Xây dựng qui trình tạo vật liệu khởi đầu và bước đầu tái sinh chồi in vitro cây hoàng tinh hoa đỏ (polygonatum kingianum coll et hemls ) (2017)

28 Hình 3.5: So sánh trình tự psbA-trnH kí hiệu HTHD_Sapa_01 thu từ cây Hoàng tinh hoa đỏ thu tại Sa Pa và của loài P.kingianum Mã số Hình 3.8: Chồi in vitro của Hoàng tinh hoa đỏ sau 6

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

- - 

-TRẦN HỒNG THU

XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO VẬT LIỆU KHỞI

ĐẦU VÀ BƯỚC ĐẦU TÁI SINH CHỒI IN VITRO

CÂY HOÀNG TINH HOA ĐỎ

(Polygonatum kingianum Coll et Hemls.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

- - 

-TRẦN HỒNG THU

XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO VẬT LIỆU KHỞI

ĐẦU VÀ BƯỚC ĐẦU TÁI SINH CHỒI IN VITRO

CÂY HOÀNG TINH HOA ĐỎ

(Polygonatum kingianum Coll et Hemls.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Người hướng dẫn khoa học:

TS LA VIỆT HỒNG

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS La Việt Hồng- Khoa Sinh

KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ emtrong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em xin cảm ơn tới Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủnhiệm khoa Sinh - KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2, Phòng công nghệ ANDứng dụng - Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện để em hoàn thànhkhóa luận này

Em cũng xin chân thành cảm PGS.TS Lê Văn Sơn - Phòng Công nghệ

ADN ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi về thiết

bị, phương tiện để em có thể hoàn thành khóa luận

Trong thời gian thực hiện đề tài em cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình

của cô Mai Thị Hồng- Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật trường Đại học Sư

phạm Hà Nội 2 cùng tập thể cán bộ phòng Công nghệ ADN ứng dụng - ViệnCông nghệ Sinh học đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến để em hoàn thành đề tàikhóa luận

Nhân đây em cũng xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên,góp ý cho em trong qua trình học tập và hoàn thành đề tài

Hà Nội, tháng năm 2017

Sinh viên

TRẦN HỒNG THU

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng em.Các số liệukết quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực và chưa được ai công bố

Hà Nội, tháng năm 2017

Sinh viên

TRẦN HỒNG THU

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu về chi Polygonatum 4

1.1.1 Phân loại 4

1.1.2 Mô tả chi Polygonatum 4

1.1.3 Phân bố 4

1.1.4 Hợp chất tự nhiên trong cây thuộc chi Polygonatum 5

1.1.5 Giá trị dược liệu 5

1.1.6 Hiện trạng khai thác trong và ngoài nước 5

1.2 Một số phương pháp sử dụng trong việc định danh loài và xác định quan hệ di truyền 6

1.2.1 Giới thiệu DNA barcode 7

1.3 Sơ lược về nhân giống cây in vitro 9

1.3.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 9

1.3.2 Các giai đoạn nhân giống in vitro 10

1.3.3 Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 11

1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới nuôi cấy mô 12

1.4 Các nghiên cứu về cây Hoàng tinh hoa đỏ 15

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 16

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 16

2.2 Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 16

2.2.1 Vật liệu thực vật 16

2.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ 16

2.2.3 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 17

2.2.4 Hóa chất và môi trường nuôi cấy 17

2.2.5 Điều kiện nuôi cấy in vitro 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Thu thập mẫu và nhận dạng loài 18

2.3.2 Tái sinh chồi in vitro cây Hoàng tinh hoa đỏ 21

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Đặc điểm phân loại loài Hoàng tinh hoa đỏ thu tại Sa Pa (Lào Cai) 24 3.1.1 Đặc điểm hình thái 24

3.1.2 Đặc điểm phân loại loài bằng chỉ thị phân loại phân tử 25

3.2 Tái sinh chồi in vitro cây Hoàng tinh hoa đỏ 30

3.2.1 Tạo vật liệu khởi đầu 30

3.2.2 Tái sinh chồi in vitro: 32

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38

4.1 Kết luận 38

4.2 Kiến nghị 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi nhân bản gen barcode 17Bảng 3.1: Hệ số tương đồng của mẫu nghiên cứu và của các loài đã được

công bố trên ngân hàng Genbank dựa trên chỉ thị psbA-trnH 28

Bảng 3.2: Hệ số tương đồng của mẫu nghiên cứu và của các loài đã được

công bố trên ngân hàng Genbank dựa trên chỉ thị RpoC 30

Bảng 3.3: Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu Hoàng Tinh Hoa Đỏ 31Bảng 3.4: Ảnh hưởng của BAP đến khả năng phát sinh chồi Hoàng Tinh Hoa

Đỏ sau 6 tháng nuôi cấy 33Bảng 3.5: Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IAA đến khả năng tạo chồi HoàngTinh Hoa Đỏ sau 6 tháng nuôi cấy 35

