Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng nấm vân chi (trametes versicolor) trên giá thể tổng hợp và một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi trồng (2017)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2KHOA SINH - KTNN ====== NGUYỄN THỊ THUỲ DUNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CHỦNG NẤM VÂN CHI TRAMETES VERSICOLOR TRÊN GIÁ THỂ TỔNG H

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

======

NGUYỄN THỊ THUỲ DUNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CHỦNG NẤM VÂN CHI

(TRAMETES VERSICOLOR) TRÊN GIÁ THỂ

TỔNG HỢP VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG

TỚI QUÁ TRÌNH NUÔI TRỒNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Di truyền

HÀ NỘI - 2017

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Sư phạm Hà Nội II đã tạomọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành đề tài này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Cồ Thị Thùy Vân, người đã

tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện làm đềtài bảo vệ khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị đang công tác bên Trung tâmnghiên cứu và phát triển nấm đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện

Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm nghiên cứu và phát triển nấm –Viện di truyền nông nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tàibảo vệ khoá luận

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo khoa Sinh – KTNNTrường Đại Học Sư Phạm Hà Nội II đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi

để tôi hoàn thiện đề tài này

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, cổ

vũ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Xuân Hòa, tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Thị Thuỳ Dung

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan nội dung trình bày trong khóa luận của tôi là sự thực,các số liệu đều được thu thập, xử lý, thống kê, không trùng với bất kỳ tài liệunào

Đề tài tôi có sử dụng, trích dẫn một số nội dung của một số tác giả khác

để bổ sung hoàn thiện cho bài khóa luận của mình

Tôi xin phép và chân thành cảm ơn!

Xuân Hòa, tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Thị Thuỳ Dung

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

NỘI DUNG 3

Chương I: Tổng quan tài liệu 3

1.1 Sinh học về nấm Vân chi 3

1.1.1 Tên gọi và vị trí phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học 3

1.1.3 Đặc điểm phân bố và điều kiện sinh sống của Vân chi 5

1.1.4 Chu trình sống của Vân chi 5

1.1.5 Đặc tính dược liệu và hoạt chất trong Vân chi 6

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 9

1.2.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 9

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở trong nước 10

1.3 Kỹ thuật nuôi trồng 11

1.3.1 Xử lý nguyên liệu 11

1.3.2 Hấp khử trùng nguyên liệu 12

1.3.3 Cấy giống 13

1.3.4 Ươm bịch và nuôi sợi 14

1.3.5 Chăm sóc - Thu hái 14

Chương II: Đối tượng – phương pháp nghiên cứu 15

2.1 Đối tượng 15

2.2 Nguyên – vật liệu 15

2.2.1 Nguyên liệu 15

2.2.2 Dụng cụ, vật tư 15

2.3 Nội dung nghiên cứu 15

2.4 Phương pháp nghiên cứu 16

2.4.1 Bố trí thí nghiệm 16

2.4.2 Phối trộn nguyên liệu 16

2.4.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn giống đến quá trình hình thành quả thể ở nấm Vân chi 17

2.4.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng độ ẩm cơ chất phối trộn đến sự sinh trưởng (sự mọc sợi) của nấm Vân chi 17

2.4.5 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến sự sinh trưởng và phát triển quả thể của nấm Vân chi .17

2.4.6 Đánh giá một số bệnh phát sinh ở nấm và đưa ra biện pháp khắc phục 17

2.4.7 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 17

Chương III: Kết quả và thảo luận 18

3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn giống đến sự hình thành quả thể của nấm Vân chi 18

3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng độ ẩm cơ chất phối trộn đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Vân chi 19

3.3 Ảnh hưởng của thành phần cơ chất đối với sự phát triển hệ sợi và quả thể của nấm Vân chi 20

