Mục đích nghiên cứu của luận án nhằm đánh giá ảnh hưởng của ba kiểu canh tác chuyên lúa (ngập nước thường xuyên, điều kiện yếm khí chiếm ưu thế, lúa - màu (ngập khô luân phiên, điều kiện yếm khí xen kẽ hiếu khí) và chuyên màu (môi trường cạn, điều kiện hiếu khí chiếm ưu thế) và loại đất (đất phèn và đất phù sa) lên sự hiện diện của nhóm và dòng vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí có khả năng phân hủy chlorpyrifos ethyl trong đất.
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: KHOA HỌC ĐẤT
Mã ngành: 9620103
TRƯƠNG QUỐC TẤT
ĐÁNH GIÁ SỰ LƯU TỒN VÀ PHÂN LẬP VI KHUẨN
CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CHLORPYRIFOS ETHYL TRÊN
BA MÔ HÌNH CANH TÁC: CHUYÊN LÚA, LÚA-MÀU VÀ CHUYÊN MÀU
Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG
Cần Thơ, 2018
Trang 2CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
Người hướng dẫn chính: TS Dương Minh Viễn
Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Trường Họp tại:
Vào lúc ……… ngày ……… tháng …… năm ………
Phản biện 1: ………
Phản biện 2: ………
Phản biện 3: ………
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ
Thư viện Quốc gia Việt Nam
Trang 3DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
1 Trương Quốc Tất, Nguyễn Thị Anh Thư, Dương Minh Viễn (2016) Phân lập vi khuẩn phân hủy thuốc trừ sâu Chlorpyrifos ethyl từ đất canh tác lúa ở Đồng bằng sông Cửu Long Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, số 9 năm 2016, 33-38
2 Trương Quốc Tất, Huỳnh Thị Cẩm My, Dương Minh Viễn (2016) Sự phân hủy Chlorpyrifos ethyl bởi hệ vi khuẩn kỵ khí Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, số
10 năm 2016, 47-53
3 Truong Quoc Tat, Duong Minh Vien, (2016) Isolation and Identification of Degrading Bacteria From Rice-upland Crop Soil in The Mekong Delta Scientific Journal of Thu Dau Mot University, ISSN 1859-4433
Chlorpyrifos-4 Trương Quốc Tất, Dương Minh Viễn, (2017) Khảo sát khả năng phân hủy yếm khí chlorpyrifos ethyl của hệ vi khuẩn trên đất canh tác chuyên canh lúa tại Phụng Hiệp- Hậu Giang Tạp chí khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội ISSN: 2588-1140, Vol.33, No.2S, 2017
Trang 4CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ LUẬN ÁN 1.1 Giới thiệu
Chlorpyrifos ethyl là loại thuốc trừ sâu thuộc nhóm lân hữu cơ, có khả năng hấp phụ vào đất cao, tan trong nước thấp và có độc tính cao Do đó, nếu chlorpyrifos ethyl được sử dụng lâu dài trong canh tác nông nghiệp sẽ gây ô nhiễm môi trường đất, nước, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng Sự tăng cường phân hủy sinh học chlorpyrifos ethyl lưu tồn trong đất có thể góp phần giảm thiểu ô nhiễm hoạt chất này trong canh tác nông nghiệp Vì thế, luận án này được thực hiện với mục tiêu đánh giá dư lượng chlorpyrifos ethyl trong đất và ảnh hưởng của 3 mô hình canh tác chuyên lúa, lúa - màu và chuyên màu đến sự lưu tồn chlorpyrifos ethyl trong đất phèn và đất phù sa Đồng thời đánh giá sự phân hủy yếm khí chlorpyrifos ethyl, sự đa dạng của
vi khuẩn khử -Cl trong đất phèn, đất phù sa chuyên canh lúa và tuyển chọn, phân lập vi khuẩn, đánh giá ảnh hưởng của 3 mô hình canh tác chuyên lúa, lúa - màu và chuyên màu đến sự đa dạng của vi khuẩn hiếu khí phân hủy chlorpyrifos ethyl trong đất