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cây Hoàng tinh hoa đỏ 4Hình 3.1: Mẫu cây thu tại Sa Pa-Lào Cai 24Hình 3.2: Kết quả điện di DNA tổng số của mẫu Hoàng tinh hoa đỏ nghiên

cứu 25

Hình 3.3: Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR gen P10 (psbA-trnH) và gen

RpoC1 M: thang Marker 1Kb 26

Hình 3.4: Cây phân loại dựa trên chỉ thị psbA-trnH của mẫu nghiên cứu

(HoangTinhHoaDo) 28

Hình 3.5: So sánh trình tự psbA-trnH (kí hiệu HTHD_Sapa_01) thu từ cây

Hoàng tinh hoa đỏ thu tại Sa Pa và của loài P.kingianum (Mã số

Hình 3.8: Chồi in vitro của Hoàng tinh hoa đỏ sau 6 tháng nuôi cấy trên môi

trường MS bổ sung chất kích thích sinh trưởng 34

Hình 3.9: Chồi in vitro của Hoàng tinh hoa đỏ sau 6 tháng nuôi cấy trên môi

trường MS bổ sung chất kích thích sinh trưởng 36Hình 3.10: Mẫu Hoàng tinh hoa đỏ sau 8 tháng nuôi cấy trên môi trường MS

bổ sung chất kích thích sinh trưởng 37

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CBOL Consortium for the Barcode of Life

dNTP Deoxyribonucleotide triphosphateEDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

Taq polymerase Thermus aquaticus polymerase

2,4-D 2,4- Dichlorophenoxy acetic aicd

1 Lí do chọn đề tài

MỞ ĐẦU

Xu hướng phát triển hiện nay của nền y học Việt Nam cũng như một sốnước trong khu vực Đông Nam Á là quay về với nền y học cổ truyền, sử dụngnhững bài thuốc dân gian dưới tác dụng của các loài cây dược liệu Cây của

chi Polygonatum là một trong những loài dược liệu quý, được sử dụng rộng

rãi trong nghiên cứu và dùng để chữa trị nhiều bệnh [22] Trong những nămgần đây, các nhà khoa học trên thế giới đã có một số nghiên cứu về chi

Polygonatumvà cho thấy Polygonatum là một chi khá phức tạp với số lượng

NST (2n= 16, 18, 20, 21, 22, 24, 26, 27, 28, 30, 31, 36, 38, 40,…) [18], đượcđại diện bởi 60 loài trên thế giới, phân bố chủ yếu ở khu vực ôn đới từ dãyHimalaya đến Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, và Malaixia Ở Trung Quốc có

32 loài gồm 20 loài là đặc hữu, trong đó có loài Polygonatum kingianum Coll.

Et Hemsl [22].Đây là một chi khá phức tạp nên việc nhận dạng loài nói chung

và nhận dạng cây Hoàng Tinh Hoa Đỏ (Polygonatum kingianum Coll Et

Hemsl) nói riêng là tương đối khó khăn Hiện nay, phương pháp DNAbarcode là một trong những công cụ phục vụ định danh loài chính xác, nhanhchóng, tự động hóa bằng cách sử dụng một vùng DNA chuẩn hay còn gọi làchỉ thị DNA hay mã vạch DNA (DNA barcode) Việc xác định loài bằngDNA chỉ thị có hiệu quả cao trong việc phân biệt các loài thực vật trong khinhững quan sát hình thái, sinh trưởng và phát triển chưa đủ cơ sở để địnhdanh hoặc phân biệt loài [12]

Hoàng tinh hoa đỏ là cây dược liệu thuộc chi Polygonatum được sử dụng

phổ biến trong Y học cổ truyền phương Đông với tên vị thuốc "Thục hoàng".Theo Y học cổ truyền, Thục hoàng có tác dụng kiện tỳ, nhuận phế, ích thận,được sử dụng để điều trị chứng ho khan, các bệnh về phổi nhờ tác dụng khángkhuẩn hiệu quả; ngoài ra còn được dùng làm thuốc bổ Ở nước ta, Hoàng tinh

hoa đỏ (Polygonatum kingianum Coll Et Hemsl) mọc tự nhiên ở vùng đồi núi

các tỉnh phía Bắc như Lào Cai, Lai Châu, Hà Giang Cây thường mọc dướitán rừng ở khu vực có khí hậu mát, độ ẩm cao, đất nhiều mùn và tái sinh tựnhiên bằng hạt [1], [4], [5] Tuy nhiên, khả năng nảy mầm tự nhiên của hạt làrất thấp, chất lượng cây con không đồng đều, hạt bị nhiễm bệnh, Ngày nay,với kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật thì ngoài điểm là

có khả năng nhân giống từ nhiều bộ phận khác nhau của thực vật còn tạo racây giống sạch bệnh, đảm bảo chất lượng củ

Xuất phát từ thực trạng trên, nhằm góp một phần vào quy trình bảo tồnHoàng tinh hoa đỏ cũng như tạo ra nguồn giống sạch bệnh Vì vậy, tôi tiếnhành nghiên cứu đề tài: “Xây dựng quy trình tạo vật liệu khởi đầu và bước

đầu tái sinh chồi invitro cây Hoàng Tinh Hoa Đỏ(Polygonatum kingianum

Coll et Hemls.)”