3.4 Ảnh hưởng của ánh sáng đối với sự phát triển của quả thể nấm Vân chi 26

3.5 Biện pháp khắc phục các bệnh ở nấm Vân chi 28

3.6 Hiệu quả kinh tế của nấm Vân chi 29

KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

PHỤ LỤC ẢNH 35

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ

Bảng 2.1 Bảng công thức môi trường giá thể 16Bảng 3.1 Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất đến tốc độ phát triển của hệ sợi nấmVân chi và tỷ lệ nhiễm 19Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thành phần cơ chất phối trộn đến sự sinh trưởng,phát triển của hệ sợi nấm Vân chi 20Bảng 3.3 Sự phát triển hệ sợi của nấm Vân chi trên các công thức môi trườngkhác nhau (cm) 22Biểu đồ 3.1 Sự phát triển hệ sợi của hệ sợi nấm Vân chi trên các công thứcmôi trường khác nhau 22Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thành phần cơ chất phối trộn đến kích thước quả thểcủa nấm Vân chi 24Bảng 3.5 Khối lượng của nấm Vân chi trên các công thức môt trường khácnhau ở hai đợt thu hái 24Bảng 3.6 Ảnh hưởng của thành phần cơ chất phối trộn đến năng suất nấm Vânchi 25Bảng 3.7 Ảnh hưởng của ánh sáng đến sự phát triển quả thể ở nấm Vân chi

……….27Bảng 3.8 Hoạch toán đầu vào trong sản xuất Vân chi trên 1 tấn nguyên liệu 30Bảng 3.9 Hiệu quả kinh tế thu được khi nuôi trồng nấm Vân chi 30

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Một số hình ảnh về nấm Vân chi (Trametes versicolor) 4Hình 1.2: Chu trình phát triển của nấm Vân chi (Trametes versicolor)5Hình 1.3: Một số hình ảnh sản phẩm triết xuất từ nấm Vân chi(Trametes versicolor) 11Hình 3.1: Ảnh hưởng của nguồn giống đến sự hình thành quả thể củanấm Vân chi (Trametes versicolor) 18Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thành phần cơ chất phối trộn đến sự sinhtrưởng, phát triển của hệ sợi nấm Vân chi 20Hình 3.2 Quá trình phát triển hệ sợi của nấm Vân chi 21Hình 3.3 Nấm Vân chi (Trametes versicolor) trên các môi trường giáthể khác nhau 23Hình 3.4 Hình ảnh nấm Vân chi sau khi thu hoạch 25Hình 3.5 Ảnh hưởng của ánh sáng đến sự phát triển quả thể ở nấmVân chi (Trametes versicolor) 27Hình 3.6 Một số bệnh ở nấm Vân chi trong giai đoạn ươm sợi 28Hình 3.7 Một số bệnh ở nấm Vân chi trong giai đoạn quả thể 28

CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

STT Tên viết tắt Tên Tiếng Việt

Krestin

3 Tra Trametes versicolor

Nấm Vân chi (Trametes versicolor) là một loại nấm dược liệu quý đang

được chú trọn nghiên cứu ở một số quốc gia như: Trung Quốc, Hàn Quốc,Việt Nam…và đang được nuôi trồng chủ động

Tác dụng của Nấm Vân Chi được ghi chép trong sách thuốc đông y từ

thế kỉ XV, Minh Y Biệt lục đã ghi nhận: “Vân Chi màu lục và màu đen bổ

dưỡng Thần-Khí, bồi bổ gân cốt… Uống liên tục giúp cơ thể dẻo dai và tăng thêm tuổi thọ”.

Vân chi là loại nấm quý đã được sử dụng tại Trung Quốc cách đây trên

2000 năm và vẫn còn được ưa chuộng đến tận ngày nay không chỉ vì giá trịdinh dưỡng cao mà còn bởi giá trị dược liệu của nó

Nhờ những tác dụng dược lý của nấm Vân chi mà hàng loạt các chếphẩm sản xuất từ nấm Vân chi ra đời và được sử dụng rộng rãi trong y học vàcuộc sống

