Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Mục tiêu nghiên cứu: Phát hiện nhanh các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc thông qua xác định các vị trí đột biến liên quan kháng thuốc trên gen katG và rpoB bằng phương pháp giải trình tự và kỹ thuật multiplex real-time PCR.

Nguy n Văn B c ễ ắ

LU N VĂN TH C SĨ KHOA H C Ậ Ạ Ọ

KHOA SINH H CỌ

Nguy n Văn B c ễ ắ

Tôi cũng xin bày t  lòng bi t  n sâu s c t i PGS.TS. Nguy n Thái S n H c ỏ ế ơ ắ ớ ễ ơ ọ  

vi n Quân y cùng t p th  cán b  phòng Công ngh  sinh h c Môi tr ệ ậ ể ộ ệ ọ ườ ng, Vi n Công ệ   ngh  Sinh h c đã nhi t tình giúp đ , truy n đ t kinh nghi m quý báu cho tôi trong ệ ọ ệ ỡ ề ạ ệ  

Cu i cùng, tôi xin dành cho nh ng ng ố ữ ườ i thân trong gia đình và b n bè lòng ạ  

bi t  n sâu s c, nh ng ng ế ơ ắ ữ ườ i thân yêu đã luôn bên tôi, đ ng viên và góp ý cho tôi ộ   trong su t quá trình h c t p và hoàn thành khóa lu n ố ọ ậ ậ

Hà N i, tháng 12 năm 2010 ộ

      H c viên  ọ

       Nguy n Văn B c ễ ắ

: Deoxyribonucleotide Triphosphate: Extensively drug resitant (Khang thuôc m  rông)́ ́ ở ̣: Ethambutol.

: Ba loai thuôc isoniazid, rifampicin, streptomyciṇ ́: B n loai thuôc isoniazid, rifampicin, streptomycin và ethambutolố ̣ ́: Isoniazid

: Isopropyl­thio­β­D­galactoside: Kilo base

: Luria ­ Bertani: Multidrugs resistant (Khang đa thuôc) ́ ́: Paraminosalicylic acid

: Pyrazinamid: Polymerase Chain Reaction: Rifampicin

: Acid Ribonucleic : Rifampin resistance determining region (Vùng quy t đ nh kháng ế ịrifampicin)

: Thermus aquaticus DNA polymerase

: Tô ch c Y tê Thê gi ỉ ứ ́ ́ ớ

X­gal

: Volume (th  tích)ể: 5­bromo­4­chloro­3­indolyl­β­D­galactopyranoside

M C L C Ụ Ụ

K t qu  phát hi n đ t bi nế ả ệ ộ ế

               61   

M  Đ U Ở Ầ

B nh lao và vi khu n lao (ệ ẩ Mycobacterium tuberculosis) đã được bi t rõ tế ừ 

m t th  k  nay. Hi n nay t  l  nhi m lao độ ế ỷ ệ ỷ ệ ễ ượ ước  c tính là 1/3 dân s  th  gi i,ố ế ớ  kho ng 9 tri u ngả ệ ười m c lao m i và h n 3 tri u ngắ ớ ơ ệ ười ch t do lao m i năm. B nhế ỗ ệ  lao đang tr  nên nghiêm tr ng h n v i s  xu t hi n các ch ng lao kháng đa thu cở ọ ơ ớ ự ấ ệ ủ ố  (Multi­Drugs Resistant ­ MDR), t c là th  lao v i vi khu n kháng ít nh t hai lo iứ ể ớ ẩ ấ ạ  thu c ch ng lao m nh nh t là isoniazid (INH) và rifampicin (RMP). Theo s  li uố ố ạ ấ ố ệ  

th ng kê c a chố ủ ương trình ch ng lao Qu c gia năm 2007, th  gi i  có kho ngố ố ế ớ ả  511.000 trường h p nhi m lao kháng đa thu c, trong đó có h n 130.000 trợ ễ ố ơ ường h pợ  

t  vong. Do nh ng khó khăn trong vi c đi u tr  nh ng b nh nhân mang các ch ngử ữ ệ ề ị ữ ệ ủ  lao kháng thu c ph  r ng và đa kháng mà vi c phát hi n s m các ch ng lao khángố ổ ộ ệ ệ ớ ủ  

đa thu c s  tr  nên r t quan tr ng trong đi u tr  b nh lao.ố ẽ ở ấ ọ ề ị ệ

Hi n nay nhi u n i ch n đoán vi khu n lao kháng thu c v n d a vào phệ ề ơ ẩ ẩ ố ẫ ự ươ  ngpháp nuôi c y vi khu n và làm kháng sinh đ  là ch  y u, tuy nhiên, vi c  ng d ngấ ẩ ồ ủ ế ệ ứ ụ  sinh h c phân t  cũng đang t o ra nh ng đ t phá trong phát hi n vi khu n lao khángọ ử ạ ữ ộ ệ ẩ  thu c. C  ch  kháng thu c   vi khu n lao là do trong quá trình ti n hóa, có nhi uố ơ ế ố ở ẩ ế ề  

đ t bi n xu t hi n trong m t s  gen ch c năng, trộ ế ấ ệ ộ ố ứ ước h t là   gen ế ở rpoB và katG. 

Th i gian ch n đoán có th  rút ng n ch  còn vài ngày, v i đ  nh y và đ  đ c hi uờ ẩ ể ắ ỉ ớ ộ ạ ộ ặ ệ  cao, t o đi u ki n cho ki m soát b nh lao d  dàng h n. Các nghiên c u v  sinh h cạ ề ệ ể ệ ễ ơ ứ ề ọ  phân t  trong ch n đoán lao kháng thu c đã ch  ra r ng m i lo i kháng thu c là doử ẩ ố ỉ ằ ỗ ạ ố  

xu t hi n các đ t bi n trên gen tấ ệ ộ ế ương  ng ch u trách nhi m. Chính vì v y vi c xácứ ị ệ ậ ệ  

đ nh các trị ường h p nhi m lao kháng thu c thợ ễ ố ường đi kèm v i nh ng ch n đoánớ ữ ẩ  phát hi n đ t bi n gen đ i v i các ch ng lao phát hi n đệ ộ ế ố ớ ủ ệ ược. Các ch ng vi khu nủ ẩ  lao kháng isoniazid là do có liên quan t i đ t bi n t i codon 315 trên gen ớ ộ ế ạ katG, đ iố  

v i các ch ng kháng rifampicin do xu t hi n các đ t bi n   m t vùng nóng g m 27ớ ủ ấ ệ ộ ế ở ộ ồ  codon n m g n trung tâm c a gen ằ ầ ủ rpoB. 

Xu t phát t  nh ng lý do trên, chúng tôi ti n hành đ  tài: ấ ừ ữ ế ề “Nghiên c u phát ứ  

hi n vi khu n lao kháng đa thu c b ng k  thu t sinh h c phân t ” ệ ẩ ố ằ ỹ ậ ọ ử

V i m c tiêu nghiên c uớ ụ ứ : phát hi n nhanh các ch ng vi khu n lao kháng ệ ủ ẩ   thu c thông qua xác đ nh các v  trí đ t bi n liên quan kháng thu c trên gen katG ố ị ị ộ ế ố  

và rpoB b ng ph ằ ươ ng pháp gi i trình t  và k  thu t multiplex real­time PCR ả ự ỹ ậ

Đ  đ t để ạ ược m c tiêu c a đ  tài, chúng tôi ti n hành m t s  n i dung nghiênụ ủ ề ế ộ ố ộ  

c u nh  sau:ứ ư

1 Xác đ nh trình t  gen ị ự rpoB và katG.

2 Phân tích đ c đi m phân t  c a các ch ng vi khu n lao kháng thu cặ ể ử ủ ủ ẩ ố  phân l p t i Vi t Nam trên c  s  trình t  nucleotide c a hai gen ậ ạ ệ ơ ở ự ủ rpoB và  katG.

3 T i  u hóa thành ph n và chu trình b  kit multiplex real­time PCR phátố ư ầ ộ  

hi n nhanh vi khu n lao kháng thu c.ệ ẩ ố

th i gian này   M  và châu Âu, c  7 ngờ ở ỹ ứ ười thì có 1 người ch t vì lao, do v y, phátế ậ  

hi n c a Robert Koch là m t bệ ủ ộ ước ngo t quan tr ng trong vi c kh ng ch  và lo iặ ọ ệ ố ế ạ  

tr  căn b nh này. Trừ ệ ước đây, lao được xem là m t trong nh ng căn b nh truy nộ ữ ệ ề  nhi m nguy hi m nh t trên th  gi i, l u hành v i t  l  m c b nh khá cao, đ c bi tễ ể ấ ế ớ ư ớ ỷ ệ ắ ệ ặ ệ   các n c thu c châu Phi và khu v c châu Á, trong đó có Vi t Nam

Vi t Nam đ ng th  12 trong 22 nệ ứ ứ ước có s  b nh nhân lao cao trên toàn c u.ố ệ ầ  Trong khu v c Tây Thái Bình Dự ương, Vi t Nam đ ng th  ba sau Trung Qu c vàệ ứ ứ ố  Philippines v  s  b nh nhân lao, cũng nh  s  b nh nhân lao xu t hi n h ng năm.ề ố ệ ư ố ệ ấ ệ ằ  

Hi n nay nguy c  nhi m lao   nệ ơ ễ ở ước ta h ng năm đằ ượ ước  c tính là 1,5% dân s  (ố ở các t nh phía Nam là 2%,   các t nh phía B c là 1%). Trên th c t  ch  s  nguy cỉ ở ỉ ắ ự ế ỉ ố ơ nhi m lao hàng năm có th  cao h n 1,5%, nh  v y, các con s  nêu trên còn có thễ ể ơ ư ậ ố ể 

l n h n. Đi u đó s  tăng thêm s  khó khăn đ i v i công tác phòng ch ng lao khôngớ ơ ề ẽ ự ố ớ ố  

nh ng trong các năm t i mà có th  trong th i gian khá dài, có th  đ n hàng ch cữ ớ ể ờ ể ế ụ  năm, ngay c  khi   thiên niên k  m i [3,ả ở ỷ ớ  35]