2 Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu

2.1 Mục đích nghiên cứu:

- Xác định hai chỉ thị phân tử của loài bằng kĩ thuật DNA Barcode.

- Xây dựng quy trình tạo vật liệu khởi đầuin vitro Hoàng Tinh Hoa Đỏ.

- Bước đầu tái sinh chồi cây Hoàng Tinh Hoa Đỏin vitro.

2.2 Nghiệm vụ nghiên cứu

- Phân lập, giải trình tự hai gen psbA-trnH, RpoC1

- Ảnh hưởng của javen đến quá trình khử trùng bề mặt tạo vật liệu khởi

- Ảnh hưởng của benzylamino purine(BAP) và BAP kết hợp với Axit

β-indol axetic (IAA) đến khả năng tạo chồi ở cây Hoàng Tinh Hoa Đỏ và ảnhhưởng của 2,4- Di Clo phenoxi axetic (2,4D) đến khả năng tạo mô sẹo

3 Ý nghĩa

3.1 Ý nghĩa khoa học: là công trình đầu tiên ở Việt Nam nhằm bảo tồn

gen dược cây Hoàng Tinh Hoa Đỏ

3.2 Ý nghĩa thực tiễn: kết quả của đề tài có thể sử dụng để thay thế

phương pháp truyền thống (hom củ) Hoàng Tinh Hoa Đỏ

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về chi Polygonatum

1.1.1 Phân loại

Giới: Thực vật

Bộ: Măng tây (Asparagales)

Họ: Hoàng tinh (Convallariaceae)

Hình 1.1: Cây Hoàng tinh

hoa đỏ

1.1.2 Mô tả chi Polygonatum

Chi Polygonatum là thực vật có hoa, sống nhiều năm.Thân rễ (củ) to, phân nhánh mọc ngang, chia đốt Cây của chi Polygonatum đặc biệt ưa ẩm và

ưa bóng; thường mọc rải rác trên đất có nhiều mùn hoặc trên các hốc mùn đá,dọc theo các bờ khe suối, dưới tán rừng kín thường xanh trên núi đá vôi Độcao từ 1.000 - 1.700 m Ở những nơi có hoàng tinh mọc tự nhiên, khí hậuquanh năm mát, nhiệt độ trung bình từ 13,5 - 16,5°C Cây sinh trưởng pháttriển mạnh trong mùa mưa ẩm, đến mùa đông toàn bộ phần trên mặt đất tànlụi và sẽ mọc lại vào đầu mùa xuân năm sau [8]

1.1.3 Phân bố

Chi Polygonatum được đại diện bởi 60 loài trên thế giới, phân bố chủ

yếu ở khu vực ôn đới từ dãy Himalaya đến Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, vàMalaixia Ở Trung Quốc có 32 loài gồm 20 loài là đặc hữu [22] Ở Việt Nam,được tìm thấy ở Hà Giang (huyện Đồng Văn, Mèo Vạc, Quản Bạ); Sơn La(Mường La); Điện Biên (Tủa Chùa); Lai Châu (Sìn Hồ, Phong Thổ, Than

Uyên); Lào Cai (Sa Pa, Bát Xát); Yên Bái (Mù Căng Chải) Gần đây mớiphát hiện một địa điểm phân bố tại xã Mường Hoong, huyện Đăk Glei, tỉnhKon Tum [8].

1.1.4 Hợp chất tự nhiên trong cây thuộc chi Polygonatum

Nhiều nhóm nghiên cứu về thực vật trên thế giới đã phát hiện về sự đa

dạng của các hợp chất từ chi Polygonatum chủ yếu tập trung ở phần rễ (củ) là

saponin, các phytohoocmon, glycosides, flavonoid và alkaloids [14]

1.1.5 Giá trị dược liệu

Chi Polygonatum là nguồn gen hiếm và độc đáo, đồng thời cũng là cây

thuốc quý Thân rễ (củ) chế biến thành “thục hoàng” dùng làm thuốc bổ chongười già, cơ thể bị suy kiệt, hoặc mới ốm dậy Ngoài ra sử dụng trong điềutrị ho khan, các vấn đề về phổi, làm mát phổi, chữa huyết áp thấp [8] Nóđược khuyên trong điều trị viêm dạ dày, kiết lỵ mãn tính, các rối loạn liênquan đến hệ tiêu hóa [14] Một số nghiên cứu cho thấy, trong thành phần hóahọc của các cây thuộc chi này có tác dụng giảm đau, lợi tiểu, hạ sốt, chống sốtrét, chất chống oxy hóa, kháng khuẩn [13] chính vì có giá trị dược liệu cao

mà chi này đang ở tình trạng suy giảm nghiêm trọng, hiện trở nên rất hiếmgặp Trong đó có nhiều loài như Hoàng tinh hoa đỏ, Hoàng tinh đốm đãđược đưa vào Sách Đỏ Việt Nam (1996) [8]

