham chiếu công bố trên ngân hàng gen
Trang 73.3.8 Phương pháp xác định khoảng cách di truyền
Phần mềm MEGA7 (Kumar et al., 2016) được dùng để tính khoảng
cách di truyền (genetic distance) giữa các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam, dựa vào trình tự gen S (n=38) và gen ORF3 (n=12) Các mô hình mô phỏng
sự biến đổi nucleotide được dùng bao gồm: Kimura-2P (K2P), Tajama-Nei, Tamura-3P và Tamura-Nei Khoảng cách di truyền giữa các chủng virus sau
đó được sắp xếp biểu diễn dưới dạng đồ thị tần suất
3.3.9 Phương pháp xây dựng cây phả hệ
Cây phả hệ (dựa vào trình tự gen S hoặc gen ORF3) được xây dựng như sau:
(i) Lập cơ sở dữ liệu bao gồm các chủng PEDV thu nhận từ ngân hàng
gen và các chủng đã biết genogroup (Lin et al., 2016)
(ii) Sắp xếp (alignment) trình tự nucleotide theo cột trên cơ sở bộ ba
mã hóa (codon- based alignment) bằng phần mềm MAFFT (Katoh and
Standley, 2013) và PAL2NAL (Suyama et al., 2006)
(iii) Xây dựng cây phả hệ bằng thuật toán neighbor-joining được tích
hợp trong chương trình MEGA (Kumar et al., 2016) Mức tin cậy của các
nhánh phân chia ở mỗi nút (node) được biểu thị bằng giá trị bootstrap (iv) Phần mềm FigTree (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/) được dùng để biểu diễn và hiệu đính cây phả hệ
3.3.10 Phương pháp phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử
Sử dụng phần mềm BEAST (Drummond et al., 2012) để xây dựng lại
quá trình phát tán theo không gian (quốc gia- quốc gia, địa phương- địa phương) và thời gian (năm) của PEDV dựa vào trình tự gen S hoặc gen ORF3 Các tham số của mô hình dựa theo kết quả của nghiên cứu trước đây
- Các phép kiểm định được thực hiện với mức ý nghĩa là α = 0,05
PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 TÌNH HÌNH DỊCH PED Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC TỪ 2013-2015 4.1.1 Kết quả phát hiện PEDV trong mẫu bệnh phẩm từ 2013-2015
Trong khuôn khổ của đề tài, tình hình dịch PED đã được nghiên cứu tại các đàn lợn có triệu chứng của bệnh PED tại Hà Nội, Hải Dương, Hải Phòng, Hưng Yên, Thái Bình, Vĩnh Phúc, Hòa Bình, Bắc Giang, Lào Cai và
Trang 8Thái Nguyên Kết quả RT-PCR phát hiện PEDV trong mẫu bệnh phẩm được trình bày ở bảng 4.1
Bảng 4.1 Kết quả phát hiện PEDV trong mẫu thu thập từ 2013-2015
mẫu*
Số mẫu kiểm tra
Số mẫu dương tính
Tỷ lệ % dương tính
Tỷ lệ trung bình
10 tỉnh cho giá trị p = 0,841 > 0,05 Do vậy, khác biệt về tỷ lệ nhiễm PEDV giữa các địa phương là không có ý nghĩa thống kê ở mức 95% Xét trên khía cạnh vị trí địa lý, kết quả trên cho thấy dịch PED không chỉ xảy ra ở các tỉnh thành tiếp giáp nhau như Hà Nội, Hải Phòng, Hải Dương, Hưng Yên và Thái Bình; mà còn phát hiện được ở một số tỉnh xa như Thái Nguyên, Lào Cai Ngoài 10 tỉnh thuộc phạm vi nghiên cứu, PEDV cũng được phát hiện ở Bắc Ninh, Hà Nam, Phú Thọ, Thanh Hóa, Nghệ An và Quảng Trị (kết quả không trình bày)