Các chế phẩm sản xuất từ nấm Vân chi không chỉ giúp tăng khả năngmiễn dịch của cơ thể, chống lão hoá, hạ đường huyết, khử độc hữu cơ tự do,giải độc tố gan… mà còn phòng trị các bệnh tim - mạch

Đặc biệt là khả năng phòng chống khối u, ức chế tế bào ung thư Khoahọc hiện đại đã tìm ra trong nấm Vân chi có hợp chất đường PSK(polysaccharopeptid loại Krestin) được tách chiết lần đầu vào cuối thế kỷ 60tại Nhật Bản và loại đạm – đa đường PSP (polysaccharopeptid PSP) đượcphân lập tại Trung Quốc năm 1983

Hai chất này có tác dụng ức chế tế bào ung thư và nâng cao hoạt tínhmiễn dịch của cơ thể Người ta sử dụng nấm Vân chi để chữa bệnh viêm gan

do virut HBV và hạn chế quá trình phát triển của bệnh ung thư

Việt Nam là một nước có tiềm năng sản xuất nấm do hội tụ đủ các điềukiện thuận lợi để phát triển nghề trồng nấm: khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùathuận lợi cho nấm sinh trưởng và phát triển, nguồn nguyên liệu đa dạng,phong phú như: rơm, bông phế liệu, bã mía, bã dong giềng, mùn cưa… và lựclượng lao động dồi dào

Đồng thời, trồng nấm tốn ít diện tích, xoay vòng vốn nhanh mà lại đemlại hiệu quả kinh tế cao hơn thế nữa còn có thể tận dụng nguồn nguyên liệu từtrong sản xuất và đời sống như: bông công nghiệp, mùn cưa, bã dong giềng,lõi ngô… giúp xử lý phế thải công nghiệp, tăng hiệu quả kinh tế, góp phầnkhông nhỏ trong công cuộc bảo vệ môi trường Xuất phát từ những giá trịdược liệu và kinh tế của nấm Vân chi mang lại và ý nghĩa trong công cuộc cảithiện môi trường, chúng tôi quyết định:

“Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng nấm

Vân chi (Trametes versicolor) trên giá thể tổng hợp và một số yếu tố ảnh

hưởng tới quá trình nuôi trồng”.

2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

- Tìm hiểu đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng Vân

chi (Trametes versicolor) trên cơ chất tổng hợp.

- Xác định một số yếu tố ảnh hưởng quá trình nuôi trồng nấm Vân chi

(Trametes versicolor) trên cơ chất tổng hợp.

+ Cung cấp số liệu, thông tin khoa học cho công tác nghiên cứu về nuôi

trồng và chọn tạo giống nấm Vân chi (Trametes versicolor).

+ Trên cơ sở nuôi trồng trong một số công thức môi trường khác nhau

và điều kiện khác nhau, tiến hành xác định điều kiện nuôi trồng thích hợpnhất trong từng giai đoạn phát triển, góp phần củng cố quy trình công nghệ

nuôi trồng nấm Vân chi (Trametes versicolor).

- Ý nghĩa thực tiễn

+ Góp phần làm đa dạng công thức môi trường cho công nghệ sản xuất

nấm Vân chi (Trametes versicolor).

+ Góp phần trồng nấm hiệu quả hơn, tăng chất lượng nấm, tận dụngnhững phế liệu trong đời sống, sản xuất để nuôi trồng nấm tạo nguồn thựcphẩm giàu giá trị dinh dưỡng có giá trị dược liệu và đem lại hiệu quả kinh tếcao

5 DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

- Báo cáo thống kê số liệu nghiên cứu

- Báo cáo kết quả khóa luận

NỘI DUNG Chương I: Tổng quan tài liệu 1.1 Sinh học về nấm Vân chi

1.1.1 Tên gọi và vị trí phân loại

Trametes versicolor (Fr) Pilat Atl Champ Eur 3: 261, Ryvarden &

Johansen, Apreliminary polypore flora of East Africa, 588, 1980;Breitenbach, F Kranzlin, Pilze der Schweiz, Band 2, 288,1986 [4]