1.2. TÌNH HÌNH LAO KHÁNG THU CỐ

B nh lao ngày càng tr  nên ph c t p và có  nh hệ ở ứ ạ ả ưởng n ng n  khi xu t hi nặ ề ấ ệ  thêm vi khu n lao kháng thu c t o nên m t d ng b nh khó phòng ch ng. Các ch ngẩ ố ạ ộ ạ ệ ố ủ  lao   kháng   thu c   đố ược   chia   làm   hai   th ,   đó   là   lao   kháng   đa   thu c   (Multi­drugsể ố  resistant ­ MDR) và lao kháng thu c ph  r ng (Extensively drug resistant ­ XDR),ố ổ ộ  

nh ng ch ng vi khu n lao kháng thu c này là ngu n lây nhi m và là m i đe d a choữ ủ ẩ ố ồ ễ ố ọ  

s c kh e c a c ng đ ng. Theo ứ ỏ ủ ộ ồ ước tính c a T  ch c Y t  th  gi i (WHO), trên thủ ổ ứ ế ế ớ ế 

gi i có kho ng 42 v n ngớ ả ạ ười m c lao kháng đa thu c, chi m s  lắ ố ế ố ượng l n nh t là ớ ấ ở khu v c Tây Thái Bình Dự ương có 15 v n trạ ường h p, k  đ n là khu v c Đông Namợ ế ế ự  

Á và sau đó là khu v c Châu Phi và Đông Âu. M t s  ch ng lao v a kháng đa thu cự ộ ố ủ ừ ố  

v a kháng thu c ph  r ng, có th  coi là lo i siêu kháng thu cừ ố ổ ộ ể ạ ố  [17]. Tình hình lao 

siêu kháng thu c cũng ngày càng tr  nên tr m tr ng, do v y t  tháng 11/2004 đ nố ở ầ ọ ậ ừ ế  11/2005, WHO và Trung tâm Ki m soát B nh Hoa K  đã phân tích 17.890 m u đ mể ệ ỳ ẫ ờ  

g i t  40 qu c gia trên toàn th  gi i, và th y r ng có 20% trử ừ ố ế ớ ấ ằ ường h p là kháng đaợ  thu c và 2% trố ường h p là kháng thu c ph  r ng.   Vi t Nam, theo nghiên c u c aợ ố ổ ộ Ở ệ ứ ủ  

Chương trình Ch ng lao Qu c gia thì có 32,5% các trố ố ường h p b nh lao m i mangợ ệ ớ  

vi khu n lao kháng thu c [1, 3].ẩ ố

Vi khu n lao kháng thu c là m t thách th c l n, đe d a công cu c phòngẩ ố ộ ứ ớ ọ ộ  

ch ng lao trên toàn c u, vì các thu c ch ng lao có hi u qu  hi n nay đang b  viố ầ ố ố ệ ả ệ ị  khu n lao kháng l i nh t là kháng đa thu c [10]. Thu c ch ng lao có nhi u lo i, tácẩ ạ ấ ố ố ố ề ạ  

d ng c a m i thu c trên tr c khu n lao không gi ng nhau. Hi n nay ngụ ủ ỗ ố ự ẩ ố ệ ười ta chia thu c ch ng lao thành hai lo i: (1) các thu c ch ng lao ch  y u (còn g i là cácố ố ạ ố ố ủ ế ọ  

thu c ch ng lao lo i m t, thu c ch ng lao hàng đ u), (2) các thu c ch ng lao thố ố ạ ộ ố ố ầ ố ố ứ 

y u (còn g i là các thu c ch ng lao lo i hai, thu c ch ng lao hàng th  hai). Trongế ọ ố ố ạ ố ố ứ  khi các thu c ch ng lao lo i m t là nh ng thu c có hi u qu  nh t và cũng ít đ cố ố ạ ộ ữ ố ệ ả ấ ộ  tính nh t, thì các thu c ch ng lao hàng th  hai là nh ng thu c có tác d ng kém h nấ ố ố ứ ữ ố ụ ơ  

l i có đ c tính cao và giá thành r t đ t.   New York, chi phí đi u tr  b nh nhânạ ộ ấ ắ Ở ề ị ệ  

nh y v i thu c ch  m t 2.000 USD trong khi đó đi u tr  b nh nhân kháng thu c h tạ ớ ố ỉ ấ ề ị ệ ố ế  250.000 USD. Hi n nay s  t  vong hàng năm do lao trên th  gi i còn l n h n s  tệ ố ử ế ớ ớ ơ ố ử vong do HIV, s t rét và các b nh nhi t đ i c ng l i. T  ch c Y t  Th  gi i đã nh nố ệ ệ ớ ộ ạ ổ ứ ế ế ớ ậ  

đ nh b nh lao hi n nay đã quay tr  l i và tr  nên t i t  h n b i s  kháng thu c c aị ệ ệ ở ạ ở ồ ệ ơ ở ự ố ủ  

vi khu n lao [17].ẩ

Thu c kháng sinh đ u tiên dùng đ  đi u tr  lao là streptomycin, nh ng vài nămố ầ ể ề ị ư  sau khi kháng sinh này đượ ử ục s  d ng thì người ta đã nh n th y hi n tậ ấ ệ ượng đ  khángề  

l i ạ streptomycin c a vi khu n lao. Sau đó các kháng sinh ch ng lao khác ti p t c raủ ẩ ố ế ụ  

đ i: para – aminosalysilic, isoniazid, rifampicin nh ng  đ u không mang l i hi uờ ư ề ạ ệ  

qu  sau m t th i gian đi u tr  nh t đ nh [7]. Nghiên c u tìm ki m hoá dả ộ ờ ề ị ấ ị ứ ế ược m i cóớ  

hi u qu  đi u tr  lao, đ c bi t là lao kháng thu c luôn luôn đệ ả ề ị ặ ệ ố ược th c hi n và càngự ệ  ngày càng có nhi u h p ch t ch ng lao m i đề ợ ấ ố ớ ược đ a vào s  d ng, ví d , g n đâyư ử ụ ụ ầ  

là linezolid [43]. Tuy nhiên, theo c  ch  và áp l c, vi khu n không ng ng bi n đ iơ ế ự ẩ ừ ế ổ  

t o nên nhi u ch ng m i h n có kh  năng kháng thu c nhanh chóng h n [52]. Khạ ề ủ ớ ơ ả ố ơ ả năng đi u tr  thành công có th  đ t 95­100% đ i v i nh ng b nh nhân m c laoề ị ể ạ ố ớ ữ ệ ắ  thông thường, trong khi t  l  thành công v i b nh nhân m c lao kháng thu c ch  làỷ ệ ớ ệ ắ ố ỉ  

20 – 30%, th m chí còn không đi u tr  đậ ề ị ược khi m c lao kháng đa thu c và khángắ ố  thu c ph  r ng m c dù đã dùng k t h p đ n năm lo i kháng sinh đi u tr  lao. Vìố ổ ộ ặ ế ợ ế ạ ề ị  

v y, vi c phát hi n và ngăn ch n s  lan truy n các ch ng lao kháng đa thu c làậ ệ ệ ặ ự ề ủ ố  

v n đ  quan tr ng nh t trong đi u tr  lao hi n nay [7, 10, 35].ấ ề ọ ấ ề ị ệ

1.3. VI KHU N LAOẨ

1.3.1. C u t o ấ ạ

Tr c khu n lao có d ng hình que, thân m nh d , không có nha bào, kíchự ẩ ạ ả ẻ  

thước 2 ­ 3 µm, dày 0,3 µm, kháng c n, kháng acid (hình 1.1). Khi đồ ược nhu m b ngộ ằ  

phương pháp Ziehl ­ Neelsen, tr c khu n lao b t màu đ  th m, do không b  c n vàự ẩ ắ ỏ ẫ ị ồ  acid làm m t màu carbonfuchsin.   môi trấ Ở ường nuôi c y có đ  acid đ m đ c nh tấ ộ ậ ặ ấ  

đ nh, tr c khu n lao v n phát tri n đị ự ẩ ẫ ể ược, vì v y, chúng đậ ược g i là tr c khu nọ ự ẩ  kháng c n, kháng toan (acid fast bacilli ­ AFB), đây là đ c đi m n i b t c a vi khu nồ ặ ể ổ ậ ủ ẩ  thu c chi mycobacteria. Đ c đi m này r t quan tr ng đ  phát hi n tr c khu n laoộ ặ ể ấ ọ ể ệ ự ẩ  

b ng phằ ương pháp hình thái h c (nhu m màu) trong các m u b nh ph m. M t sọ ộ ẫ ệ ẩ ộ ố 

gi  thi t cho r ng m c kháng acid là do đ  dài c a các chu i mycolic acid  ả ế ằ ứ ộ ủ ỗ M.  tuberculosis  có kh  năng th  hi n t t c  các c  ch  c n thi t đ  t ng h p cácả ể ệ ấ ả ơ ế ầ ế ể ổ ợ  vitamin, amino acid và các enzyme cofactor thi t y u c a t  bào. Mycobacteria cóế ế ủ ế  

c u trúc g n gi ng v i vi khu n Gram dấ ầ ố ớ ẩ ương nh ng chúng không đư ược x p vàoế  

lo i vi khu n Gram dạ ẩ ương do các phân t  g n v i thành t  bào là lipid ch  khôngử ắ ớ ế ứ  

ph i protein hay polysaccharide. Do đó, chúng không gi  l i tinh th  màu tím xu tả ữ ạ ể ấ  

hi n trong nhu m Gram [2, 5, 37, 38].ệ ộ

Tr c khu n lao r t hi u khí, phát tri n t t nh t   37ự ẩ ấ ế ể ố ấ ở oC và dưới áp su t c aấ ủ  

O2 là 100 mmHg. Đ nh ph i và vùng ph i dỉ ổ ổ ướ ươi x ng đòn thường hay m c lao nh tắ ấ  

vì có áp su t Oấ 2 t  120 – 130 mmHg (khi đ ng) r i đ n thân xừ ứ ồ ế ương và đ u xầ ương vì 