1.1.6 Hiện trạng khai thác trong và ngoài nước

Chi Polygonatum đã bị khai thác nhiều lần ở tất cả các địa phương kể

trên Đặc biệt trong những năm của thập kỷ 70 thuộc thế kỷ trước, ngành Y tế

đã thu mua được từ vài tấn đến vài chục tấn củ tươi mỗi năm Do khai thácliên tục nhiều năm, cộng với nạn phá rừng làm mất môi trường sống, đã làmcho cây thuốc này bị giảm sút nghiêm trọng Hoàng tinh thậm chí đã trở nênrất hiếm gặp ngay cả những vùng được coi là có nhiều nhất ở Việt Nam cũngnhư ở Trung Quốc hay phía Bắc của Lào [8]

Để bảo tồn, Hoàng tinh hoa đỏ đã được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam(1996); Danh lục Đồ cây thuốc Việt Nam (1996, 2001, 2006) và có tên trongDanh mục II.A của Nghị định số 32/2006/NĐ - của Chính phủ (30/3/1006).

1.2 Một số phương pháp sử dụng trong việc định danh loài và xác định quan hệ di truyền

Có nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau trong phân loại và xácđịnh loài ở động, thực vật và hầu hết các phương pháp này đều dựa trênnguyên tắc như những loài có chung nguồn gốc, có những tính chất giốngnhau, càng gần nhau thì tính chất giống nhau càng nhiều Sự giống nhau cóthể về đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh lý sinh hoá, phôi sinh học Đối vớithực vật, đặc điểm hình thái học của các loài thực vật qua nhận biết hình thái

lá, hoa, quả, cách thức phân cành…có ưu điểm dễ quan sát trực tiếp bằng trựcquan tuy nhiên hiệu quả chưa cao Điều này thật sự gặp nhiều khó khăn khicác mẫu vật cần giám định không còn nguyên vẹn, mất hình thái bên ngoài

Do vậy, việc định danh dựa trên quan sát hình thái và kinh nghiệm dân gian

sẽ được hỗ trợ chính xác hơn nếu sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiệnđại

Các phương pháp phân loại học phân tử và xác định loài là hướngnghiên cứu được phát triển mạnh trên thế giới hiện nay, được xây dựng dựatrên việc nhận biết thành phần và cấu trúc của các gen đặc hữu của các taxonsinh vật Hiện nay, các kỹ thuật dựa trên phân tích DNA là phương pháp cóhiệu quả cao trong việc định loại và giám định loài

Gần đây, việc sử dụng các DNA mã vạch (DNA barcode) để định danhloài đang được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu và cónhững đóng góp đáng kể trong việc phân loại loài Để nhận dạng gen hayđánh giá mức độ tiến hoá loài thì các nhóm gen chính thường được sử dụng làgen ribosome rRNA, gen ty thể, và gen lục lạp (thực vật) trong đó gen rRNA

18S, 5S và 16S hay được dùng để đánh giá mối quan hệ tiến hoá giữa các sinhvật So với chỉ thị hình thái và chỉ thị hoá học, chỉ thị DNA cho độ chính xáccao hơn mà không lệ thuộc vào bất cứ yếu tố khách quan nào [3].

1.2.1.Giới thiệu kỹ thuật DNA barcode

Kỹ thuật DNA barcode “DNA mã vạch” lần đầu tiên được sử dụng vàonăm 1993 (Arnon, 1993), trong một bài báo mà không nhận được sự chú ýnhiều từ cộng đồng khoa học, và gần đây thuật ngữ này được sử dụng lạitrong nhiều nghiên cứu Về cơ bản, kỹ thuật này dựa vào việc sử dụng mộtkhu vựcDNA (400-800 bp) như là một tiêu chuẩn để nhận dạng các loài mộtcách nhanh chóng và chính xác.Kỹ thuật DNA mã vạch giúp các nhà phânloại họctrong công tác phân loại và xác định loài Ngoài ra, kỹ thuật này cótriển vọng nghiên cứu và ứng dụng trong khoa học cuộc sống, trong khoa họcpháp y, y tế, nghiên cứu y dược, sản xuất và kiểm soát chất lượng thực phẩm.Phương pháp này vô cùng có ý nghĩa trong các trường hợp các mẫu vật sinhhọc cần giám định loài đã được qua xử lý, chế biến như các dạng chế phẩmthuốc hay thực phẩm đã qua chế biến…