1.2 Mục tiêu nghiên cứu của luận án
- Đánh giá ảnh hưởng của kiểu canh tác (chuyên lúa, lúa-màu, chuyên màu) và loại đất (đất phèn và đất phù sa) lên dư lượng và sự lưu tồn chlorpyrifos ethyl trong đất
- Đánh giá ảnh hưởng của ba kiểu canh tác chuyên lúa (ngập nước thường xuyên, điều kiện yếm khí chiếm ưu thế, lúa - màu (ngập khô luân phiên, điều kiện yếm khí xen kẽ hiếu khí)
và chuyên màu (môi trường cạn, điều kiện hiếu khí chiếm ưu thế) và loại đất (đất phèn và đất phù sa) lên sự hiện diện của nhóm và dòng vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí có khả năng phân hủy chlorpyrifos ethyl trong đất
1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án
Những kết quả nghiên cứu của luận án nhằm bổ sung những tư liệu khoa học về dư lượng
sự lưu tồn và vi khuẩn phân hủy chlorpyrifos ethyl trong đất chuyên lúa, lúa - màu và chuyên màu ở ĐBSCL; Kết quả này là nguồn tư liệu phục vụ cho việc giảng dạy và nghiên cứu khoa học nhằm quản lý và phục hồi đất ô nhiễm chlorpyrifos ethyl
1.4 Những điểm mới của luận án
Nghiên cứu đã chứng minh có dư lượng chlorpyrifos ethyl trong đất phèn và đất phù sa sau mùa vụ trên 3 mô hình canh tác chuyên lúa, lúa - màu và chuyên màu ở ĐBSCL Đồng thời loại đất (đất phù sa và đất phèn) đã ảnh hưởng đến sự lưu tồn và dư lượng chlorpyrifos ethyl trong đất
Trang 5Đây là nghiên cứu đầu tiên chứng minh được rằng có sự hiện diện của vi khuẩn hiếu khí bản địa trong đất phèn chuyên lúa và đất phù sa chuyên màu và lúa - màu ở ĐBSCL có khả năng sử dụng chlorpyrifos ethyl như là nguồn carbon Song song đó, nghiên cứu cũng đã chứng minh được rằng có hoạt động của các quần xã vi khuẩn kỵ khí có khả năng khử chlor của chlorpyrifos ethyl trong đất phèn và đất phù sa chuyên canh lúa ở ĐBSCL Đồng thời nghiên cứu cho thấy mô hình canh tác và loại đất đã ảnh hưởng đến sự hiện diện của vi khuẩn phân hủy chlorpyrifos ethyl trong đất Cụ thể, trong đất phèn chuyên lúa có sự hiện diện của cả vi khuẩn hiếu khí và kị khí có khả năng phân hủy chlorpyrifos ethyl; trong khi đó, ở đất phù sa vi khuẩn kỵ khí hiện diện ở mô hình chuyên lúa, vi khuẩn hiếu khí hiện diện ở đất chuyên màu và lúa-màu
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: Từ tháng 01 năm 2013 đến tháng 01 năm 2016
- Địa điểm: Khảo sát, điều tra, thu mẫu đất phân lập vi khuẩn và thực hiện thí nghiệm đánh giá dư lượng chlorpyrifos ethyl trong đất canh tác chuyên lúa, lúa - màu và chuyên màu tại Bình Minh và Bình Tân - Vĩnh Long, Cai Lậy - Tiền Giang, Chợ Mới - An Giang và Phụng Hiệp - Hậu Giang
3.2 Phương pháp nghiên cứu của từng nội dung
3.2.1 Nội dung 1: Đánh giá dư lượng chlorpyrifos ethyl trong đất phèn chuyên lúa, chuyên mía và trong đất phù sa chuyên lúa, lúa - màu và chuyên màu tại một số địa điểm
ở Đồng bằng Sông Cửu Long
- Địa điểm thu mẫu gồm: Bình Tân và Bình Minh,Vĩnh Long, Phụng Hiệp - Hậu Giang, Cai Lậy - Tiền Giang Ở mỗi địa điểm thu đất ở 3-4 ruộng trên mỗi mô hình