áp su t Oấ 2   đây là 100 mmHg. Lách, gan, d  dày, th c qu n ít m c lao h n vì ápở ạ ự ả ắ ơ  

su t Oấ 2 th p.ấ

Tr c khu n lao sinh s n r t ch m, c  20 gi  m i có m t l n phân chia tự ẩ ả ấ ậ ứ ờ ớ ộ ầ ế bào, trong đi u ki n phòng thí nghi m thì c  12 đ n 24 gi  ề ệ ệ ứ ế ờ M. tuberculosis phân chia 

tri n ch m có th  là do tính th m th u c a thành t  bào h n ch  trong vi c h p thể ậ ể ẩ ấ ủ ế ạ ế ệ ấ ụ 

ch t dinh dấ ưỡng và liên quan đ n t c đ  t ng h p ribosome (Hình 1.2).ế ố ộ ổ ợ

Tr c khu n lao có c u t o r t ph c t p, hoàn h o mà ít vi sinh v t nào cóự ẩ ấ ạ ấ ứ ạ ả ậ  

được. Dưới kính hi n vi đi n t  tr c khu n lao có c u t o chính nh  sau (hình 1.3):ể ệ ử ự ẩ ấ ạ ư

­ L p trong cùng có c u trúc màng, có thành ph n ch  y u là các phospholipidớ ấ ầ ủ ế  

g m 2 nhóm: nhóm  a nồ ư ước hướng vào bên trong, nhóm k  nỵ ước quay ra ngoài. C uấ  trúc này t o nên màng sinh h c có tác d ng giúp tr c khu n đi u hòa s  th m th uạ ọ ụ ự ẩ ề ự ẩ ấ  

c a v  ngoài tr c khu n, màng còn ch a các protein ch c năng khác nh  các proteinủ ỏ ự ẩ ứ ứ ư  truy n tín hi u đ n b  máy trao đ i ch t và di truy n trong nguyên sinh ch t, cácề ệ ế ộ ổ ấ ề ấ  enzyme liên quan đ n quá trình trao đ i ch t và sinh năng lế ổ ấ ượng, các ch t mang làmấ  trung gian cho quá trình v n chuy n các ch t dinh dậ ể ấ ưỡng và các ion. Các enzyme xuyên màng và t ng h p màng, t o thành vách ngăn trong phân chia t  bào, t p h pổ ợ ạ ế ậ ợ  

và ti t m t s  enzyme ngo i bào, sao chép DNA [2, 4, 37, 38].ế ộ ố ạ

­ L p ti p theo là peptidoglucan liên k t v i đớ ế ế ớ ường arabinose và các phân tử mycolic acid t o nên m t b  khung đ nh hình cho vi khu n đ m b o cho vi khu n cóạ ộ ộ ị ẩ ả ả ẩ  

(http://abcnews.go.com/Health/Germs/story?id=3079114&page=1)

đ  c ng nh t đ nh. Thành t  bào c a ộ ứ ấ ị ế ủ mycobacteria là c u trúc ph c t p nh t đấ ứ ạ ấ ượ  c

bi t   prokaryote, có m t s  thành ph n hóa h c và liên k t chéo b t thế ở ộ ố ầ ọ ế ấ ường, m cứ  

đ  liên k t gi a peptidoglucan   thành t  bào ộ ế ữ ở ế M. tuberculosis là 70 ­ 80% trong khi ở 

vi khu n ẩ E. coli là 20 ­ 30% [38]

­ L p ngoài đớ ượ ạc t o nên b i s  liên k t gi a các mycolic acid và các ch tở ự ế ữ ấ  

ph c t p, đây là l p t o nên đ c tính c a vi khu n lao và có c u trúc ph c t pứ ạ ớ ạ ộ ủ ẩ ấ ứ ạ  làm tăng kh  năng ch ng th m nả ố ấ ước c a thành t  bào vi khu n giúp tr c khu nủ ế ẩ ự ẩ  

t n t i lâu v i môi trồ ạ ớ ường bên ngoài, ch ng kh  năng b  h y di t b i đ i th cố ả ị ủ ệ ở ạ ự  bào và các t  bào mi n d ch [38]. ế ễ ị

­ L p v  ngoài cùng có vai trò r t quan tr ng, có c u trúc peptidoglyolipid.ớ ỏ ấ ọ ấ  

Nó đ m b o cho s  t n t i c a tr c khu n, làm cho tr c khu n b n v ng v iả ả ự ồ ạ ủ ự ẩ ự ẩ ề ữ ớ  

hi n tệ ượng th c bào, giúp b o v  kh i áp su t th m th u nên khi vào c  th  tr cự ả ệ ỏ ấ ẩ ấ ơ ể ự  khu n khó bi tiêu di t.ẩ ệ

Hình 1.3. C u t o thành t  bào c a ấ ạ ế ủ M. tuberculosis 

(http://www3.niaid.nih.gov/topics/tuberculosis/Research/basicResearch/biology cell.htm)1.3.2. C  ch  gây b nhơ ế ệ

Vi khu n lao có th  xâm nh p vào c  th  qua nhi u con đẩ ể ậ ơ ể ề ường khác nhau: 

thường là đường hô h p, ho c có th  qua đấ ặ ể ường tiêu hóa, da, k t m c m t. Sau khiế ạ ắ  gây t n thổ ương tiên phát, vi khu n lao có th  theo đẩ ể ường b ch huy t ho c đạ ế ặ ườ  ngmáu đ  đ n gây t n thể ế ổ ương th  phát   các c  quan khác: Ph i, th n, màng não,ứ ở ơ ổ ậ  

xương, h ch nh ng thạ ư ường b  h n c  là đ nh ph i, n i có áp su t oxy là 120 mmHgị ơ ả ỉ ổ ơ ấ  

vì đây là đi u ki n ho t đ ng t t cho vi khu n lao. Đ c l c c a vi khu n lao có liênề ệ ạ ộ ố ẩ ộ ự ủ ẩ  quan đ n “ế Cord factor” (trehalose ­ 6,6’­ dimycolate) là ch t gây  c ch  ho t đ ngấ ứ ế ạ ộ  

c a t  bào b ch c u, gây nên nh ng u h t m n tính [7].ủ ế ạ ầ ữ ạ ạ

Khi vi khu n lao xâm nh p vào c  th , trong c  th  xu t hi n đáp  ng mi nẩ ậ ơ ể ơ ể ấ ệ ứ ễ  

d ch qua trung gian t  bào. Lúc này, đ i th c bào, các t  bào lympho T, lympho B vàị ế ạ ự ế  các nguyên bào s i k t t p l i t o các u h t, v i các t  bào lympho vây quanh đ iợ ế ậ ạ ạ ạ ớ ế ạ  

th c bào. Ch c năng c a các u h t không ch  ngăn c n s  lan t a c a t  bàoự ứ ủ ạ ỉ ả ự ỏ ủ ế   M.  tuberculosis mà còn t o môi trạ ường t i ch  cho các t  bào c a h  mi n d ch trao đ iạ ỗ ế ủ ệ ễ ị ổ  thông tin [23]. Bên trong các u h t, t  bào lympho T ti t ra các cytokine, nh  γạ ế ế ư  interferon, ho t hóa đ i th c bào khi n chúng di t khu n t t h n. T  bào lympho Tạ ạ ự ế ệ ẩ ố ơ ế  cũng tiêu di t tr c ti p các t  bào b  nhi m. Nh ng đi u quan tr ng là vi khu nệ ự ế ế ị ễ ư ề ọ ẩ  không b  u h t lo i tr  hoàn toàn mà tr  nên b t ho t t o d ng nhi m khu n “ti mị ạ ạ ừ ở ấ ạ ạ ạ ễ ẩ ề  n” (latent tuberculosis) [18]

ẩ

1.3.3. Đ c đi m h  genặ ể ệ

Toàn b  h  gen c a vi khu n lao ộ ệ ủ ẩ M. tuberculosis ch ng ủ H37Rv được gi iả  trình t , phân tích và công b  năm 1998 g mự ố ồ  4.411.529 bp, v i đ c tính là ch aớ ặ ứ  nhi u guanine và cystosine (G + C kho ng 65 %). Trên 90% trình t  đề ả ự ược d  đoánự  

là có mã hóa cho protein và ch  có 6 gen gi  (pseudogene ­ gen không mang thông tinỉ ả  

di truy n mã hóa cho protein) [28, 38, 44]. D  li u h  gen c a m t s  vi khu nề ữ ệ ệ ủ ộ ố ẩ  thu c chi  ộ Mycobacterium, trước h t là c a vi khu n lao (ế ủ ẩ M.  tuberculosis) và vi 

khu n phong (ẩ M. leprae) có t m quan tr ng đ c bi t trong nghiên c u đ c đi mầ ọ ặ ệ ứ ặ ể  sinh h c phân t  h  tr  d ch t  h c, di truy n h c và nghiên c u kháng thu c, sọ ử ỗ ợ ị ễ ọ ề ọ ứ ố ố 

li u đã đệ ượ ưc l u gi  t i m t s  trung tâm và có th  s  d ng m t s  chữ ạ ộ ố ể ử ụ ộ ố ương trình 

đ  truy c p khám phá và s  d ng [11, ể ậ ử ụ 53]

1.4. C  CH  KHÁNG THU C   VI KHU N LAOƠ Ế Ố Ở Ẩ

1.4.1. Kháng sinh trong đi u tr  lao ề ị

Thu c ch ng lao có nhi u lo i, và tác d ng c a chúng lên tr c khu n laoố ố ề ạ ụ ủ ự ẩ  cũng không gi ng nhau. Hi n nay ngố ệ ười ta chia thu c ch ng lao làm hai lo i: (1) Cácố ố ạ  thu c ch ng lao ch  y u: g m năm thu c ch  y u đó là: isoniazid (INH), rifampicinố ố ủ ế ồ ố ủ ế  (RMP), ethambutol (EMB), pyrazinamid (PZA), streptomycin (SM). Đây là nh ngữ  thu c kháng lao hi u qu  và cũng ít đ c tính nh t. (2) Các thu c ch ng lao th  y u:ố ệ ả ộ ấ ố ố ứ ế  

là nh ng thu c ch ng lao có tác d ng kém h n và có đ c tính cao, không đữ ố ố ụ ơ ộ ược dùng trong phác đ  đi u tr  lao nh ng l i đồ ề ị ư ạ ược dùng trong các trường h p đi u tr  th tợ ề ị ấ  

b i do vi khu n lao kháng l i các lo i thu c ch ng lao lo i m t. Các thu c này g mạ ẩ ạ ạ ố ố ạ ộ ố ồ  có:   ethionamide,   prothionamide,   paraminosalysilic   acid   (PAS),   cycloserine, kanamycin, capreomycin, thiacetazone, ofloxacin, các quinolone…