Trên thực tế, DNA barcode bắt đầu có tầm ảnh hưởng từ nghiên cứucủa Hebert và cs (2002), kết quả của nhóm nghiên cứu chỉ ra rằng các cá thể

từ bộ sưu tập của 200 loài có quan hệ gần gũi với nhau thuộc bộ cánh vảy có

thể xác định với độ chính xác 100% bằng cách sử dụng gen ty thể cytochrome

c oxidase tiểu đơn vị I (COI) [21] Sau đó, nhiều nghiên cứu về định danh loài

bằng chỉ thị DNA đã thành công trên động vật như chim, cá, ốc, nhện và một

số loài côn trùng thuộc bộ Cánh cứng Gần đây, hệ thống chỉ thị DNA đangđược thiết lập cho các nhóm sinh vật khác như thực vật, tảo, nấm, sinh vậtnguyên sinh và vi khuẩn đã thu được hiệu quả đáng kể

Để thúc đẩy việc sử dụng DNA barcode cho tất cả sinh vật nhân chuẩn,CBOL (Consortium for the Barcode of Life ) đã được thành lập vào tháng 5

năm 2004, gồm hơn 120 tổ chức từ 45 quốc gia Với mục tiêu ban đầu là xâydựng một thư viện trực tuyến trình tự barcode cho tất cả các loài chưa đượcbiết đến, có thể làm tiêu chuẩn phân loại cho bất kỳ mẫu DNA nào Với sự hỗtrợ của CBOL, DNA barcode ngày càng phát triển và trở thành một phươngpháp phân loại và định danh loài mới.

Trong bối cảnh của nền kinh tế phát triển nhanh và hậu quả tác độngđến động vật, thực vật của các quốc gia khác nhau, sự xác định loài sử dụngphương pháp nhanh là cần thiết để đánh giá đa dạng sinh học của các khu vựcnày nhằm bảo vệ các loài đặc hữu quý hiếm và nguy cấp Tuy nhiên cần lưu ýrằng DNA barcode không thể thay thế phân loại nhưng nó là công cụ hữu ích

để tạo ra thông tin về đơn vị phân loại chưa biết Hiện nay, trên thế giới, kỹthuật này đang được sử dụng chủ yếu bởi các nhà phân loại học và nhiều nhàkhoa học ở các lĩnh vực khác như khảo cổ học, công nghiệp sinh học và chếbiến thực phẩm…

1.2.1.1 Trình tự gen trnH-psbA

Gen trnH-psbA có kích thước trung bình khoảng 450 bp, nhưng thay đổi

từ 296 đến 1120 bp, trnH-psbA được chứng minh là có khả năng xác định loài cao Locus trnH-psbA đã được khuếch đại thành công ở nhiều thực vật hạt kín

và hạt trần Tuy nhiên, trong nhiều thực vật hạt kín trnH-psbA lại có kích

thước rất ngắn (~ 300 bp) Trong nhiều nghiên cứu gần đây đã đề xuất việc sử

dụng trnH-psbA như chỉ thị barcode độc lập cho thực vật hay kết hợp với

matK CBOL thấy rằng khả năng phân biệt loài của trnH-psbA là cao nhất

(69%) trong số 7 locus được thử nghiệm và do đó đề nghị nó như là chỉ thị

barode bổ sung TrnH-psbA có thể sử dụng trong hệ thống barcode ba locus

khi hệ thống barcode hai locus không cung cấp đầy đủ khả năng phân tích[21]

1.2.1.2 Trình tự gen RpoC1

Trong các nghiên cứu gần đây, CBOL đã thử nghiệm 7 locus và thấy

rằng khả năng phân biệt loài cuả đoạn gen rpoC1 là thấp nhất (43%) Mặc dù vậy, trong nghiên cứu Liu và cộng sự (2010) đã chỉ ra rpoC1 là một chỉ thị rất

hữu ích khi được sử dụng để phân biệt các loài bryophytes

1.3 Sơ lược về nhân giống cây in vitro

1.3.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào in vitro là học

thuyết về tính toàn năng của tế bào do Haberlandt G nêu ra năm 1902 Theoquan điểm của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào thực vật là mỗi

tế bào riêng rẽ đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủcủa cơ thể sinh vật đó, khi gặp điều kiện thuận lợi thì mỗi tế bào có khả năngtái sinh và phát triển thành cá thể hoàn chỉnh

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết quảcủa quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào Trong đó:

- Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào

mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau

- Khi các tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng riêng biệt,chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình mà trong trường hợpcần thiết, ở điều kiện thích hợp chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh vàphân chia mạnh mẽ Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào và ngược lạivới sự phân hóa tế bào

Như vậy, kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật xét cho cùng là kĩthuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy táchrời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) Đây là một điểm rất quan trọng vìtrên cơ sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện kĩ thuật tiên tiếncho việc chọn, cải thiện và cả lai tạo giống cây trồng

1.3.2 Các giai đoạn nhân giống in vitro

Giai đoạn 1: Tạo vật liệu in vitro

Đây là giai đoạn tối quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trình

nhân giống in vitro.Mục đích của giai đoạn này là tạo ra được nguyên liệu thực vật vô trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro Khử trùng mô thực vật người

ta thường dùng một số chất hoá học như HgCl2, Ca(OCl)2, NaOCl, H2O2 Tuỳthuộc vào từng loại mô thực vật mà lựa chọn nồng độ và thời gian xử lý hoáchất thích hợp