Đối với 2 loại mẫu xét nghiệm là phân và ruột, kết quả ở bảng 4.2 cho biết tỷ lệ mẫu ruột dương tính với PEDV (40,00% - 66,60%, trung bình 53,90%) cao hơn so với tỷ lệ mẫu phân dương tính với virus (28,50% -
Trang 950,00%, trung bình 38,00%) Bằng phân tích phương sai một nhân tố, sự khác biệt kể trên là có ý nghĩa thống kê (p = 0,004 < 0,05) Kết quả xét nghiệm này phù hợp với công bố của Nguyễn Tất Toàn và cs (Nguyễn Tất
Toàn và cs., 2012, Nguyễn Tất Toàn and Đỗ Tiến Duy, 2012), trong đó nhóm
tác giả cũng phát hiện được 58,14% mẫu ruột non dương tính PEDV và cao hơn nhiều so với các mẫu phân (16,96%)
Mặc dù tất cả mẫu bệnh phẩm nêu trên (bảng 4.1) được lấy ở lợn có triệu chứng tiêu chảy nghi ngờ do nguyên nhân virus như: (i) nôn, phân nhiều nước và có cục sữa không tiêu; hoặc (ii) ruột non căng phồng, có cục sữa không tiêu ở các đoạn ruột già, v.v nhưng chỉ có trung bình 41,98% mẫu dương tính PEDV Kết quả này có thể do lợn được lấy mẫu nhiễm các virus gây tiêu chảy khác Khả năng này là có thể bởi lẽ trong một công bố gần đây, deltacoronavirus đã được phát hiện ở Hà Nội và Thái Bình là hai tỉnh thuộc phạm vi thu thập mẫu của nghiên cứu này (Lê Văn Phan và cs., 2017)
4.1.2 Tình hình dịch PED ở một số tỉnh miền Bắc theo trang trại
Những nghiên cứu trong vòng 5 năm trở lại đây tại Việt Nam cho thấy PEDV là nguyên nhân chủ yếu gây bùng phát dịch tiêu chảy trên lợn (Do Tien
Duy et al., 2011; Vui et al., 2015) Do không nằm trong danh mục các bệnh
bắt buộc phải khai báo dịch, nên tình hình dịch PED ở ngoài thực địa được dự đoán xảy ra trên diện rộng Để làm rõ hơn tình hình dịch PED ở 10 tỉnh miền Bắc, kết quả xét nghiệm được tổng hợp theo trang trại và được trình bày ở bảng 4.2
Bảng 4.2 Tình hình dịch PED ở một số tỉnh miền Bắc
theo trang trại
theo dõi
Số trại dương tính
Tỷ lệ (%) dương tính
Trang 10trang trại mắc PED Kết quả này cho thấy PEDV xuất hiện khá phổ biến ở các địa phương thuộc phạm vi nghiên cứu của đề tài này
Xét về mặt địa lý, 6 tỉnh thuộc đồng bằng châu thổ sông Hồng đều có
tỷ lệ trang trại dương tính trên 50% Cụ thể, tỷ lệ trang trại dương tính cao nhất là ở Hưng Yên (85,71%) và Hà Nội (80,00%); tiếp đến là Hải Dương, Hải Phòng, Thái Bình với tỷ lệ dương tính lần lượt là 66,67%, 60,00% và 60,00% Ngược lại, ở 4 tỉnh trung du- miền núi phía Bắc, tỷ lệ trang trại dương tính với PEDV đều dưới 50%, ví dụ như: Lào Cai là 33,33% và Bắc Giang là 25,00% Kết quả tính chung theo vùng địa lý cho thấy tỷ lệ trang trại có PEDV lưu hành ở 6 tỉnh đồng bằng sông Hồng cao hơn rõ rệt so với các trang trại ở 4 tỉnh trung du- miền núi (68,42% so với 35,29%), ở mức tin cậy 95% (phụ lục 1) Sự khác biệt về tỷ lệ trang trại dương tính PEDV ở 2 vùng nói trên có thể do các tỉnh đồng bằng có số lượng hộ chăn nuôi lớn và mật độ chăn nuôi lợn cao nên tỷ lệ mắc PED cao hơn so với các trại ở khu vực vùng trung du - miền núi