- Phương pháp thu mẫu đất: Sử dụng khoan thu mẫu đất ở độ sâu 0 - 20 cm, mỗi ruộng lấy ngẫu nhiên 12 điểm, trộn đều thành một mẫu và chứa trong túi nylon Dư lượng chlorpyrifos ethyl trong các mẫu đất được phân tích theo quy trình của Trương Quốc Tất và Dương Minh Viễn (2017) Đồng thời quy trình này cũng được sử dụng để xác định dư lượng chlorpyrifos ethyl còn lại trong đất ở tất cả các nội dung khác của luận án
3.2.2 Nội dung 2: Đánh giá sự lưu tồn chlorpyrifos ethyl trong đất phèn và đất phù
sa chuyên lúa, lúa - màu và chuyên màu ở điều kiện đồng ruộng và điều kiện nhà lưới
Trang 63.2.2.1 Đánh giá sự lưu tồn chlorpyrifos ethyl trong đất phù sa chuyên lúa, lúa - màu
và chuyên màu ở điều kiện nhà lưới
- Địa điểm: Thí nghiệm được thực hiện trong nhà lưới tại Bộ môn Khoa học Đất, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ
- Vật liệu cho thí nghiệm: Đất sử dụng trong thí nghiệm được thu từ đất chuyên trồng lúa
ở huyện Cai Lậy, tỉnh Tiền Giang Mẫu đất được thu ở độ sâu từ 0 - 20 cm, ở thời điểm chuẩn
bị đất cho vụ tiếp theo (đất ngập nước 0,5 - 1 cm)
- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được thực hiện trong chậu, với đường kính và chiều cao của chậu là 30 cm và 15 cm Trọng lượng khô của đất trong mỗi chậu là 7 kg Hàm lượng chlorpyrifos ethyl được bổ sung đạt 1,5 ppm trong đất ở mỗi chậu Thí nghiệm được bố trí sao cho 4 lặp lại trong 1 nghiệm thức và các nghiệm thức trong 1 mô hình đặt cạnh nhau nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho việc kiểm soát lượng nước tưới và khảo sát 2 nhân tố là mô hình canh tác (chuyên lúa, 2 lúa - 1 đậu và chuyên đậu) và thực vật (trồng cây hoặc không trồng cây)
- Mẫu đất được thu và xác định dư lượng chlorpyrifos ethyl trong đất vào các thời điểm 1,
10, 20, 30 ngày sau khi bổ sung chlorpyrifos ethyl
3.2.2.2 Đánh giá ảnh hưởng của 3 mô hình canh tác chuyên lúa, 2 lúa - 1 màu và 1 lúa - 2 màu lên sự lưu tồn chlorpyrifos ethyl trong đất phù sa
- Địa điểm thí nghiệm: Thí nghiệm được thực hiện trên đất phù sa của 3 mô hình canh tác chuyên lúa, 2 lúa - 1 màu và 1 lúa - 2 màu tại Long Khánh - Cai Lậy - Tiền Giang
- Thời gian thí nghiệm: Thí nghiệm được thực hiện vào năm 2013 Hai vụ cho mỗi mô hình, ở vụ Đông Xuân (trồng lúa trên cả 3 mô hình) và vụ Hè Thu (trồng đậu trên mô hình 2 lúa - 1 màu và 2 màu - 1 lúa)
- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí khối hoàn toàn ngẫu nhiên, khảo sát 1 nhân tố
là mô hình canh tác, mỗi mô hình canh tác được bố trí lặp lại 4 lần
Thời điểm thu mẫu: mẫu được thu và xác định dư lượng chlorpyrifos ethyl trong đất vào các thời điểm trước phun, sau khi phun 1, 4, 14 và 46 ngày Mẫu đất được thu ở độ sâu 0 - 20
cm bằng khoan có đường kính 3 cm Tại mỗi lô thí nghiệm lấy ngẫu nhiên 5 mẫu trong bán kính 10 m, sau đó các mẫu được trộn đều thành một mẫu đại diện cho một lô thí nghiệm
3.2.2.3 Đánh giá sự lưu tồn chlorpyrifos ethyl trong đất phèn chuyên lúa, chuyên mía
và đất phù sa chuyên lúa, lúa - màu và chuyên màu
- Địa điểm thực hiện thí nghiệm: Phụng Hiệp - Hậu Giang Đánh giá lưu tồn chlorpyrifos ethyl trong đất phèn ở 4 ruộng chuyên trồng mía (cây mía trồng được 5,5 tháng) và 4 ruộng chuyên trồng lúa (lúa sạ được 20 ngày); Bình Tân và Bình Minh - Vĩnh Long: đánh giá lưu tồn
Trang 7chlorpyrifos ethyl trong đất phù sa chuyên lúa, chuyên màu (trồng xà lách xoang) và lúa - màu (khảo sát ở vụ màu trồng khoai lang), 4 ruộng/mô hình