Giai đoạn 2: Tái sinh mô nuôi cấy

Trong nhân giống in vitro, mẫu nuôi cấy thường được sử dụng là chồi

hoặc chồi nách của cây mẹ Ngoài ra, tùy từng đối tượng mà người ta còn cóthể dùng các mẫu nuôi cấy là rễ, thân, lá, đài hoa, cánh hoa, Mục đích củagiai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy.Quá trìnhnày được điều khiển chủ yếu dựa vào tỉ lệ các hợp chất auxin, cytokinin ngoạisinh đưa vào môi trường nuôi cấy.Tuy nhiên, cần phải quan tâm đến tuổi sinh

lý của mẫu cấy, thường các mô non chưa phân hóa có khả năng tái sinh cao

Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi

Giai đoạn này được xem là giai đoạn then chốt của quá trình.Để tăng hệ

số nhân người ta thường phải đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạocác chất điều hòa sinh trưởng (Auxin, Cytokinin, Gibberelin), các chất bổsung khác như nước dừa, nước chiết dấm men kết hợp với các yếu tố nhiệt

độ, ánh sáng thích hợp Tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy người ta cóthể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi),hay sự phát triển của chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từphôi vô tính

Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt kích thước nhất định các chồi được chuyển từ môi trường ở giaiđoạn 3 sang môi trường tạo rễ Thường sau từ 2 - 3 tuần, từ những chồi riêng

lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoạn này, người tathường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các Auxin, vì auxin là hoocmon thựcvật quan trọng và có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy Trong nhóm này,các chất IAA, IBA, α-NAA và 2,4-D được sử dụng, nghiên cứu nhiều nhất

Giai đoạn 5: Đưa cây ra đất

Ở giai đoạn này, đưa cây hoàn chỉnh (có đủ thân, rễ, lá) từ ống nghiệm ra

đất là bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định

khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất

Cây lấy ra từ ống nghiệm phải được rửa sạch agar bám trên bề mặt rễ, đểtránh sự xâm nhập của côn trùng và nấm mốc Để đảm bảo cho cây có tỷ lệsống cao thì cần phải đưa cây ra vườn ươm, ươm trên các giá thể thích hợp từ

10 - 15 ngày, lúc này rễ mới sinh ra, lá non bắt đầu hình thành Sau đó chuyểncây ra đất với chế độ chăm sóc bình thường

1.3.3 Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trở

ngại mà những phương pháp nhân giống khác thường gặp, sau đây là những

- Tạo được cây có gen mới (đa bội, đơn bội)

- Bảo quản và lưu trữ tập đoàn gen

- Có khả năng sản xuất quanh năm

- Có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinhthái nhất định hoặc hạt nảy mầm kém.

- Hệ số nhân giống cực cao, rút ngắn thời gian đưa một giống mới vàosản xuất đại trà

1.3.4.Các yếu tố ảnh hưởng tới nuôi cấy mô

1.3.4.1 Mô nuôi cấy

Murashige (1974) đã đưa ra việc lựa chọn mẫu cấy thích hợp và chỉ rahầu hết những cơ quan có thể dùng nuôi cấy mô [19] Điều quan trọng chothấy một số nhân tố khi chọn lọc mẫu bao gồm: Kiểu gen, cơ quan được chọnlọc, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khoẻ của mẫu và nguồnmẫu

- Kiểu gen: Ảnh hưởng sâu sâu sắc tới quá trình nuôi cấy Với loàithuốc lá được sử dụng như kiểu cây mẫu, Cheng và Smith (1973) đã ghi nhận

sự khác nhau giữa genom qua nuôi cấy sinh trưởng mô lá

- Chọn cơ quan: Murashige (1914) cho rằng hầu hết các loại cơ quan và

mô đều có khả năng sử dụng nuôi cấy in vitro Ông cho rằng mẫu nuôi cấy

khác nhau ở các loài khác nhau như ở Petunia dùng chồi đỉnh để nuôi cấy

- Tuổi sinh lý: Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong nămcủa mẫu nuôi cấy cho thấy ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hoá tế bào vàtuổi sinh lý

- Mẫu in vitro: Trong nhiều năm gần đây, nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu in vitro có khả năng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên đồng

ruộng hay trong vườn ươm như cây Azalea (Economou & Read, 1986)

- Sức sống của mẫu: Điều cần thấy rằng mẫu của cây mẹ có ảnh hưởng

quan trọng đến nuôi cấy in vitro Morel (1952, 1955) nuôi cấy đỉnh sinh

trưởng để loại virut sản xuất những cây sạch bệnh và điều này nói lên rằngcần phải cẩn thận chọn lọc mẫu nuôi cấy nhất là đối với những cây bệnh, nếu

nuôi cấy cây bị bệnh thì sẽ tạo ra một số lượng lớn những cây bệnh được nhânlên.