Các thu c isoniazid, cycloserine, kanamycin có tác d ng  c ch  t ng vách tố ụ ứ ế ổ ế bào. Các thu c streptomycin, kanamycin, capreomycin có tác d ng  c ch  t ng h pố ụ ứ ế ổ ợ  protein. Các thu c rifampicin và ethambutol có tác d ng  c ch  s  t ng h p nucleicố ụ ứ ế ự ổ ợ  acid. Thu c paraminosalicylic acid có tác d ng ch ng chuy n hóa [7, ố ụ ố ể 35, 37, 38].1.4.2. Nguyên nhân gây kháng thu cố

Vi khu n lao kháng thu c là khi chúng không ch u s  tác đ ng c a các lo iẩ ố ị ự ộ ủ ạ  kháng sinh dùng đi u tr  chúng. Thề ị ường nói t i vi khu n lao kháng thu c là nói t iớ ẩ ố ớ  

nh ng trữ ường h p vi khu n lao kháng v i m t trong nh ng thu c ch ng lao dòng thợ ẩ ớ ộ ữ ố ố ứ 

nh t: isoniazid, rifampicin, pyrazinamide, ethambutol ho c streptomycin [7, 35]ấ ặ

Tính kháng thu c bao g m ch  y u 3 nguyên nhân chính:ố ồ ủ ế

­ Thu c ho c các gen đích b  làm bi n đ i trong các ch ng kháng thu c do đóố ặ ị ế ổ ủ ố  các thu c không còn tác d ng n a trong vi c tiêu di t vi khu n.ố ụ ữ ệ ệ ẩ

­ S n ph m c a gen, mà ho t tính c a nó b   c ch  b i thu c đả ẩ ủ ạ ủ ị ứ ế ở ố ược vi khu n s n xu t th a ra, do đó lẩ ả ấ ừ ượng thu c mà b nh nhân u ng vào khôngố ệ ố  

đ  đ   c ch  hoàn toàn vi khu n lao.ủ ể ứ ế ẩ

­ Nh ng thay đ i x y ra   m c đ  phân t  và c  ch  xâm nh p c a thu cữ ổ ả ở ứ ộ ử ơ ế ậ ủ ố  vào bên trong t  bào vi khu n làm cho n ng đ  thu c bên trong t  bàoế ẩ ồ ộ ố ế  không đ t t i n ng đ  t i thi u có kh  năng gi t ch t vi khu n gây b nh.ạ ớ ồ ộ ố ể ả ế ế ẩ ệ

Hi n tệ ượng kháng thu c c a vi khu n lao có th  x y ra trố ủ ẩ ể ả ước khi xâm nh pậ  (tiên phát) ho c sau khi nh p vào c  th  ngặ ậ ơ ể ườ ệi b nh (th  phát). Vi khu n lao khángứ ẩ  thu c tiên phát là hi n tố ệ ượng lây nhi m b i m t ch ng đã kháng thu c mà vi khu nễ ở ộ ủ ố ẩ  này đã có s  đ  kháng t  nhiên. Vì v y, b nh nhân m c lao do s  lây nhi m này, ngayự ề ự ậ ệ ắ ự ễ  

t  đ u vi khu n lao xâm nh p vào c  th  đã có s  đ  kháng v i thu c đang s  d ng.ừ ầ ẩ ậ ơ ể ự ề ớ ố ử ụ  Còn hi n tệ ượng kháng thu c th  phát x y ra đ i v i các ch ng vi khu n lao   b nhố ứ ả ố ớ ủ ẩ ở ệ  nhân nào đó dùng thu c ch ng lao không đúng quy đ nh, không đúng li u lố ố ị ề ượng, th iờ  gian s  d ng thu c do đó đã ch n l c vi khu n lao khang thu c [1, 38].ử ụ ố ọ ọ ẩ ố

Các ch ng vi lao kháng thu c đủ ố ược chia làm hai lo i: (1) Các ch ng lao khángạ ủ  

đa thu c (MDR – TB): Là trố ường h p khi các ch ng vi khu n lao kháng đ ng th iợ ủ ẩ ồ ờ  hai thu c ch ng lao m nh nh t hi n nay là isoniazid và rifampicin. (2) Các ch ng laoố ố ạ ấ ệ ủ  kháng thu c ph  r ng (XDR – TB): Là trố ổ ộ ường h p khi vi khu n lao đã   tình tr ngợ ẩ ở ạ  

kháng   đa   thu c   và   có   thêm   tính   kháng   m t   trong   ba   lo i   thu c   ch ng   lao   làố ộ ạ ố ố  capreomycin, kanamycin, amikacin [49].

Ngày nay khi nghiên c u v  sinh h c phân t , ngứ ề ọ ử ười ta đã xác đ nh đị ược cơ 

ch  kháng l i nhi u lo i kháng sinh có liên quan đ n các gen tế ạ ề ạ ế ương  ng. Trong hìnhứ  1.4 mô t  các c  ch  phân t  c a hi n tả ơ ế ử ủ ệ ượng kháng đa thu c   vi khu n lao. Trongố ở ẩ  

đó, kháng isoniazid được cho là liên quan đ n các gen: ế KatG, inhA, aphC và kasA. 

Kháng streptomycin có th  là do đ t bi n   gen ể ộ ế ở rpsL. Kháng pyrazinamid có th  liênể  quan đ n gen ế pncA. Kháng quinolone có th  liên quan t i gen ể ớ gyrA. Kháng rifampicin 

được xác đ nh là liên quan đ n đ t bi n   vùng g n lõi c a gen ị ế ộ ế ở ầ ủ rpoB, gen mã hóa 

ti u ph n   c a RNA polymerase [7, 25]. Trong lu n văn này, chúng tôi t p trungể ầ β ủ ậ ậ  nghiên c u c  ch  kháng đa thu c, t c là trứ ơ ế ố ứ ường h p vi khu n lao kháng đ ng th iợ ẩ ồ ờ  hai thu c ch ng lao m nh nh t hi n nay là isoniazid và rifampicin, đi u đó đ ngố ố ạ ấ ệ ề ồ  nghĩa v i vi c nghiên c u các đ t bi n trên gen ớ ệ ứ ộ ế rpoB v i  ớ katG.

Hình 1.4. C  ch  kháng đa thu c c a vi khu n laoơ ế ố ủ ẩ  (http://www3.niaid.nih.gov/topics/tuberculosis).

1.4.3. Rifampicin và c  ch  khángơ ế

Rifampicin tên khoa h c là 3 –[[(4 – methyl – 1 – pipeainyl) imino] methyl]ọ  (hình 1.5A). Rifampicin là d n xu t bán t ng h p t  rifampicin B, m t kháng sinhẫ ấ ổ ợ ừ ộ  

được chi t xu t t  n m ế ấ ừ ấ Streptomyces mediterranei, là thu c có ho t tính di t khu nố ạ ệ ẩ  

m nh, ti t khu n, thu c di t vi khu n lao trong và ngoài t  bào. Rifampicin khôngạ ệ ẩ ố ệ ẩ ế  

có hi n tệ ượng kháng thu c chéo v i các lo i thu c ch a lao khác. N ng đ   c chố ớ ạ ố ữ ồ ộ ứ ế 

t i thi u (minimum inhibitory concentration ­ MIC) đ i v i vi khu n là 5 ­ 200 ng/mlố ể ố ớ ẩ  

(in vitro). Đây là thu c  c ch  RNA polymerase m nh nh t [29, 48].ố ứ ế ạ ấ

Hình 1.5. Công th c c u t o c a rifampicin (A) và isoniazid (B) ứ ấ ạ ủ [48]

C  ch  tác đ ng c a rifampicin  liên quan đ n kh  năng  c ch  ho tơ ế ộ ủ ế ả ứ ế ạ  

v i vi khu n lao (hình 1.6).ớ ẩ

Hình 1.6.  C u trúc tinh th  liên k t gi a rifampicin và RNA polymerase ấ ể ế ữ [20]

Gen  rpoB  có   kích   thước   3519   bp,   mã   hóa   cho   ti u   ph n     c a   RNAể ầ β ủ  polymerase   (Tuberculosis,   2007)   Nh ng   đ t   bi n   kháng   kháng   sinh   rifampicinữ ộ ế  

thường x y ra trên đo n gen ả ạ rpoB, nh t là đo n n m g n trung tâm c a gen dài 81ấ ạ ằ ầ ủ  

bp được gi i h n t  b  ba 507 đ n 533, ngớ ạ ừ ộ ế ười ta g i đây là vùng “nóng” – “hot­spotọ  region” (hình 1.7). Đ t bi n   b  ba th  526, 516, 531, cho k t qu  đ  kháng v iộ ế ở ộ ứ ế ả ề ớ  rifampicin cao; đ t bi n   b  ba 510, 515 và 512 thì cho kh  năng kháng rifampicin ộ ế ở ộ ả ở 

m c đ  th p h n [47]. Đo n nucleotide c a vùng nóng g m: ứ ộ ấ ơ ạ ủ ồ

507­GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGC TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG CGC CTG­533

M i nucleotide trên đo n này có th  b  thay th , hoán đ i v  trí, m t đi, thêmỗ ạ ể ị ế ổ ị ấ  vào đ  t o ra các đ t bi n để ạ ộ ế ược th  hi n trên hình 1.7 nh  sau: [41].ể ệ ư

Hình 1.7.  Trình t  nucleotide và các v  trí có kh  năng x y ra đ t bi n trên đo nự ị ả ả ộ ế ạ  