- Phương pháp khảo sát: Các ruộng được chọn một cách ngẫu nhiên, căng dây khoanh vùng trên một diện tích nhất định ở mỗi ruộng (40 m2), riêng đối với ruộng lúa đắp đê trên diện tích đã chọn nhằm giữ lượng nước ít biến động Thuốc Tungcydan 55EC (được sản xuất bởi Công ty Cổ phần sản xuất, thương mại, dịch vụ Ngọc Tùng) chứa 50% chlorpyrifos ethyl (500
g a.i/L) và 5% Cypermethrin được sử dụng trong thí nghiệm này, lượng khuyến cáo sử dụng để trừ sâu trên lúa và màu là 0,5 L/ha, lượng nước phun 400 - 600 L/ha, phun vào thời điểm 21 ngày sau gieo trồng, thời gian cách ly: không phun thuốc trước khi thu hoạch 12 ngày Mẫu đất được thu và xác định dư lượng chlorpyrifos ethyl trong đất vào các thời điểm trước khi phun thuốc, sau khi phun thuốc 1 ngày, 21 ngày và 42 ngày
Trang 83.2.3 Nội dung 3: Đánh giá khả năng phân hủy yếm khí chlorpyrifos ethyl bởi vi khuẩn trong đất phèn và đất phù sa chuyên canh lúa ở Hậu Giang và Tiền Giang
Độ sâu thu mẫu (cm)
Đặc tính đất Chất
hữu cơ (%)
pH Sét
(%)
Thịt (%)
Cát (%) Cai Lậy,
3.2.3.1 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện với 4 mẫu đất ký hiệu PH01, PH02, CL01 và CL02 Mỗi mẫu đất được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên bao gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 3 lần lặp lại, thành phần của mỗi nghiệm thức (NT) được trình bày ở Bảng 3.2
Mỗi mẫu đất được ủ trong lọ thủy tinh loại 50 mL Trước khi cho 10 g đất vào mỗi lọ, chlorpyrifos ethyl được bổ sung bằng cách hòa tan vào acetone và bơm lên 1 g đất khô nghiền mịn, để bay hơi tự nhiên hết acetone trong tủ hút Sau đó bổ sung 30 mL dung dịch yếm khí
Dung dịch yếm khí được pha theo Christoph et al., 2004 Thành phần dung dịch yếm khí bao
gồm các khoáng đa lượng, vi lượng, các vitamin thiết yếu để thúc đẩy hoạt động của vi khuẩn khử -Cl gồm: D-biotin, folic acid, riboflavin, pyrodoxin hydrochloride, vitamin B12, nicotiamide và hỗn hợp các acid hữu cơ đóng vai trò như chất cho điện tử (electron donor) gồm: pyruvic acid (pyruvate), acetic acid (acetate), butyric acid (butyrate), lactic acid (lactate)
và propionic acid (propionate) (250 µM mỗi chất) Các thành phần trên sau khi pha phải sục khí N2 và hút chân không để loại bỏ hoàn toàn O2 Dung dịch khoáng đa lượng (thể tích 1 L) được bổ sung khoáng vi lượng (1 mL), vitamin (0,1 mL) và hỗn hợp acid hữu cơ (4 mL)
Trang 9Bảng 3.2: Thành phần của từng nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát khả năng phân hủy yếm khí chlorpyrifos ethyl của quần xã vi khuẩn
1 (Đối chứng âm)
Sử dụng 10 g đất tiệt trùng, chlorpyrifos ethyl với hàm lượng 35 ppm, 30 mL dung dịch yếm khí
2 (Đối chứng dương
cho quá trình
hô hấp yếm khí)
Sử dụng 10 g đất không tiệt trùng, không bổ sung chlorpyrifos ethyl, 30 mL dung dịch yếm khí, bổ sung vitamin và hỗn hợp acid hữu cơ Mẫu của nghiệm thức này dùng so sánh với mẫu của nghiệm thức 4 để xác định các sản phẩm trung gian trong quá trình phân hủy yếm khí chlorpyrifos ethyl thông qua hô hấp
kỵ khí của quần xã vi khuẩn
3 (Đối chứng dương
cho quá trình
lên men)