1.3.4.2 Nhiệt độ nuôi cấy

Nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy mô là từ 200C - 270C Theo Murashige

(1974), nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sinh trưởng và phát triển của cây in

vitro qua những quá trình sinh lý như hô hấp hay hình thành tế bào và cơ

quan

13.4.3 Cường độ ánh sáng

Cường độ ánh sáng là nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến nuôi cấy in

vitro cây có lá xanh Ảnh hưởng của ánh sáng có sự liên quan tới các loài, có

loài chịu ánh sáng cao, ánh sáng trung bình và ánh sáng yếu hoặc tối Việcnuôi cấy in vitro tốt nhất trong điều kiện 1000 Lux [2]

1.3.4.4 Môi trường nuôi cấy

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và pháttriển Hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môitrường nuôi cấy

Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp trong nuôi cấy là rất cầnthiết.Về mỗi loại cây trồng khác nhau đều yêu cầu một hàm lượng chất dinhdưỡng khác nhau Mặt khác, môi trường còn thay đổi tuỳ thuộc vào sự phânhoá của mô cấy, tuỳ theo trường hợp duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ,tạo mầm hay tái sinh cây hoàn chỉnh

Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tuỳ theoloài thực vật, loại tế bào, mô và bộ phận nuôi cấy Đối với cùng một loại mô,

bộ phận nhưng mục đích nuôi cấy không giống nhau, môi trường sử dụngcũng khác nhau khá cơ bản, môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạnsinh trưởng và phát triển của mẫu cấy Mặc dù có sự đa dạng về thành phần

và nồng độ các chất nhưng tất cả các loại môi trường nuôi cấy đều bao gồm

các thành phần: các nguyên tố khoáng đa, vi lượng, nguồn cacbon, vitamin vàcác chất điều hòa sinh trưởng thực vật, agar (đối với môi trường rắn) Ngoài

ra, người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định (aminoacid, EDTA…) và một số chất có thành phần không xác định như nướcdừa, dịch chiết nấm men…

1.3.4.5 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Phytohoocmon)

Phytohoocmon là các hợp chất hữu cơ (gồm các sản phẩm thiên nhiêncủa thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo) chúng có tác dụng điều tiếtcác quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật.Tuy nhiên, cácphytohoocmon chỉ làm tăng cường quá trình trao đổi chất mà không tham giatrực tiếp vào quá trình trao đổi chất, nó không thể dùng thay thế chất dinhdưỡng.Tác dụng của chất điều hoà sinh trưởng liên quan đến hiện tượng kìmhãm và cảm ứng tổng hợp enzim trong cơ thể thực vật, hoạt hoá các bộ phậncủa phân tử DNA9 Mỗi chất điều hoà sinh trưởng đều mang chức năng riêng,nhưng trong cơ thể thực vật để điều khiển những hoạt động của thực vật Tuỳvào mỗi giai đoạn nuôi cấy, mỗi giai đoạn phát triển của thực vật thì sự kếthợp của các chất này là khác nhau.Tuy nhiên, trong nuôi cấy mô tế bào, hainhóm chất điều hoà sinh trưởng được sử dụng rộng rãi là cytokinin và auxin

- Auxin:

Auxin có tác dụng chủ yếu là làm tăng thể tích của tế bào, kích thích sựhình thành rễ, kìm hãm sự sinh trưởng của chồi bên, kìm hãm sự rụng hoa,rụng quả Auxin hoạt hoá các hợp chất cao phân tử (Protein, cenllulose,pectin) và ngăn cản sự phân giải chúng.Auxin được xem là hoocmon thực vậtquan trọng nhất vì nó có vai trò cơ bản trong quá trình sinh trưởng và biệt hoá

tế bào cần thiết cho sự phát triển bình thường của cơ thể Trong nuôi cấy sửdụng một số chất như: Indol acetic acid (IAA), Naphthyl acetic acid (NAA),2,4 - D Dichlorophenol acetic acid(2,4- D), Indol butyric acid (IBA)

và auxin thì có kích thích tạo chồi hay tạo rễ, thông thường cytokinin cao hơnauxin sẽ kích thích tạo chồi, và ngược lại auxin cao hơn cytokinin sẽ kíchthích tạo rễ.

Trong cơ thể thực vật, cytokinin có tác dụng rất lớn là tăng cường sựtổng hợp ADN và protein, kích thích quá trình trao đổi chất

1.4 Các nghiên cứu về cây Hoàng tinh hoa đỏ

Y học cổ truyền là một ngành còn tương đối mới, ít có đề tài nghiên cứusâu.Haroon Khan và cộng sự (2012) đã đi sâu phân tích thành phần hóa họccủa các chất có củ, có ý nghĩa lớn đối với ngành y học cổ truyền.Chính vì cógiá trị cao đối với ngành y – dược học nên số lượng chi Polygonatum giảmmột cách đáng kể Tuy nhiên, chỉ có một vài công trình nghiên cứu đề cậpđến vấn đề nhân giống chi Polygonatumnhư Iyyakkannu Sivanesan và cộng

sự [15], Shivani Bisht và cộng sự [20], và chưa thấy công trình nghiên cứu

nào về cây Hoàng tinh hoa đỏ (Polygonatum kingianum Coll et Hemls.).