Nấm Vân chi có tên khoa học là Trametes versicolor, ở các quốc gia

khác nhau chúng có nhiều tên gọi khác nhau Trong tiếng anh có tên gọi là

“Turkey tail” (đuôi gà tây) Người Trung Quốc gọi là “Yunzhi” có nghĩa lànhư mây do hình dạng của nó Người Nhật Bản lại gọi là “Karawatake” cónghĩa là gần sông do người ta thường tìm thấy chúng ở những nơi gần bờsông

Nấm Vân chi (Trametes versicolor) gây hoại sinh cây bệnh, mọc trên

gỗ mục, thành từng đám lớn, gặp khắp nơi Vân chi là nấm gây mục trắngmạnh, có thể phá vỡ cấu tạo gỗ (hemicellulose, cellulose, lignin) Ở Việt Namthường gặp ở Sapa, Tam Đảo, Ba Vì, Bạch Mã…

Hiện nay, nấm Vân chi (Trametes versicolor) được nghiên cứu ở một

số quốc gia như: Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản…

Ở Việt Nam nấm Vân chi được nuôi trồng chủ động

Vị trí phân loại nấm Vân chi:

Giới nấm: Fungi Ngành: Eumycota Lớp: Basidiomycetes Phân lớp: Holobasidiomycetidae Nhóm: Hymenomycetes

Bộ: Aphyllophorales Họ: Polyporaceae Chi: Trametes Loài: Trametes versicolor

1.1.2 Đặc điểm sinh học

1.1.2.1 Đặc điểm hình thái

Vân chi là loại nấm hàng năm, không cuống, phát triển một bên

Quả thể nấm là chất da, không cuống, phủ lông, rất biến đổi về màu

Đảm quả khi còn non có dạng nhiều u lồi tròn, sau phân hoá thànhdạng bán cầu, già bán cầu đến dạng thận, dạng quạt, thót dần lại ở phần gốchay cũng có khi trải sát giá thể hay trải cuộn lại thành dạng vành với mép tánmàu trắng – trắng kem

Nấm trưởng thành có dạng quả giả, chất đa hoá gỗ.

Nấm thường mọc thành đám dạng ngói lập

Mũ nấm mỏng, phẳng hoặc hơi quăn hình bán nguyệt mọc thành từngcụm Mặt mũ thay đổi về màu sắc, đặc trưng bởi những vòng đồng tâm vớimàu sắc khác nhau, phủ lông tạo thành từng vòng xen kẽ (các phiến nấm xen

kẽ nhau giống hình đuôi gà ây đang xoè hay một cụm mây) với vùng vỏ mũcòn nhẵn

Mặt dưới trắng có mang những bào tử nhỏ Mép mũ nhẵn, màu sánghơn, lượn sóng ít hay nhiều

Thịt nấm mỏng, màu trắng, chất bì dai gồm nhiều sợi dày 0,5 – 1 (2)

mm [4]

a b

Hình 1.1: Một số hình ảnh về nấm Vân chi (Trametes versicolor)

a: Vân chi trong tự nhiên b: Vân chi nuôi trồng trong phòng thí nghiệm

(Nguồn: Internet) 1.1.2.2 Đảm bào tử

Đảm nấm có kích thước 10 – 15 x 4 - 5 µm

Bảo tử đảm không màu, nhẵn, hình trụ hơi thắt một đầu và cong (hìnhquả dưa gang); kích thước 1,5 – 2 (2,5) x 4 – 6 (7) µm [4]

1.1.3 Đặc điểm phân bố và điều kiện sinh sống của Vân chi

Nấm Vân chi thường xuất hiện ở vùng ôn đới tại Bắc bán cầu như:vùng ôn đới Bắc Mỹ, ở Châu Âu và Châu Á

Ở Việt Nam, nấm Vân chi thường được tìm thấy nhiều vào mùa mưa Vân chi là loại nấm phá gỗ, mọc hoang, phát triển mạnh, thường mọctrên các cây thân gỗ đã chết hoặc khô như sồi, liều, long lão