Sử dụng 10 g đất không tiệt trùng, không bổ sung chlorpyrifos ethyl, 30 mL dung dịch yếm khí, không bổ sung vitamin và hỗn hợp acid hữu cơ Mẫu của nghiệm thức này dùng so sánh với mẫu của nghiệm thức 5 để xác định các sản phẩm trung gian trong quá trình phân hủy yếm khí chlorpyrifos ethyl thông qua quá trình lên men của quần xã vi khuẩn
4 (hô hấp yếm khí)
Sử dụng 10 g đất không tiệt trùng, bổ sung chlorpyrifos ethyl hàm lượng 35 ppm, 30 mL dung dịch yếm khí, bổ sung vitamin
và hỗn hợp acid hữu cơ Nghiệm thức này nhằm khảo sát khả năng sử dụng gốc -Cl trong chlorpyrifos ethyl làm chất nhận điện tử trong quá trình hô hấp kỵ khí của quần xã vi khuẩn
5 (lên men)
Sử dụng 10 g đất không tiệt trùng, bổ sung chlorpyrifos ethyl hàm lượng 35 ppm, 30 mL dung dịch yếm khí, không bổ sung vitamin và hỗn hợp acid hữu cơ Nghiệm thức này nhằm khảo sát khả năng sử dụng carbon từ chlorpyrifos ethyl trong quá trình lên men yếm khí của quần xã vi khuẩn
Bổ sung thêm chlorpyrifos ethyl: Sau 11 tháng, các lọ ủ được bổ sung thêm chlorpyrifos ethyl để làm giàu mật số vi khuẩn Hàm lượng chlorpyrifos ethyl bổ sung vào đạt 70 ppm, bổ sung cho NT1, NT4 và NT5, không bổ sung chlorpyrifos ethyl cho NT2, NT3 Trước khi thêm chlorpyrifos ethyl cần thêm một lượng dung dịch yếm khí để đưa lọ ủ về thể tích ban đầu (40 mL)
Chỉ tiêu theo dõi: Lấy mẫu ở thời điểm 2 tháng, 4 tháng, 6 tháng, trước bổ sung thêm chlorpyrifos ethyl, bổ sung thêm chlorpyrifos ethyl, 20 ngày và 4 tháng sau khi thêm chlorpyrifos ethyl để xác định hàm lượng chlorpyrifos ethyl còn lại và các sản phẩm trung gian được tạo ra trong quá trình phân hủy yếm khí chlorpyrifos ethyl
Trang 10Cách lấy mẫu dung dịch nuôi yếm khí: Lắc thật đều lọ ủ, dùng bơm tiêm y tế tiệt trùng lấy
từ lọ ủ 1 mL cho vào lọ pi 12 mL Bơm tiêm phải được thổi với khí N2 để đẩy hết O2 trước khi lấy mẫu Trong quá trình lấy mẫu, nên lắc nhẹ lọ ủ để mẫu được đều và chính xác hơn
Phương pháp phân tích hóa học chlorpyrifos ethyl: Quy trình trích mẫu được thực hiện qua
3 lần trích với hỗn hợp toluene: acetone (2:1) Sau khi trích cho mẫu bay hơi tự nhiên trong tủ hút cho đến khi đạt thể tích 1 mL để tiếp tục quy trình lọc Chlorpyrifos ethyl trong dung dịch trích được làm sạch bằng cách lọc qua cột Alumina Sản phẩm trung gian trong quá trình phân hủy yếm khí chlorpyrifos ethyl bằng cách scan trên máy sắc kí khí (GC/MS) Hàm lượng chlorpyrifos ethyl trong dịch trích sau khi làm sạch được xác định trên HPLC (High Performance Liquid Chromatography), sử dụng cột C18 (dài: 25 cm, đường kính trong: 4,6 mm), tỷ lệ pha động Methanol:Nước là 80:20, bước sóng 230 nm, tốc độ dòng 1,00 mL
3.2.3.3 Kiểm tra tính đa dạng của quần xã vi khuẩn khử chlor yếm khí trong dung dịch đất
Các mẫu đất của quần xã vi khuẩn trong đất ký hiệu PH01 vào thời điểm sau 2 tháng ủ được sử dụng để trích DNA, thực hiện PCR-DGGE và sử dụng phần mềm Gel-compare để phân tích sự đa dạng di truyền của quần xã vi khuẩn có khả năng khử chlor yếm khí trong dung dịch đất
DNA của vi khuẩn trong đất được trích bằng cách ly tâm các typ chứa 1,5 dung dịch mẫu, lấy phần đất trích DNA Dùng 0,25 g mẫu đất để trích DNA theo quy trình trích DNA từ đất của hãng PowerSoil(R) Isolation Mẫu sau khi trích dùng để thực hiện PCR - DGGE nhằm xác định sự đa dạng của quần xã vi khuẩn có khả năng khử chlor yếm khí trong dung dịch đất Phản ứng PCR kép bao gồm PCR lần 1 với cặp mồi đặc hiệu 338F/Chl1101R cho nhóm Chloroflexi