Vì vậy, đề tài: “Xây dựng quy trình tạo vật liệu khởi đầu và bước đầu tái

sinh chồi invitro cây Hoàng Tinh Hoa Đỏ(Polygonatum kingianum Coll et

Hemls.)” nhằm góp một phần vào việc bảo tồn Hoàng tinh hoa đỏ cũngnhư tạo ra nguồn giống sạch bệnh

Tên thiết bị

Máy PCR System 9700

Máy điện di Powerpac300

Máy soi DNA

Máy cất nước hai lần

Buồng cấy vô trùng

Máy khuấy từ gia nhiệt

Sinh lý học Thực vật - Khoa Sinh - KTNN - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội

2 và Phòng Công nghệ ADN ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu

Mini- transllumminatior, Bio-Rad, MỹMimishaker, IKA, Đức

GM612, Đức FRIGOHM30G/TOA, Đức

HV - 110/HIRAYAMA, Nhật31AG5D, Thái lan

Mỹ

AV - 110/TELSTAR ARE/VELP, Italia CP224S, Đức

STT Tên mồi Ký hiệu

1 RpoC1 P6F

P6R

2 psbA- P10F

Micropipet Jinson Các loại 200 - 1000µl (Pháp)

D

ụ n g c ụ :

Các loại bình tam giác, cốc thủy tinh, ống falcon (loại 50 ml, 15ml, ),ống eppendorf, nút bông, giấy báo, giấy thấm, giấy bạc, túi nilon, dao,khay cấy, panh, kéo,

2.2.3 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm 2 cặp mồi barcode.Trình tự nucleotide của các cặp mồi được trình bầy trong bảng

2.1

Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi nhân bản gen barcode

Trình tự mồi (5’ - 3’)

GTGGATACACTTCTTGATAATGG CCATAAGCATATCTTGAGTTGG GTTATGCATGAACGTAATGCTCP10R CGCGCATGGTGGATTCACAATCC2.2.4 Hóa chất và môi trường nuôi cấy

Hóa chất dùng cho tách chiết DNA tổng số: Nitơ lỏng, CTAB, NaCl,Tris HCl, EDTA, Sorbitol, NaH2PO4, H2O deion, Isopropanol, Ethanol,Chloroform, Isoamyl alcohol, RNase

Kit tinh sạch DNA (AccuPrepGel Purification Kit) của hãng Bioneer(Hàn Quốc)

Hóa chất dùng trong điện di DNA: agarose, TAE 1X (Tris - Acetic acide

- EDTA), ethidium bromide

Môi trường được sử dụng trong nuôi cấy mô là môi trường dinhdưỡng cơ bản (Murashige và Skoog, 1962) [19]: MS + 30g/l đường saccarose+ 7g/l agar + chất điều hòa sinh trưởng

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng: BAP, IAA (mg/l)

Môi trường được điều chỉnh về pH=5,8 ± 0,05 (bằng NaOH 1N và HCl1N) trước khi hấp khử trùng bằng nồi hấp khử trùng ở 117oC, 1atm trong 15phút (đối với các dụng cụ thí nghiệm, dụng cụ thủy tinh không chứa môitrường thì khử trùng ở 121oC, 1atm trong 15 phút).

2.2.5 Điều kiện nuôi cấyin vitro

Các thí nghiệm đều được thực hiện trong điều kiện nhân tạo

Ánh sáng: các mẫu đều được nuôi cấy với cường độ chiếu sáng 3000lux.Quang kì: 12 giờ/ngày

Nhiệt độ phòng: 250C - 270C

Độ ẩm trung bình: 70% - 74%

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thu thập mẫu và nhận dạng loài

2.3.1.1 Nhận dạng loài bằng phương pháp truyền thống:

Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu để xác định loài, tên khoa

học dựa vào các tài liệu phân loại thực

vật

2.3.1.2 Nhận dạng loài bằng phương pháp DNA Barcoding

Xác định hai chỉ thị phân tử của loài bằng phương pháp DNA Barcoding:Mẫu Hoàng Tinh Hoa Đỏ được tiến hành tách chiết và tinh sạch DNA bằngphương pháp CTAB, DNA sau khi tách triết và tinh sạch được điện di kiểmtra trên gel agarose 1% DNA đã tách chiết thành công được sử dụng làm

khuôn cho phản ứng PCR với các cặp mồi là: RpoC1 và TrnH Sản phẩm

PCR được tinh sạch bằng kit AccuPrep Gel Purification Kit và được xác địnhtrình tự tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệsinh học, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam Trình tự DNA