“nóng” c a gen ủ rpoB [41]

­ Khi x y ra đ t bi n g n vùng lõi c a gen ả ộ ế ầ ủ rpoB s  làm thay đ i c u trúc ti uẽ ổ ấ ể  

ph n   c a RNA polymerase mà nó mã hóa nên làm cho kh  năng k t h p c a RMPầ β ủ ả ế ợ ủ  

v i ti u ph n này gi m đi. K t qu  là tác d ng c a rifampicin đ i v i vi khu n laoớ ể ầ ả ế ả ụ ủ ố ớ ẩ  

gi m ho c m t đi. Nh  v y đ t bi n trên vùng gen này c a  ả ặ ấ ư ậ ộ ế ủ rpoB  đã làm cho vi 

khu n lao tr  nên kháng thu c v i rifampicin.ẩ ở ố ớ

­ 90 ­ 95 % các ch ng ủ M. tuberculosis kháng rifampicin đ c xác đ nh là do cácượ ị  

đ t bi n trên vùng gen nóng 81 bp này c a ộ ế ủ rpoB. Nh  v y còn 5 ­ 10 % các ch ng viư ậ ủ  khu n lao không có đ t bi n trên vùng này c a genẩ ộ ế ủ  rpoB. Đi u này cho th y c n ph iề ấ ầ ả  xác đ nh thêm nh ng đ t bi n khác trên gen này ho c nh ng gen khác có liên quan đị ữ ộ ế ặ ữ ể xác đ nh chính xác và toàn b  c  ch  kháng rifampicin c a vi khu n lao [19, 37].ị ộ ơ ế ủ ẩ

1.4.4. Isoniazid và c  ch  khángơ ế

Isoniazid có tên khoa h c là ọ isonicotinylhydrazine (INH) (hình 1.5B), là thu cố  

ch ng   lao   đ c   hi u   cao,   có   tác   d ng   ch ng   l i  ố ặ ệ ụ ố ạ M   tuberculosis  và   các   lo iạ  

Mycobacterium không đi n hình khác nh  ể ư M. bovis, M. kansasii. Isoniazid di t khu nệ ẩ  

ph  thu c vào n ng đ  thu c   v  trí t n thụ ộ ồ ộ ố ở ị ổ ương và m c đ  nh y c m c a viứ ộ ạ ả ủ  khu n. C  ch  tác d ng c a isoniazid có liên quan t i s  hình thành ph c h  acylẩ ơ ế ụ ủ ớ ự ứ ệ  isonicotinic­NADH  và  nh   đã  trình   bày   trên  chúng   c ch  ư ở ứ ế s  t ng  h p   acidự ổ ợ  mycolic c n cho thành t  bào vi khu n lao.ầ ế ẩ

Gen  katG  có kích thước 2223 bp mã hóa catalase – peroxidase. Enzyme này 

ho t hóa INH b ng cách k t h p acyl isonicotinic v i NADH đ  t o thành ph c hạ ằ ế ợ ớ ể ạ ứ ệ acyl isonicotinic­NADH. Ph c h  này liên k t ch t ch  v i ketoenoylreductase (mãứ ệ ế ặ ẽ ớ  hóa b i gen ở InhA), theo đó làm ngăn c n s  hình thành c  ch t ả ự ơ ấ enoyl­AcpM và ho tạ  

đ ng t ng h p acid béo. Quá trình này làm  c ch  s  t ng h p acid mycolic c n choộ ổ ợ ứ ế ự ổ ợ ầ  thành t  bào vi khu n lao. ế ẩ

Hình 1.8. C  ch  kháng INH   vi khu n laoơ ế ở ẩ

(http://www.rcsb.org/pdb/explore/images.do?structureId=2CCA)

C  ch  phân t  c a tính kháng INH ch  y u có liên quan t i đ t bi n thêmơ ế ử ủ ủ ế ớ ộ ế  

đo n/m t đo n ho c các đ t bi n nh m nghĩa/vô nghĩa, trong đó ch  y u di n raạ ấ ạ ặ ộ ế ầ ủ ế ễ  

t i codon 315 (Ser ạ à Thr) c a gen ủ katG mã hóa catalase peroxidase [26]. N u có sế ự 

bi n d ng hay đ t bi n   base th  2 t i codon 315 c a gen  ế ạ ộ ế ở ứ ạ ủ katG (AGC bi n đ iế ổ  thành ACC hay ACA) s  d n đ n làm gi m ho c m t hoàn toàn ho t tính c aẽ ẫ ế ả ặ ấ ạ ủ  

catalase peroxidase, do đó M. tuberculosis s  tr  thành kháng thu c INH (hình 1.8)ẽ ở ố  [14]. Do đó phát hi n s  thay đ i di truy n này trong gen ệ ự ổ ề katG có th  cung c p m tể ấ ộ  

phương   pháp   sàng   l c   nhanh   và   chính   xác   cho   vi c   phát   hi n   các   ch ng  ọ ệ ệ ủ M.  tuberculosis kháng isoniazid.

1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP CH N ĐOÁN LAO KHÁNG THU C Ẩ Ố

1.5.1. Đ c đi m lâm sàng và các xét nghi m c n lâm sàngặ ể ệ ậ

*) Đ c đi m lâm sàng ặ ể

Nhìn chung các d u hi u lâm sàng c a b nh lao có vi khu n kháng thu cấ ệ ủ ệ ẩ ố  không khác nhi u v i b nh lao mà vi khu n nh y c m v i thu c.ề ớ ệ ẩ ạ ả ớ ố

Trường h p nhi m vi khu n lao kháng thu c tiên phát có th  có tri u ch ngợ ễ ẩ ố ể ệ ứ  

c p tính h n, s t cao h n.ấ ơ ố ơ

Đ i v i kháng thu c m c ph i ph n l n g p   nh ng b nh nhân lao m nố ớ ố ắ ả ầ ớ ặ ở ữ ệ ạ  tính, được đi u tr  ít nh t 2 l n. Nh ng b nh nhân này cũng chi m t  l  ch  y uề ị ấ ầ ữ ệ ế ỷ ệ ủ ế  trong s  b nh nhân lao kháng đa thu c. H u h t b nh lao kháng đa thu c b nh ti nố ệ ố ầ ế ệ ố ệ ế  tri n, hay g p dò ph  qu n – màng ph i mà đi u tr  g p nhi u khó khăn [7].ể ặ ế ả ổ ề ị ặ ề

*) Xét nghi m lâm sàng ệ

­ Ph n  ng Tuberculin ả ứ : thường thì ph n  ng da   nh ng b nh nhân kháng thu c tiênả ứ ở ữ ệ ố  phát có m c đ  m nh h n so v i nh ng b nh nhân có vi khu n nh y c m v iứ ộ ạ ơ ớ ữ ệ ẩ ạ ả ớ  thu c. Đ i v i kháng thu c m c ph i, đ c bi t là kháng đa thu c   b nh nhân đ ngố ố ớ ố ắ ả ặ ệ ố ở ệ ồ  nhi m HIV (+) thì t  l  ph n  ng này âm tính khá cao.ễ ỷ ệ ả ứ

­ Hình  nh X Quang: khi ch p ph i th ng, k t qu  cho th y hình  nh v  b nhả ụ ổ ẳ ế ả ấ ả ề ệ  lao ph i gi a trổ ữ ường h p lao kháng thu c tiên phát v i trợ ố ớ ường h p nh y c mợ ạ ả  

v i thu c không có s  khác bi t. Nh ng nh ng trớ ố ự ệ ư ữ ường h p kháng thu c m cợ ố ắ  

ph i thì g p nhi u là th  x  hang, di n tích ph i t n thả ặ ề ể ơ ệ ổ ổ ương nhi u h n và cóề ơ  nhi u hang, kích thề ước c a hang l n h n.ủ ớ ơ

­ Xét nghi m vi khu n ệ ẩ : 

+ V  hình th : các vi khu n bình thề ể ẩ ường có c u t o thành t  bào 3 l p nh ngấ ạ ế ớ ư  

 vi khu n kháng thu c thành t  bào có c u t p 4 l p (vi khu n có thêm

+ V  s  lề ố ượng vi khu n khi soi kính và nuôi c y: nh ng b nh nhân khángẩ ấ ữ ệ  thu c th  phát có s  lố ứ ố ượng vi khu n khi soi kính cao h n nhi u so v iẩ ơ ề ớ  

b nh nhân thông thệ ường. Không có s  khác nhau nhi u gi a b nh nhânự ề ữ ệ  kháng thu c tiên phát và b nh nhân thông thố ệ ường. Khi nuôi c y trên môiấ  

trường đ c s  khu n l c m c   b nh nhân kháng thu c m c ph i là caoặ ố ẩ ạ ọ ở ệ ố ắ ả  

h n và th i gian m c nhanh h n so v i kháng thu c tiên phát và   nh ngơ ờ ọ ơ ớ ố ở ữ  

b nh nhân này s  khu n l c l i cao h n   b nh nhân thông thệ ố ẩ ạ ạ ơ ở ệ ường [7].+ V  đ c đi m kháng sinh đ : kháng thu c tiên phát thề ặ ể ồ ố ường kháng hay kháng 

v i n ng đ  th p, kháng thu c m c ph i thớ ồ ộ ấ ố ắ ả ường kháng v i n ng đ  caoớ ồ ộ  

h n. Kháng thu c tiên phát hay g p v i m t thu c, kháng thu c th  phátơ ố ặ ớ ộ ố ố ứ  

thường t  l  kháng cùng lúc v i nhi u thu c cao h n [7].ỷ ệ ớ ề ố ơ

Nh  v y không th  d a vào lâm sàng hay th i gian đi u tr  hi u qu  đ  ch nư ậ ể ự ờ ề ị ệ ả ể ẩ  đoán b nh nhân lao kháng thu c đệ ố ược. Các xét nghi m c n lâm sàng khác ch  có giáệ ậ ỉ  

tr  g i ý. Ch n đoán b nh lao kháng thu c hi n nay v n ph i l y k t qu  kháng sinhị ợ ẩ ệ ố ệ ẫ ả ấ ế ả  