nhắm vào gene 16S rRNA để xác định vi khuẩn khử chlor yếm khí (Park et al., 2011; Lane,
1991) Sản phẩm PCR của cặp mồi 338F/Chl1101R được tiếp tục thực hiện PCR với cặp mồi
341F-GC/534R (Muyzer et al., 1993) Sau khi khuếch đại lần thứ hai, sản phẩm PCR này được
dùng để kiểm tra trên gel agarose, phân tích sự đa dạng của quần xã vi khuẩn bằng kỹ thuật điện di biến tính DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) và phần mềm Gel-compare
3.2.4 Nội dung 4: Tuyển chọn, p hân lập vi khuẩn hiếu khí bản địa phân hủy chlorpyrifos ethyl từ đất phèn và đất phù sa chuyên lúa, lúa - màu và chuyên màu
Trang 11lưới Mẫu đất được thu ở độ sâu 0-20 cm, thu 10 điểm phân bố đều trên mỗi ruộng (4 điểm/chậu ở điều kiện nhà lưới) và trộn đều thành 1 mẫu
3.2.5.2 Làm giàu mật số quần xã vi khuẩn và phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy chlorpyrifos ethyl
Môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung chlorpyryfos ethyl hàm lượng 20 ppm được sử
dụng để làm giàu mật số quần xã vi khuẩn có khả năng phân hủy chlorpyrifos ethyl (Zhu et al.,
2010) Mẫu đất được trộn đều, cân 10 g cho vào chai thủy tinh 250 mL có nắp đậy, bổ sung 90
mL dung dịch đệm phosphate, lắc với tốc độ 130 vòng/phút trong 1 giờ, để lắng 15 phút sau đó hút 1 mL dung dịch trên vào bình tam giác 100 mL đã chuẩn bị sẵn môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung chlorpyrifos ethyl hàm lượng 20 ppm với thể tích nuôi là 24 mL Các bình tam giác được lắc liên tục trên máy lắc tròn với tốc độ 90 vòng/phút (tạo khả năng trao đổi oxy tốt cho dung dịch) ở nhiệt độ phòng thí nghiệm và trong tối Đây được xem là thế hệ nuôi cấy đầu tiên Khi môi trường nuôi vi khuẩn trở nên đục theo thời gian, hút 1 mL dung dịch vi khuẩn của thế hệ nuôi cấy đầu tiên cho vào bình tam giác 100 mL đã tiệt trùng chứa môi trường khoáng tối thiểu mới có bổ sung chlorpyrifos ethyl hàm lượng 20 ppm Quá trình cấy chuyển được lặp lại như vậy khoảng 4-5 lần để tăng mật số quần xã vi khuẩn có khả năng phân hủy chlorpyrifos ethyl (đánh giá dựa trên sự gia tăng độ đục của dung dịch sau vài ngày nuôi cấy) Sau khi mật
số quần xã vi khuẩn đã được làm giàu, thí nghiệm được thực hiện nhằm đánh giá khả năng phân hủy chlorpyrifos ethyl của chúng với 2 nghiệm thức:
Nghiệm thức 1: Đối chứng (dung dịch khoáng tối thiểu có bổ sung chlorpyrifos ethyl hàm lượng 20 ppm)
Nghiệm thức 2: Dung dịch khoáng tối thiểu có bổ sung chlorpyrifos ethyl hàm lượng 20 ppm và vi khuẩn (12 quần xã vi khuẩn đã được làm giàu mật số)
Sau 30 ngày nuôi cấy, mẫu của 2 nghiệm thức được trích và phân tích để xác định hàm lượng chlorpyrifos ethyl còn lại Phương pháp trích mẫu và phân tích mẫu được trình bày ở mục 3.2.4.3
Quần xã vi khuẩn có khả năng phân hủy chlorpyrifos ethyl đã xác định, được sử dụng làm nguồn vi khuẩn trong quá trình phân lập dòng vi khuẩn phân hủy chlorpyrifos ethyl Mỗi quần