Tổng hợp các kết quả trình bày ở bảng 4.1 và bảng 4.2 cho phép rút
ra nhận xét: kể từ khi PEDV được công bố lần đầu tại miền Nam năm 2009
(Do Tien Duy et al., 2011), dịch tiêu chảy ở lợn do PEDV gây ra đã xuất
hiện ở miền Bắc với không gian trải rộng (10/10 tỉnh thu thập mẫu) và liên tục theo thời gian (trong các năm thu thập mẫu từ 2013-2015)
4.1.3 Kết quả theo dõi triệu chứng, bệnh tích của lợn mắc PED
Để làm rõ đặc điểm về triệu chứng và bệnh tích đặc trưng của lợn mắc tiêu chảy do virus, nghiên cứu này đã tìm hiểu triệu chứng và bệnh tích của
50 lợn con theo mẹ (giai đoạn mẫn cảm nhất với PEDV) đã được khẳng định chỉ dương tính với PEDV (bảng 4.3, bảng 4.4)
Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của lợn
mắc PED
Địa điểm Số con theo
dõi
Số con có triệu chứng Nôn mửa Mùi phân
tanh, gây
Phân lỏng,
có cục sữa
Lông xù, bết phân Mất nước
Trang 11nghiên cứu này đã tập trung làm rõ đặc điểm triệu chứng và bệnh tích ở nhóm lợn này Kết quả trình bày ở bảng 4.3 cho biết lợn con mắc tiêu chảy do PEDV thường biểu hiện 2 triệu chứng liên quan tới hiện tượng tiêu chảy Phổ biến nhất là triệu chứng lợn con gầy sọp do mất nước (82%), tiếp theo
là hiện tượng lông xù, bết phân ở toàn thân (80%) Kết quả tổng hợp ở bảng 4.3 cũng cho thấy rõ tỷ lệ lợn có triệu chứng lâm sàng điển hình của lợn mắc tiêu chảy do PED: phân tanh và có mùi gây đặc trưng (64%), một số trường hợp trong phân có cục sữa không tiêu (38%) Ngoài các triệu chứng nêu trên, lợn bệnh còn có biểu hiện chung như run rẩy, nằm chồng đống lên nhau, v.v (kết quả không trình bày) Các đặc điểm về triệu chứng ở lợn con theo
mẹ nhiễm PEDV kể trên cũng được mô tả ở nhiều nghiên cứu trong và ngoài
nước (Nguyễn Văn Điệp và cs., 2014; Sun et al., 2012) Tuy nhiên, hiện
tượng nôn mửa chỉ chiếm 7 trong tổng số 50 ca theo dõi (14%)
Tóm tắt kết quả nghiên cứu bệnh tích của lợn con theo mẹ mắc PED được tổng hợp và trình bày ở bảng 4.4
Bảng 4.4 Kết quả nghiên cứu bệnh tích đại thể của lợn mắc PED
trong
Xung huyết
hệ tiêu hóa chủ yếu tập trung vào các đặc điểm giảm tiêu hóa/ giảm hấp thu 100% số lợn mổ khám đều quan sát được sữa đông vón trong dạ dày Khác với nhiều nghiên cứu khác, cục sữa đông vón trong dạ dày thường được nhấn mạnh như một bệnh tích điển hình của lợn mắc PED (Nguyễn Văn Điệp và
cs., 2014) Tuy nhiên, trong quá trình mổ khám, đặc điểm này còn thấy cả ở
nhóm lợn con theo mẹ không mắc PED (kết quả không trình bày) Do đó, cục sữa đông trong dạ dày là do lợn con theo mẹ chết mà không kịp tiêu hóa hết, không phải là bệnh tích điển hình của bệnh Hiện tượng ruột non có màu trong, chứa nhiều dịch xuất hiện với tỷ lệ cao nhất (60%) Cục sữa