đ  làm tiêu chu n.ồ ẩ

1.5.2. Xác đ nh ki u hìnhị ể  

G m các phồ ương pháp sau: Phương pháp xác đ nh tị ương quan, phương pháp xác đ nh t  l  kháng, phị ỷ ệ ương pháp đo màu, phương pháp kh  nitrate và nhi uử ề  

phương pháp khác [13]. Các phương pháp này đ u xác đ nh kh  năng phát tri n c aề ị ả ể ủ  

vi khu n lao trong môi trẩ ường nuôi c y có kháng sinh, t  đó đ a ra k t lu n v  khấ ừ ư ế ậ ề ả năng kháng thu c c a ch ng vi khu n lao đang nghiên c u [12]. Nhố ủ ủ ẩ ứ ược đi m c aể ủ  các phương pháp này là vi khu n lao m c ch m, trên môi trẩ ọ ậ ường Lowenstein­Jensen 

thường m t 4­6 tu n. S  d ng h  th ng môi trấ ầ ử ụ ệ ố ường l ng đỏ ượ ả ếc c i ti n nh  MGIT,ư  BATEC cũng m t 2 tu n. Đi u này làm cho công tác đi u tr  và ki m soát tình hìnhấ ầ ề ề ị ể  

b nh lao cũng nh  b nh lao kháng thu c còn khó khăn.ệ ư ệ ố

1.5.3. Xác đ nh ki u genị ể

Hi n nay có nhi u phệ ề ương pháp xác đ nh ki u gen đị ể ượ ức  ng d ng đ  ch nụ ể ẩ  đoán vi khu n lao kháng thu c [1, 4], gi i trình t  gen [6]ẩ ố ả ự , lai trên pha r n [36], Realắ  – time PCR [14]

Các phương pháp ch n đoán xác đ nh ki u gen d a trên c  s  phát hi n đ tẩ ị ể ự ơ ở ệ ộ  

bi n   các gen có liên quan t i tính kháng thu c tế ở ớ ố ương  ng [51], s  d ng các kứ ử ụ ỹ thu t cao, đòi h i thi t b  hi n đ i, t n kém và c n nhân l c có trình đ  chuyên sâuậ ỏ ế ị ệ ạ ố ầ ự ộ  

nh ng th i gian ch n đoán b ng phư ờ ẩ ằ ương pháp này nhanh h n, có đ  nh y và đ  đ cơ ộ ạ ộ ặ  

hi u cao.ệ

Đ  xác đ nh đ t bi n trên gen có liên quan t i kháng thu c (gen ể ị ộ ế ớ ố rpoB và katG) 

hi n nay gi i trình t  gen v n là phệ ả ự ẫ ương pháp xác đ nh c  b n, chính xác nh t vàị ơ ả ấ  

th i gian cho k t qu  t  3 ­ 5 ngày. Sau khi gi i trình t  đo n gen v a đờ ế ả ừ ả ự ạ ừ ược tách dòng t  ch ng lao nghiên c u ta s  so sánh tr t t  s p x p các nucleotide   m u thíừ ủ ứ ẽ ậ ự ắ ế ở ẫ  nghi m v i tr t t  nucleotide chu n đ  bi t đệ ớ ậ ự ẩ ể ế ược các v  trí sai l ch [22, 16]. ị ệ

Vi c xác đ nh các đ t bi n có liên quan kháng thu c rifampicin và isoniazidệ ị ộ ế ố  

b ng k  thu t gi i trình t  cho bi t chính xác v  trí đ t bi n cũ và m i trên gen c nằ ỹ ậ ả ự ế ị ộ ế ớ ầ  nghiên c u, mang l i hi u bi t sâu s c v  s  đa d ng c a c u trúc qu n th  viứ ạ ể ế ắ ề ự ạ ủ ấ ầ ể  khu n lao   b nh nhân lao kháng thu c, đánh giá đẩ ở ệ ố ượ ỷ ệ ộc t  l  đ t bi n liên quanế  kháng thu c trên các ch ng lao phân l p t  các vùng đ a lý khác nhau. Qua ố ủ ậ ừ ị đó làm 

ti n đ  xây d ng m t s  b  kit real­time PCR, nh m phát hi n nhanh vi khu n laoề ề ự ộ ố ộ ằ ệ ẩ  kháng rifampicin và isoniazid t i Vi t Nam.ạ ệ

1.5.4. K  thu t real­time PCR và multiplex real­time PCRỹ ậ

Real­time PCR là k  thu t PCR mà k t qu  khu ch đ i DNA đích hi n thỹ ậ ế ả ế ạ ể ị 

được ngay sau m i chu k  nhi t c a ph n  ng, do đ c đi m này nên v i real­timeỗ ỳ ệ ủ ả ứ ặ ể ớ  PCR người làm thí nghi m không c n thi t ph i làm ti p các bệ ầ ế ả ế ước thí nghi m đệ ể 

đ c và phân tích k t qu  đ  xác đ nh có s n ph m khu ch đ i đích hay không vì k tọ ế ả ể ị ả ẩ ế ạ ế  

qu  cu i cùng c a ph n  ng khu ch đ i cũng đả ố ủ ả ứ ế ạ ược hi n th  ngay sau khi hoàn t tể ị ấ  

ph n  ng khu ch đ i. Nh  v y, nên có th  nói real­time PCR là k  thu t nhân b nả ứ ế ạ ư ậ ể ỹ ậ ả  DNA đích trong  ng nghi m thành hàng t  b n sao d a vào các chu k  nhi t và k tố ệ ỷ ả ự ỳ ệ ế  

qu  khu ch đ i trong  ng ph n  ng đả ế ạ ố ả ứ ược hi n th  cùng lúc v i ph n  ng khu chể ị ớ ả ứ ế  

đ i x y ra đ  ngạ ả ể ười làm thí nghi m có th  th y đệ ể ấ ược

Chìa khóa c a k  thu t real­time PCR chính là hóa ch t và thu c th  có trongủ ỹ ậ ấ ố ử  

ph n  ng, trong đó ch t hu nh quang đả ứ ấ ỳ ược thêm vào h n h p ph n  ng là y u tỗ ợ ả ứ ế ố 

đ u tiên mà ngầ ười làm real­time PCR c n quan tâm. Ch t hu nh quang này ph i làmầ ấ ỳ ả  

th  nào đ   ng ph n  ng có th  phát đế ể ố ả ứ ể ược hu nh quang khi b  chi u b i ngu n sángỳ ị ế ở ồ  kích thích m t khi trong  ng ph n  ng này có s  hi n di n c a s n ph m khu chộ ố ả ứ ự ệ ệ ủ ả ẩ ế  

đ i t  DNA đích, và s  không th  phát đạ ừ ẽ ể ược hu nh quang n u không có s n ph mỳ ế ả ẩ  khu ch đ i trong  ng. Cho đ n nay, nhi u ch t hu nh quang nh  v y đã đế ạ ố ế ề ấ ỳ ư ậ ược tìm 

ra và s  d ng r ng rãi. Trong ph m vi khóa lu n này, chúng tôi ch  xin trình bày ch tử ụ ộ ạ ậ ỉ ấ  

hu nh quang thỳ ường đượ ử ục s  d ng nh t đó là Taqman probe [ấ 8]. 

Probe hay còn g i là “đo n dò” là nh ng đo n oligonucletides s i đ n có trìnhọ ạ ữ ạ ợ ơ  

t  có th  b t c p b  sung v i m t trình t  đ c hi u trên DNA đích (trong PCR, đó làự ể ắ ặ ổ ớ ộ ự ặ ệ  

s n ph m khu ch đ i đ c hi u t  DNA đích). Đo n dò này v i đ u 5’ có g n ch tả ẩ ế ạ ặ ệ ừ ạ ớ ầ ắ ấ  phát hu nh quang (g i là reporter) còn đ u 3’ có g n ch t d p t t hu nh quangỳ ọ ầ ắ ấ ậ ắ ỳ  

tương  ng (g i là quencher) đ  d p t t đứ ọ ể ậ ắ ược ánh sáng hu nh quang đỳ ược phát ra từ reporter. C  ch  c a s  phát tín hi u hu nh quang khi có s n ph m khu ch đ i làơ ế ủ ự ệ ỳ ả ẩ ế ạ  

nh  ho t tính 5’­3’ exonuclease c a enzyme ờ ạ ủ Taq polymerase có kh  năng c t b  cácả ắ ỏ  probe khi các probe b t c p lên s i khuôn và c n đ u 3’ c a m i khi enzyme kéo dàiắ ặ ợ ả ầ ủ ồ  

m i đ  t ng h p s i b  sung (hình 1.9)ồ ể ổ ợ ợ ổ

Hình 1.9. Nguyên lý ho t đ ng c a real­time PCR s  d ng Taqman probeạ ộ ủ ử ụ  

(http://www.asuragen.com/Services/services/gene_expression/ab_taqman.aspx)

Trên hình 1.9 minh h a nguyên lý ho t đ ng c a Taqman probe trong real­timeọ ạ ộ ủ  PCR. Khi b t đ u có s  xu t hi n s n ph m khu ch đ i đ c hi u thì Taqman probeắ ầ ự ấ ệ ả ẩ ế ạ ặ ệ  

s  b t c p vào s i khuôn c a s n ph m này   giai đo n nhi t đ  b t c p và s  bẽ ắ ặ ợ ủ ả ẩ ở ạ ệ ộ ắ ặ ẽ ị 

Taq polymerase c t b  đ  kéo dài m i t ng h p nên s i b  sung, do v y reporterắ ỏ ể ồ ổ ợ ợ ổ ậ  

c a Taqman probe s  b  c t r i xa quencher và phát đủ ẽ ị ắ ờ ược hu nh quang khi nh nỳ ậ  

được ngu n sáng kích thích. Càng nhi u s n ph m khu ch đ i xu t hi n thì sồ ề ả ẩ ế ạ ấ ệ ố 

lượng reporter t  do s  càng nhi u, đ n m t lúc nào đó cự ẽ ề ế ộ ường đ  hu nh quang phátộ ỳ  

ra t  reporter đ  m nh thì máy s  ghi nh n đừ ủ ạ ẽ ậ ược tín hi u hu nh quang phát ra tệ ỳ ừ 

ng ph n  ng khi nh n đ c ngu n sáng kích thích. Ng c l i, khi không có s

xu t hi n c a s n ph m khu ch đ i đ c hi u t  DNA đích thì Taqman probe v nấ ệ ủ ả ẩ ế ạ ặ ệ ừ ẫ  

còn nguyên v n do v y mà hu nh quang phát ra t  reporter s  b  quencher c a probeẹ ậ ỳ ừ ẽ ị ủ  

h p ph  (d p t t tín hi u) do đó  ng th  nghi m s  không phát đấ ụ ậ ắ ệ ố ử ệ ẽ ược tín hi u hu nhệ ỳ  quang khi nh n đậ ược ngu n sáng kích thích [ồ 8]

Multiplex real­time PCR là  m t d ng thay đ i c a ph n  ng real­time PCRộ ạ ổ ủ ả ứ  thông thường,   đó trong cùng m t lúc hai hay nhi u gen đích đở ộ ề ược khuy ch đ iế ạ  

b ng cách s  d ng đ ng th i các c p m i và các probeằ ử ụ ồ ờ ặ ồ  khác nhau. 