xã vi khuẩn được pha loãng từ 10-1 - 10-8 Dung dịch huyền phù vi khuẩn đã pha loãng được hút 50 µL nhỏ lên môi trường đặc TSA và dùng que cấy tráng đều đến khi bề mặt môi trường khô Các đĩa petri được ủ 3 - 5 ngày ở nhiệt độ phòng trong điều kiện không có ánh sáng Khuẩn lạc vi khuẩn được phân dạng và cấy ria từng dạng trên mỗi đĩa petri để tạo khuẩn lạc rời rạc Quá trình này được lặp lại 7-8 lần cho đến khi được các khuẩn lạc thuần nhất trên mỗi đĩa Sau đó chuyển mỗi khuẩn lạc vào ống nghiệm chứa 4 mL môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung chlorpyrifos ethyl hàm lượng 20 ppm Thí nghiệm xác định khả năng phân hủy
Trang 12chlorpyrifos ethyl của mỗi dòng vi khuẩn được thực hiện tương tự như thí nghiệm xác định khả năng phân hủy chlorpyrifos ethyl của mỗi quần xã vi khuẩn
3.2.4.3 Phương pháp phân tích chlorpyrifos ethyl trong dung dịch
Chlorpyrifos ethyl trong dung dịch khoáng tối thiểu ở các nghiệm thức được trích 3 lần bằng hỗn hợp dung môi Toluene:Acetone (2:1) Hàm lượng chlorpyrifos ethyl trong các mẫu
bố trí trong dung dịch được đo trên máy HPLC
3.2.4.4 Giải mã trình tự gene 16S rRNA và xác định ở mức độ loài của dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy chlorpyrifos ethyl
DNA của các dòng vi khuẩn phân hủy chlorpyrifos ethyl trong môi trường khoáng tối
thiểu ở mục 3.2.4.3 được trích theo quy trình của Ihrmark et al (2012) Sau đó, sản phẩm trích
DNA được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi 27F/1492R có trình tự như sau: 27F (5'-3’): AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG' và 1492R (5'- 3’): TACGGT TACCTTGTTACGACT Hai đoạn mồi này nhắm vào đoạn gene 16S rRNA của vi khuẩn Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR: giai đoạn sơ khởi 95°C (5 phút), 30 chu kì: 95°C (1 phút)-53°C
(30s)-72°C (90s), 72°C (5 phút) (Justé et al., 2008b) Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel
agarose 1,5% trước khi giải trình tự Các hóa chất để thực hiện phản ứng PCR bao gồm (thể tích/1 phản ứng): 2,5µL buffer (5x); 0,25 µL mồi xuôi 27F (10 µM); 0,25 µL mồi ngược 1492R (10 µM); 2 – 4 µL DNA tinh sạch; 11,75 µL mQ-H2O, 4 µL dNTPs (10mM); 0,5 µL DMSO; 2 µL MgCl2 (25 mM); 0,25 µL taq (5 U/µL) Kết quả giải trình tự được so sánh và dò tìm trên ngân hàng gene NCBI trên trang web http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, kết hợp với đặc tính sinh hóa để xác định mức độ loài của các dòng vi khuẩn khảo sát
3.2.5 Nội dung 5: Đánh giá sự phân hủy hiếu khí chlorpyrifos ethyl bởi dòng vi khuẩn ký hiệu PH_C4.3 trong môi trường khoáng tối thiểu và trong môi trường đất
3.2.5.1 Đánh giá sự phân hủy hiếu khí chlorpyrifos ethyl của dòng vi khuẩn ký hiệu PH_C4.3 trong môi trường khoáng tối thiểu
Với mục tiêu khảo sát hoạt động phân hủy chlorpyrifos ethyl của dòng vi khuẩn ký hiệu PH_C4.3 ở điều kiện nhiệt độ, pH thích hợp nhằm đánh giá tốc độ phân hủy chlorpyrifos ethyl của dòng vi khuẩn này vào 3 thời điểm (10, 20 và 30 ngày sau nuôi cấy) khi có bổ sung và không bổ sung TSB
Thí nghiệm được thực hiện gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 3 lặp lại, thành phần của mỗi nghiệm thức được trình bày cụ thể trong Bảng 3.3
Trang 13Bảng 3.3: Thành phần của từng nghiệm thức khảo sát hoạt động phân hủy chlorpyrifos ethyl của dòng vi khuẩn ký hiệu PH_C4.3