Vân chi thích hợp nơi nhiều mưa, độ ẩm cao, gần bờ sông suối…

1.1.4 Chu trình sống của Vân chi

Hình 1.2 Chu trình phát triển của nấm đảm

(Nguồn: Internet)

Nấm Vân chi thuộc nấm đảm (Baisidiomycetes)

Chu kì sống bắt đầu từ khi quả thể hình thành, phóng thích bào tử vàotrong không khí và được phát tán nhờ gió

Gặp điều kiện thuận lợi (nhiệt độ, độ ẩm thích hợp), bào tử đảm sẽ nảymầm và hình thành sợi nấm sơ cấp không có khả năng hình thành quả thể

Hệ sợi sơ cấp kết hợp ngẫu nhiên hình thành hệ nấm song hạch có khảnăng hình thành quả thể

Hệ sợi nấm song hạch chiếm hầu hết chu kì sống của nấm đảm

Ở giai đoạn sinh dưỡng, hệ sợi nấm sẽ hấp thụ và tích lũy dinh dưỡng

để chuẩn bị hình thành quả thể

Khi môi trường thuận lợi (nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm dinh dưỡng thíchhợp ) quả thể sẽ tăng kích thước rất nhanh để thành quả thể

Quả thể tiếp tục phát triển trở thành quả thể trưởng thành

Quả thể trưởng thành sẽ phát tán bào tử tiếp tục một chu kì sống mới

1.1.5 Đặc tính dược liệu và hoạt chất trong Vân chi

để điều trị nhiều bệnh hiểm nghèo [5, 9]:

- Ức chế tế bào ung thư:

Khoa học hiện đại đã tìm ra trong nấm Vân chi (Tra) có hợp chất đa

đường PSK polysaccharopeptid loại Krestin và loại đạm – đa đường PSP(polysaccharopeptid PSP)

Hai chất này có tác dụng ức chế tế bào ung thư và nâng cao hoạt tínhmiễn dịch cửa cơ thể

Người ta sử dụng nấm Vân chi để hạn chế quá trình phát triển của bệnhung thư

- Tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể:

Các polysaccharide trong nấm Vân chi (Tra) có khả năng hoạt hóa

miễn dịch tế bào, thúc đẩy quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bàolympho, kích hoạt tế bào lympho T và lympho B

Các polysaccharide trong nấm Vân chi bền với nhiệt độ cao và ánhsáng, tồn tại lâu trong cơ thể và không gây tác dụng phụ

- Phòng tránh và điều trị các bệnh tim mạch:

Nấm Vân chi có tác dụng điều tiết công năng tim mạch, làm tăng lưulượng máu động mạch vành, hạ thấp oxy tiêu thụ và cải thiện tình trạng thiếumáu cơ tim

Nấm Vân chi còn có tác dụng điều chỉnh rối loạn lipit máu, làm hạlượng cholesterol, triglycerid và beta-lipoprotein trong huyết thanh, làm hạhuyết áp

- Hạ đường máu và chống phóng xạ

Nấm Vân chi có tác dụng làm hạ đường máu, điều chỉnh đường trongmáu, các polysaccharide trong nấm còn có tác dụng chống phóng xạ

- Loại trừ các gốc tự do và chống lão hóa

Gốc tự do là các sản phẩm có hại của quá trình chuyển hóa tế bào.Vân chi có tác dụng thanh trừ các sản phẩm này, làm giảm chất mỡtrong cơ thể, từ đó có khả năng làm chậm quá trình lão hóa và kéo dài tuổithọ

1.1.5.2 Một số hoạt chất trong nấm Vân chi

Trong thành phần nấm Vân chi có acid hữu cơ, alkaloid, triterpenoid,coumarin, saponin, tannin, polyphenol, acid amin và polysaccharide…

Trong đó, polysaccharide là thành phần dược tính được quan tâm vànghiên cứu nhiều nhất