K  thu t multiplex real­time PCR cho phép ti t ki m th i gian, công s c vàỹ ậ ế ệ ờ ứ  đóng vai trò r t quan tr ng trong ch n đoán phân t  bao g m phân tích đ t bi n gen,ấ ọ ẩ ử ồ ộ ế  tính đa hình DNA và phân tích đ nh lị ượng, ph n  ng multiplex real­time PCR r t h uả ứ ấ ữ  ích cho vi c phát hi n tr c ti p các đ t bi n c a ệ ệ ự ế ộ ế ủ M. tuberculosis t  các m u lâmừ ẫ  sàng. 

Ch ươ ng 2 – V T LI U VÀ PHẬ Ệ ƯƠNG PHÁP NGHIÊN C UỨ

2.1. V T LI U NGHIÊN C UẬ Ệ Ứ

2.1.1. Đ i tố ượng nghiên c uứ

Các ch ng vi khu n lao nh y c m v i thu c kháng sinh, kháng đ n thu củ ẩ ạ ả ớ ố ơ ố  (kháng m t lo i thu c INH ho c RIF), kháng đa thu c (kháng ít nh t hai lo i thu cộ ạ ố ặ ố ấ ạ ố  dòng th  nh t là INH và RIF) và siêu kháng thu c (kháng t t c  các thu c ch ng laoứ ấ ố ấ ả ố ố  

hi n t i) đệ ạ ược thu th p t  các vùng mi n khác nhau nh  B nh vi n Ph m Ng cậ ừ ề ư ệ ệ ạ ọ  

Th ch (TP H  Chí Minh), B nh vi n Trung ạ ồ ệ ệ ương Hu  và b nh vi n Lao và B nhế ệ ệ ệ  

ph i Trung ổ ương. Các ch ng lao ủ được phân l p t  các lo i b nh ph m c a b nhậ ừ ạ ệ ẩ ủ ệ  nhân lao nh : đ m, d ch màng ph i, d ch r a ph  qu n, d ch màng b ng  Ngoài ra,ư ờ ị ổ ị ử ế ả ị ụ  trong nghiên c u có s  d ng ch ng chu n qu c t  H37Rv làm đ i ch ng. ứ ử ụ ủ ẩ ố ế ố ứ

DNA t ng s  c a các ch ng lao nghiên c u đổ ố ủ ủ ứ ược tách chi t t i H c vi nế ạ ọ ệ  Quân y. N ng đ  DNA đồ ộ ược đo trên máy NanoDrop®  đ  tinh va tao cac nông đôể ́ ̀ ̣ ́ ̀ ̣ DNA cua cac mâu nh  nhau đê khi đ a vao hôn h p ph n  ng PCR cung môt thê tich̉ ́ ̃ ư ̉ ư ̀ ̃ ợ ả ứ ̀ ̣ ̉ ́  DNA khuôn, va đat khoang 100 ng/thê tich 25µl phan  ng.̀ ̣ ̉ ̉ ́ ̉ ứ

K t qu  đo n ng đ  DNA t ng s  c a t ng m u nghiên c u đế ả ồ ộ ổ ố ủ ừ ẫ ứ ược trình bày trong ph n ph  l c 2.ầ ụ ụ

2.1.2. Vât liêu thiêt bi va dung cu nghiên c ụ ̣ ́ ̣ ̀ ̣ ̣ ứ

Bang 2.1. Cac sinh phâm hoa chât chinh̉ ́ ̉ ́ ́ ́

Tên hoa chât́ ́ Hang san xuât̃ ̉ ́

Nuaire (My)̃

Analitika (Đ c)ứ

May phân tich trinh t  DNA ABI 3100­Avant́ ́ ̀ ự Applied BioSciences (My)̃

katG katG­F 5’­ GAG CCC GAT GAG GTC TAT TG ­ 3’

684katG­R 5’­ GTC TCG GTG GAT CAG CTT GT ­ 3’

rpoB rpoB­FrpoB­R 5’­ ACC GAC GAC ATC GAC CAC TT ­ 3’5’­ GGC GGT CAG GTA CAC GAT CT ­ 3’ 528

Trong đó, c p m i katG­F và katG­R nhân đo n gen ặ ồ ạ katG có ch a codon 315ứ  liên quan kháng thu c isoniazid, c p m i rpoB­F và rpoB­R nhân đo n gen ố ặ ồ ạ rpoB có 

ch a đo n nóng 81 bp liên quan t i kháng thu c rifampicin.ứ ạ ớ ố

BamHI BamHI

2.2.2. PCR nhân đo n gen đíchạ

Ph n  ng PCR nhân đo n genả ứ ạ  katG và rpoB 

đ c hi u đặ ệ ược th c hi nự ệ :

Theo chu k  nhi t nh  sauỳ ệ ư

B ng 2.5. Chu k  nhi t cho ph n  ng PCRả ỳ ệ ả ứ

Bước       Ph n  ng      Nhi t đ  (ả ứ ệ ộ oC)      Th i gian      Chu ờkì

S n ph m PCR đả ẩ ược ki m tra b ng ch y đi n di trên gel agarose 0,8%. Để ằ ạ ệ ể 

ph c v  cho gi i trình t  gen, đo n gen ụ ụ ả ự ạ katG và rpoB được tinh s ch và dòng hóaạ  vào vector tách dòng pBT đ  t o vector tái t  h p. ể ạ ổ ợ

2.2.3. T o dòng genạ

*) T o s n ph m n i ghép ạ ả ẩ ố

B ng 2.6. Thành ph n h n h p ph n  ng n i ghép ả ầ ỗ ợ ả ứ ố

*)   Biên   nap   vá ̣ ̀  nuôi cây tê bao co vectoŕ ́ ̀ ́   tai tô h ṕ ̉ ợ

S n   ph m   n iả ẩ ố  ghép   được   bi n   n pế ạ  vào t  bào kh  bi n ế ả ế E. coli DH5α (đã đươc x  lý b ng CaClử ằ 2 theo phương pháp chu n) b ng s c nhi t 42ẩ ằ ố ệ oC trong 90 giây. S n ph m bi n n p đả ẩ ế ạ ược b  sung 200ổ  

µl LB l ng, l c 200 vòng/phút trong 1 gi    37ỏ ắ ờ ở oC và tr i trên đĩa th ch có b  sungả ạ ổ  

ampicillin 100 mg/l, IPTG 100 mg/l và X­gal 200 mg/l. Đĩa th ch đạ ượ ủc   qua đêm  37

ở oC. Ch n m t khu n l c tr ng trên m i đĩa ti p t c đọ ộ ẩ ạ ắ ỗ ế ụ ược ch n nuôi qua đêmọ  trong môi trường LB l ng có b  sung kháng sinh ampicillin 100 mg/l. ỏ ổ

*) Tach chiêt Plasmid và ki m trá ́ ể

Khu n   nuôi   qua   đêm   s   đẩ ẽ ược   thu   l i   b ng   ly   tâm   và   tách   plasmid   theoạ ằ  protocol c a b  kit ủ ộ AccuPrep Plasmid mini Extraction (Bioneer – Hàn Qu c)ố  Plasmid tái t  h p đổ ợ ược ki m tra có đo n gen nghiên c u qua ph n  ng c t b ng enzymeể ạ ứ ả ứ ắ ằ  

h n chạ ế BamHI. Kêt qua sau khi th c hiên phan  ng căt se thu đ́ ̉ ự ̣ ̉ ứ ́ ̃ ược hai phân: tao 1̀ ̣  band trên anh điên di co kich th̉ ̣ ́ ́ ươc 684 bp (đôi v i gen ́ ́ ớ katG) ho c kích thặ ước 528 bp (đ i v i gen ố ớ rpoB) va môt band la phân con lai cua plasmid kho ng 2,7 kb.̀ ̣ ̀ ̀ ̀ ̣ ̉ ả

*) Phân tích k t qu ế ả

Kêt qua xac đinh trinh t  trên may ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer.́ ̉ ́ ̣ ̀ ự ́Khai thac d  liêu t  genbank, thiêt lâp chung wild type đê so sanh: Chunǵ ữ ̣ ừ ́ ̣ ̉ ̉ ́ ̉  H37Rv trên genbank (ID: 83332, ACCESSION NC_000962) v i gen ớ katG và rpoB đã 

được công bô ký hi u l n ĺ ệ ầ ượt là Rv1908c và Rv0667

X  lý, phân tích các trình t  đo n gen  ử ự ạ katG  684bp và  rpoB  528bp c a cácủ  

ch ng vi khu n lao nh y và kháng b ng chủ ẩ ạ ằ ương trình phân tích chu i BioEdit. Soỗ  sánh đ i chi u v i các d  li u ngân hàng gen đ  có k t qu  các v  trí đ t bi n c aố ế ớ ữ ệ ể ế ả ị ộ ế ủ  

t ng ch ng nghiên c u. ừ ủ ứ

2.2.4. Multiplex real­time PCR

Sau khi tách dòng và gi i trình t  đo n gen ả ự ạ katG và rpoB c a các ch ng viủ ủ  khu n lao nghiên c u đẩ ứ ược phân l p t i các vùng mi n khác nhau t i Vi t Nam, quaậ ạ ề ạ ệ  phân tích các đ t bi n, các probe s  độ ế ẽ ược thi t k  nh m phát hi n các đ t bi n cóế ế ằ ệ ộ ế  liên quan kháng INH và RIF   vi khu n lao b ng ph n  ng multiplex real­time PCR.ở ẩ ằ ả ứ  

Do trong ph n  ng multiplex real­time PCR s  d ng 2 probe khác nhau trong cùngả ứ ử ụ  

m t ph n  ng nên vi c l a ch n 2 probe này ph i g n 2 reporter (ch t phát hu nhộ ả ứ ệ ự ọ ả ắ ấ ỳ  quang) khác nhau đ  có th  phân bi t   các bể ể ệ ở ước sóng khác nhau. 