Đối chứng 4 mL dung dịch khoáng tối thiểu, bổ sung
chlorpyrifos ethyl đạt hàm lượng 20 ppm
Hàm lượng chlorpyrifos ethyl và mật số vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy vào các thời điểm 0,
10, 20 và 30 ngày sau khi nuôi
Thí nghiệm được bố trí ở nhiệt độ 300C, pH 7 và lắc liên tục trong tối với tốc độ 130 vòng/phút
3.2.5.2 Đánh giá hoạt động phân hủy chlorpyrifos ethyl của dòng vi khuẩn ký hiệu PH_C4.3 và tổ hợp 4 dòng vi khuẩn ký hiệu PH_C3.1, PH_C4.3, BM_C9.2 và BT_C8.9 trong môi trường đất
Thí nghiệm được thực hiện với mục tiêu đánh giá khả năng phân hủy chlorpyrifos ethyl của dòng vi khuẩn ký hiệu PH_C4.3 và tổ hợp 4 dòng vi khuẩn ký hiệu PH_C3.1, PH_C4.3,
BM_C9.2, BT_C8.9 trong môi trường đất Mẫu đất được sử dụng trong thí nghiệm này được
lấy ở độ sâu từ 0 - 20 cm từ đất phèn chuyên lúa ở Phụng Hiệp, Hậu Giang (mẫu đất sử dụng
để phân lập dòng vi khuẩn PH_C4.3) Đất có sa cấu: Sét 57%; Thịt 42%; Cát 1%; Hàm lượng hữu cơ 4,87% và pH 4,5 Đất sử dụng trong thí nghiệm được phơi khô ở nhiệt độ phòng, nghiền mịn qua rây 0,1 mm để tạo sự đồng nhất cho mẫu đất và xử lí ẩm độ đất đạt khoảng 60% bằng cách thêm dung dịch khoáng tối thiểu đã tiệt trùng
Thí nghiệm được bố trí trong lọ pi thể tích 12 mL với 5 nghiệm thức, khảo sát 2 nhân tố là loại đất (tiệt trùng và không tiệt trùng) và vi khuẩn (dòng đơn và tổ hợp 4 dòng vi khuẩn ký hiệu PH_C3.1, PH_C4.3, BM_C9.2, BT_C8.9), mỗi nghiệm thức có 3 lần lặp lại Thành phần của mỗi nghiệm thức được trình bày cụ thể trong Bảng 3.4
Vi khuẩn trong các nghiệm thức được nuôi ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm 300C và để yên trong tối Sau 30 ngày nuôi ủ, chlorpyrifos ethyl trong các mẫu đất nuôi ủ được trích, làm sạch
và phân tích theo quy trình được thiết lập ở mục 3.2.1 Hàm lượng chlorpyrifos ethyl được xác định trên máy HPLC như ở mục 3.2.4
Trang 14Bảng 3.4: Thành phần các nghiệm thức khảo sát sự phân hủy chlorpyrifos ethyl của dòng vi khuẩn PH_C4.3 và tổ hợp 4 dòng vi khuẩn trong đất
30 ngày ủ
2
3 g đất tiệt trùng, bổ sung chlorpyrifos ethyl đạt hàm lượng 20 ppm, 200 µL dung dịch vi khuẩn ký hiệu PH_C4.3 (OD = 0,7 tương đương mật số 106 tế bào/mL)
5
3 g đất không tiệt trùng, chlorpyrifos ethyl hàm lượng 20 ppm,
50 µL dung dịch của mỗi dòng PH_C3.1, PH_C4.3, BT_C8.9, BM_C9.2 (OD = 0,7 tương đương 106 tế bào/mL)
3.2.7 Phương pháp phân tích và xử lí số liệu
Số liệu được xử lí và vẽ biểu đồ bằng phần mềm Microsoft Excel, phần mềm thống kê Minitab 16 để kiểm định phân phối chuẩn, đồng nhất phương sai, so sánh trung bình và phân tích ANOVA Đồng thời sử dụng phần mềm Gel-compare để so sánh độ tương đồng giữa các quần xã vi khuẩn
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Nội dung 1: Đánh giá dư lượng chlorpyrifos ethyl trong đất phèn chuyên lúa, chuyên mía và đất phù sa chuyên lúa, lúa - màu và chuyên màu ở Đồng bằng sông Cửu Long
Kết quả phân tích mẫu đất cho thấy dư lượng chlorpyrifos ethyl cao nhất trong đất phù
sa tại Bình Tân, trên mô hình lúa - màu ở vụ trồng khoai lang với 291 µg/kg Dư lượng chlorpyrifos ethyl thấp nhất trong đất phù sa tại Bình Tân trên mô hình chuyên canh lúa với
3,51 µg/kg (Hình 4.1)