Ngoài ra, nấm Vân chi còn chứa nhiều enzym như: SOD, cytochromeP-450… Các enzym này là thành phần quan trọng trong quá trình khử độc tốxâm nhập vào tế bào, chống quá trình đông tụ màu…

Bảng 1.1 Một số thành phần dược tính triết xuất từ nấm Vân chi

Ghi chú: +: dương tính -: âm tính

Trong nấm Vân chi (Trametes versicolor) có các acid amin chủ yếu

như: glutamic, aspartic và một số acid amin dạng trung hoà

Các proteoglycan trong nấm là những chuỗi polypeptide hay nhữngphân tử protein nhỏ gắn kết chặt với các chuỗi polysaccharide β-D-glucan.Cấu trúc β-D-glucan là một cấu trúc lập lại, gồm nhiều phân tử D-glucosenối với nhau bằng các nối β tạo dạng mạch thẳng Các nối β được tạo từ vị tríC1 của vòng saccharide đứng trước với vị trí C3 của vòng kế tiếp (β1-3), từC1 đến C4 (β1-4), hoặc từ C1 đến C6 (β1-6)

Hầu hết các proteoglycan thường có một chuối chính, hoặc là chuỗiβ1-3, chuỗi β1-4 hoặc kết hợp hai chuỗi β1-3, β1-4 với một chuỗi phụ β1-6[1,9,13].

Polysaccharide được tìm thấy trong các vách tế bào không tiêu hoáđược của Vân chi có cấu trúc 3 chiều với các chuỗi bên (chuỗi đường mạchthẳng) mọc nhánh xung quanh cấu trúc trục chính (lõi protein haypolypeptide), các chuỗi bên có chức năng sinh học hay hoạt tính miễn dịchcho phép sự tương tác giữa các chuỗi nhánh bên với các thụ thể trên các tếbào miễn dịch khác nhau

Thụ thể cho β-glucan được tìm thấy trên nhiều tế bào khác nhau: Tếbào tự sát thương, tế bào bạch cầu trung tính, tế bào bạch cầu đơn nhân to, đạithực bào và tế bào lympho B, lympho T

Đặc biệt, khoa học hiện đại đã tìm ra trong nấm Vân chi có hợp chất đađường PSK (polysaccharopeptid loại Krestin) được tách chiết lần đầu vàocuối thế kỷ 60 tại Nhật Bản và loại đạm – đa đường PSP (polysaccharopeptidPSP) được phân lập tại Trung Quốc năm 1983

Hai chất này có tác dụng ức chế tế bào ung thư và nâng cao hoạt tínhmiễn dịch cửa cơ thể

Người ta sử dụng nấm Vân chi để chữa bệnh viêm gan do virut HBV

và hạn chế quá trình phát triển của bệnh ung thư

a PSK (polysaccharide - Krestin)

Đường PSK (polysaccharopeptid loại Krestin) được tách chiết lần đầuvào cuối thế kỷ 60 tại Nhật Bản.PSK được ly trích từ chủng Vân chi CM-101bằng nước và bằng phương pháp muối hoá PSK có trọng lượng phân tửkhoảng 94 – 100 kDa

Trong thành phần cấu tạo gồm 62% polysaccharide và 38% protein.Thành phần glucan gồm có một chuỗi chính β1-4 và các chuỗi phụ β1-

3, β1-6 liên kết nhau bằng các nối O-glycosidic hay N- glycosidic

Phần peptide rất giàu các acid amin như aspartic, glutamic và một sốacid amin acid khác Phần polysaccharide gồm các monosaccharide: glucose,galactose, mannose, xylose, fucose

Các nghiên cứu với PSK được đánh dấu phóng xạ C14 đã xác nhậnrằng phổ nguyên tử của nó được hấp thụ trong 24h sau khi đưa vào cơ thểchuột PSK không độc, liều LD50 thấp và không xuất hiện các dị hình trongcác thử nghiệm độc tính cấp và bán cấp

Các nghiên cứu trên động vật xác nhận thêm rằng PSK cảm ứng tế bào

T diệt và phục hồi lại các thông số miễn dịch bị suy yếu trong khi đó sẽ ứcchế các hợp chất gây ức chế miễn dịch

PSK ngăn chặn các phản ứng phụ khi dùng kết hợp với các tác nhânhoá trị như 5-FU (5-fluorouracil), doxorubicin, cyclophosphamide (CPA),tegafur, cis-Blastin và mitomycin-C (MMC) để chữa trị ung thư, gia tăng khả

năng sống còn của các bệnh nhân ung thư dạ dày ở các giai đoạn III và IV(Kaibara et al, 1970) [1,9].