Probe dùng cho ph n  ng real­time PCR s  d ng cho nghiên c u này đả ứ ử ụ ứ ượ  cthi t k  theo công ngh  TaqManế ế ệ   MGB (Minor Groove Binding)  probe (TaqManR Chemistry) c a hãng Applied Biosystemsủ  d ng ạ TaqMan này có  u đi m đó là có thư ể ể 

th c hi n ph n  ng real­time PCR   nhi t đ  cao, t  đó làm tăng đ  đ c hi u c aự ệ ả ứ ở ệ ộ ừ ộ ặ ệ ủ  các probe. H n n a các lo i probe thu c d ng này đơ ữ ạ ộ ạ ược d  dàng phân bi t d a trênễ ệ ự  nhi t đ  nóng ch y. Chính vì v y các lo i probe này thệ ộ ả ậ ạ ường được dùng đ  th cể ự  

hi n   các   ph n   ng   multiplex   real­time   PCR   v i   đ   đ c   hi u   và   đ   nh y   caoệ ả ứ ớ ộ ặ ệ ộ ạ  TaqMan hay phương pháp nuclease đ u 5’ là m t trong nh ng thí d  v  các lo iầ ộ ữ ụ ề ạ  probe th y phân, tín hi u hu nh quang phát ra do s  th y phân các đo n probe đủ ệ ỳ ự ủ ạ ượ  cdùng đ  phát hi n các đo n s n ph m PCR. Các đo n probe để ệ ạ ả ẩ ạ ược g n v i m tắ ớ ộ  reporter   đ u 5’ và m t quencher (ch t d p t t tín hi u hu nh quang)   đ u 3’.ở ầ ộ ấ ậ ắ ệ ỳ ở ầ  Trong nghiên c u chúng tôi s  ứ ử d ng 2 probe có g n 2 reporter khác nhau, reporterụ ắ  

g n FAM cho phép phát tín hi u hu nh quang khi  đo   bắ ệ ỳ ở ước sóng 530 nm và 

quencher được g n   đ u 3’ c a m i probe là các BHQ phát nhi t, các BHQ phátắ ở ầ ủ ỗ ệ  nhi t hi n nay đệ ệ ượ ưc  a chu ng s  d ng vì kh  năng h p th  hu nh quang r tộ ử ụ ả ấ ụ ỳ ấ  

m nh, các BHQ đạ ược xem nh  các l  đen (black hole quencher – BHQ) hút l y t tư ỗ ấ ấ  

c  các hu nh quang t  reporter không cho b t c  hu nh quang nào phát ra đả ỳ ừ ấ ứ ỳ ượ ừ c treporter, đ ng th i r t d  dàng đ  thi t k  các Taqman probe dùng cho multiplexồ ờ ấ ễ ể ế ế  real­time PCR mà không lo đ n ph  hu nh quang c a các reporter có b  trùng v iế ổ ỳ ủ ị ớ  

ph  hu nh quang c a quencher vì quencher không h  phát hu nh quang.ổ ỳ ủ ề ỳ

Ch ươ ng 3 – K T QU  VÀ TH O LU NẾ Ả Ả Ậ

3.1. K T QU  TÁCH DÒNG VÀ GI I TRÌNH TẾ Ả Ả Ự

3.1.1. Kêt qua nhân gen ́ ̉ katG và rpoB t  DNA tach t  vi khu n laoừ ́ ừ ẩ

Hai  gen  katG và  rpoB  được khu ch đ i tế ạ ừ  t ng s  ổ ố 93 ch ng vi khu n lao,ủ ẩ  trong đó g m có m t ch ng chu n qu c t  H37Rv, mi n B c có ồ ộ ủ ẩ ố ế ề ắ 9 ch ng đ n khángủ ơ  

và 13 ch ng đa kháng;  mi n Nam có 10 ch ng nh y, 1ủ ề ủ ạ 1 ch ng kháng đ n, ủ ơ 14 ch ngủ  kháng đa và 12 ch ng siêu kháng; mi n Trung có ủ ề 11 ch ng kháng đ nủ ơ  và 12 ch ngủ  

đa kháng. Đ c tính kháng thu c c a t ng ch ng thu c các mi n khác nhau đặ ố ủ ừ ủ ộ ề ượ  ctrình bày trên b ng 3.1 và ph n ph  l c 2. ả ầ ụ ụ

B ng 3.1: Đ c tính kháng thu c c a ch ng vi khu n lao nghiên c uả ặ ố ủ ủ ẩ ứ

K t qu  nhân hai ế ả gen katG và rpoB b ng k  thu t PCR đằ ỹ ậ ược trình bày trong hình 3.1A và 3.1B.  K t qu    hình 3.1A là k t qu  đ i di n s n ph m PCR nhânế ả ở ế ả ạ ệ ả ẩ  

gen katG, còn hình 3.1B là k t qu  đ i di n c a s n ph m PCR nhân gen ế ả ạ ệ ủ ả ẩ rpoB.

M: Marker 1 kb

1­6: Th  t  tên các m u nghiên c u tứ ự ẫ ứ ương  ngứ

7: Đ i ch ng âmố ứ

K t qu  đi n di ki m tra sau khi PCR nhân gen ế ả ệ ể katG và rpoB cho th y c  93ấ ả  

ch ng vi khu n lao đ u cho k t qu  dủ ẩ ề ế ả ương tính v i đo n gen ớ ạ rpoB 528 bp và katG 

684 bp. Các băng s n ph m ả ẩ đêu đ c hi u, rõ nét không co vach phu kem theo và cóặ ệ ̣ ̣  

bp

kích thước đúng theo tính toán lý thuy t. Tuy nhiên, đ  kh ng đ nh chính xác đo nế ể ẳ ị ạ  gen nghiên c u và phân tích các đ t bi n có liên quan kháng thu c trên các đo n genứ ộ ế ố ạ  này, chúng tôi đã ti n hành tách dòng và gi i trình t  gen.ế ả ự

3.1.2. Kêt qua tach dong geń ̉ ́ ̀

Bươc đâu tiên cua qua trinh tach dong la th c hiên phan  ng ghep nôi gen đích́ ̀ ̉ ́ ̀ ́ ̀ ̀ ự ̣ ̉ ứ ́ ́  vao vector tach dong pBT, Phan  ng nôi đ̀ ́ ̀ ̉ ứ ́ ược xuc tac b i T́ ́ ở 4 DNA ligase. Sau khi đo nạ  gen đích đã được g n vào vector pBT, đ  làm gia tăng s  lắ ể ố ượng b n sao c a vectorả ủ  tái t  h p này m t cách nhanh chóng, chúng tôi ti n hành bi n n p plasmid tái tổ ợ ộ ế ế ạ ổ 

h p vào trong t  bào kh  bi n ợ ế ả ế E.coli DH5  và nuôi c y trên môi trấ ường LB l ng,ỏ  

l c 200 vòng/phút   37ắ ở 0C trong 1 gi  đ  làm ph c h i t  bào ờ ể ụ ồ ế E.coli mang plasmid tái 

t  h p đó. S n phâm biên nap sau đó đổ ợ ả ̉ ́ ̣ ược cây trai trên môi tŕ ̉ ương LB đăc co bồ ̣ ́ ̉ sung khang sinh chon loc ampicillin 50 µg/ml, X­gal 20 mg/ml va IPTG 100 mM và́ ̣ ̣ ̀  

được nuôi tĩnh   37ở 0C trong 18h. K t qu  bi n n pế ả ế ạ  được trinh bay   hinh 3.2.̀ ̀ ở ̀

Hình 3.2. Chon dong khuân mang plasmid tai tô h p trên môi tṛ ̀ ̉ ́ ̉ ợ ương LB co bô sung̀ ́ ̉  

ampicillin 50 µg/ml, X­gal 20 mg/ml va IPTG 100 mM̀ .

Sau   18   gi   nuôi   c y,   trên   môi   trờ ấ ương   LB   th ch   co   ch a   khang   sinh̀ ạ ́ ứ ́  ampicillin, X­gal va IPTG, xu t hi n hai loai khuân lac: khuân lac mau xanh và ấ ệ ̣ ̉ ̣ ̉ ̣ ̀ ̀ khuân lac mau trăng. Tât ca cac khuân lac nay la nh ng khuân lac đa đ̉ ̣ ̀ ́ ́ ̉ ́ ̉ ̣ ̀ ̀ ữ ̉ ̣ ̃ ược biên naṕ ̣  plasmid ch a gen khang khang sinh ampicillin, tuy nhiên chi co nh ng khuân lacứ ́ ́ ̉ ́ ữ ̉ ̣  mau trăng là mang plasmid tai tô h p. Do đó, chúng tôi l a ch n các khu n l c̀ ́ ́ ̉ ợ ự ọ ẩ ạ  

tr ng này đem nuôi c y qua đêm   37ắ ấ ở 0C, l c 200 vòng/phút trong môi trắ ường LB 

l ng có b  sung kháng sinh phù h p. S n ph m nuôi c y đỏ ổ ợ ả ẩ ấ ược ly tâm đ  thu khu nể ẩ  

ph c v  cho quá trình tách plasmid.ụ ụ