Trang 12không tiêu ở các đoạn ruột non và kết tràng xuất hiện với tỷ lệ không cao
(khoảng 20%)
4.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM VỀ TRÌNH TỰ GEN
Để làm cơ sở cho so sánh đa chiều về đặc điểm sinh học phân tử cũng
như đặc điểm dịch tễ học phân tử, chúng tôi tiến hành thu thập toàn bộ trình
tự gen S và ORF3 của PEDV lưu hành ở Việt Nam Do vậy, cơ sở dữ liệu
về trình tự gen S bao gồm 38 trình tự hoàn chỉnh của gen mã hóa spike
protein (gen S), thu thập trong khoảng 2013- 2016, ở 11 tỉnh/ thành phố
thuộc miền Bắc, miền Trung và miền Nam Cơ sở dữ liệu trình tự gen ORF3
bao gồm 12 trình tự gen ORF3 hoàn chỉnh, thu thập trong khoảng 2013-
2014 tại 6 tỉnh thành thuộc miền Bắc, miền Trung và miền Nam
4.2.1 Đặc điểm gen S của các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam
4.2.1.1 Đặc điểm về tính đa dạng di truyền của gen S
Đặc điểm đầu tiên phản ánh tính đa dạng của PEDV lưu hành ở Việt
Nam là sự biến động chiều dài gen S Cụ thể, gen S của 38 chủng PEDV
được phân tích trong nghiên cứu này có kích thước: 4140 nt (1 chủng), 4146
nt (6 chủng), 4149 nt (5 chủng), 4155 nt (16 chủng), 4158 nt (9 chủng) và
4179 nt (1 chủng)
Vị trí nucleotide (trục Ox) và tỷ lệ % tương đồng nucleotide (trục Oy)
Hình 4.1 Tỷ lệ % tương đồng về trình tự gen S của 38 chủng PEDV
Dễ nhận thấy ở 4/5 chiều dài gen S (nucleotide 800 - 4188), 38 chủng
PEDV có sự tương đồng > 90% về trình tự nucleotide (ngoại trừ chủng
KJ960178 (vùng C) và chủng KX708903 (vùng D)) Ở hai vùng A và B (từ
nucleotide 1 - 800), mức tương đồng về trình tự gen giữa các chủng PEDV
trong nghiên cứu này là thấp nhất, dao động từ 63,7% - 87,9% Sự biến động
về mức tương đồng trên dọc chiều dài gen S giữa các chủng PEDV lưu hành
ở Việt Nam cũng đã được biết đối với một số chủng virus lưu hành trên thế
giới, trong đó có Trung Quốc
KX982561_HaNoi_2013 KX982564_HoaBinh_2013 KX982553_HungYen_2013 KX982557_HungYen_2013 KJ960180_HungYen_2013 KP455313_ThaiBinh_2013 KJ960178_DongNai_2013 KJ960179_VungTau_2013 KP455320_HaiPhong_2014 KX982568_HaNoi_2014 KX982569_HoaBinh_2014 KT941120_HungYen_2014 KX982572_ThaiBinh_2014 KX982571_VinhPhuc_2014 KP455315_QuangTri_2014 KP455317_QuangTri_2014 KP455319_QuangTri_2014 KX708903_HaiPhong_2015 KX708902_HaiPhong_2015 KX708896_HaNoi_2015 KX982573_HungYen_2015 KX708906_HungYen_2015 KX708904_LaoCai_2015 KX708897_ThaiNguyen_2015 KX708895_ThaiNguyen_2015 KX708899_VinhPhuc_2015 KX708894_HungYen_2016
SimPlot - Query: Spike_AF353511_CV777 FileName: D:\ATien\Simplot-Vietnam\S-vietnam-ref-nu-al.fasta.txt
Window : 200 bp, Step: 20 bp, GapStrip: On, Kimura (2-parameter), T/t: 2.0
Position
4,000 3,800 3,600 3,400 3,200 3,000 2,800 2,600 2,400 2,200 2,000 1,800 1,600 1,400 1,200 1,000 800 600 400
Đồng Nai, 2013
Trang 134.2.1.2 Đặc điểm đột biến ở vùng quyết định kháng nguyên COE
Vùng quyết định kháng nguyên COE (aa 499 – 638, hình 4.2) được xác định bao gồm một vùng quyết định kháng nguyên kích thích sản sinh kháng thể trung hoà từ aa 499-600 (tương đương aa 496-597 của chủng CV777) So với chủng tham chiếu CV777, 38 chủng PEDV của Việt Nam sai khác ở 31 vị trí, tập trung tại 8 vị trí là amino acid 517, 521, 527, 549,
594, 605, 612 và 635 Vùng quyết định kháng nguyên COE còn đóng vai trò
là receptor gắn thụ thể pAPN (porcine aminopeptidase-N) Trong 4 vị trí gắn với pAPN (đóng khung từ 1-4), có tới 3 vị trí trong đó xảy ra đột biến Trình
tự amino acid ở vùng gắn pAPN số 3 nhìn chung là bảo thủ (trừ 3 chủng là KJ960178, KJ960179, KJ960180 có đột biến) Đột biến ở vùng bám pAPN cũng đã được xác định đối với PEDV lưu hành ở nhiều nước trên thế giới
Các vùng gắn với thụ thể porcine aminopeptidase-N (pAPN) được đóng khung Vùng kích thích sản sinh kháng thể trung hòa (aa 496-597) được xác định bởi Okda và cs.,
2017 Vị trí đột biến dẫn tới khả năng lẩn tránh kháng thể trung hòa được đánh dấu bởi mũi tên Vị trí amino acid được đánh dấu theo chủng tham chiếu CV777
Hình 4.2 Trình tự amino acid ở vùng COE của 38 chủng PEDV
Mặc dù có bằng chứng trái ngược nhau nhưng pAPN (đặc biệt là tiểu phần VII) được chứng minh đóng vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình bám và xâm nhập của PEDV vào tế bào Đối với coronavirus, vùng kháng nguyên làm nhiệm vụ gắn kết với tế bào vật chủ thường là đích tác động của
.| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
Spike_AF353511_CV777 V S H N S AA F GG L SS A LV A TT I SS F T T F T G K S F S Y S V STS LL A T F A G TS L F E LI T K G V KX982561_HaNoi_2013 H I T D D KX982564_HoaBinh_2013 H I E KX982553_HungYen_2013 H I E KX982554_HungYen_2013 H I E KX982557_HungYen_2013 H I E KJ960180_HungYen_2013 H I S P T E KP455313_ThaiBinh_2013 .I E KP455314_ThaiBinh_2013 .I E KJ960178_DongNai_2013 K H I P T G E KJ960179_VungTau_2013 H I S P T E KP455320_HaiPhong_2014 H I E KX982568_HaNoi_2014 H I E KX982570_HaNoi_2014 H I T D D KX982569_HoaBinh_2014 P I D A KT941120_HungYen_2014 P I A D A KX982572_ThaiBinh_2014 H I E KX982571_VinhPhuc_2014 H I E KP455315_QuangTri_2014 H I E KP455316_QuangTri_2014 H I E KP455317_QuangTri_2014 H I E KP455318_QuangTri_2014 H I C E KP455319_QuangTri_2014 H I E KX708903_HaiPhong_2015 H I E KX708901_HaiPhong_2015 .I E KX708902_HaiPhong_2015 .I E KX708896_HaNoi_2015 H I E KX982573_HungYen_2015 H I D V KX982576_HungYen_2015 H I N E KX708906_HungYen_2015 P I N D A KX708907_HungYen_2015 P I A D A KX708904_LaoCai_2015 H I D KX708905_LaoCai_2015 H I D KX708897_ThaiNguyen_2015 H I E KX708898_ThaiNguyen_2015 H I E KX708895_ThaiNguyen_2015 H I E S KX708899_VinhPhuc_2015 H I E KX708900_VinhPhuc_2015 H I E KX708894_HungYen_2016 H I E S
aa 496- 597