PSK gia tăng khả năng sống còn, ức chế sự hình thành và di căn củacác tác nhân gây ung thư hoặc các khối u tạo ra do phóng xạ PSK cũng ứcchế sự phát triển trở lại sau hậu phẫu hoặc sự di căn các tế bào khối u ở cácmẫu động vật thí nghiệm, cơ chế có lẽ là ngăn chặn sự di chuyển, sự xâmnhập, sự gắn kết với các tế bào màng trong và sự phát triển

b Đạm – đa đường PSP (polysaccharopeptid PSP)

PSP được phân lập tại Trung Quốc năm 1983.Trong thành phần cấu tạo

có khoảng 90% polysaccharide và 10% peptide PSP có trọng lượng phân tửkhoảng 100 kDa

Thành phần chuỗi polypeptide có trong PSP tương tự như trong chuỗiproteoglycan PSK, rất giàu aspartic acid và glutamic acid

Tuy nhiên PSP khác PSK về thành phần các đường đơn trong chuỗipolysaccharide, PSP thiếu fucose nhưng lại có arabinose vàrhamnose

PSP có khả năng tăng cường hệ miễn dịch bằng cách tăng cường tínhđặc hiệu của tế bào T và của các tế bào kháng nguyên như bạch cầu đơn nhân

và đại thực bào Hoạt tính sinh học được thể hiện ở khả năng làm tăng sốlượng bạch cầu, khả năng sản xuất IFN-γ và IL-2 va làm trì hoãn các phảnứng quá mẫn

Đã có rất nhiều nghiên cứu chỉ ra khả năng hoạt hóa tế bào và các thànhphần thể dịch của hệ thống miễn dịch của vật chủ của PSK và PSP Ngoài ra

cả hai chất này còn có tác dụng kìm hãm sự phát triển của các dòng tế bàoung thư và có hoạt tính chống ung thư ở mức độ in vivo

Điều đáng ghi nhận là vào năm 1987, chỉ riêng lượng PSK đã chiếm tới25% tổng số dược liệu được sử dụng để chống lại bệnh ung thư ở Nhật bản

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.2.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

Kể từ khi phát hiện ra hợp chất PSP và PSK trong nấm Vân chi, đã cónhiều nghiên cứu, thử nghiệm về đặc tính dược liệu của nấm Vân chi đến nay

đã có rất nhiều tiến bộ đáng kể trong các thử nghiệm lâm sàng trên cơ thể conngười

Đầu những năm 1970 nhóm nghiên cứu của Kaibara đã tiến hành thửnghiệm dùng PSK để điều trị cho bệnh nhân bị ung thư ở giai đoạn 4 songsong với phương pháp hóa trị liệu Sau khi được phẫu thuật cắt bỏ phần ungthư, bên cạnh chế độ hóa trị liệu Mitomycin C và 5-fluorouracil (5-FU) 66bệnh nhân được điều trị bổ sung 3g PSK mỗi ngày

Tỉ lệ sống của các bệnh nhân này trong 2 năm là tăng gấp đôi so vớicác bệnh nhân không được điều trị bằng PSK

NGUYỄN THỊ THUỲ

Ở Nhật Bản, từ năm 1970, PSK từ n ấ m V â n c hi đã được chứng minh cókhả năng kéo dài thời gian sống thêm 5 năm hoặc hơn cho các bệnh nhân ungthư thuộc nhiều thể loại: ung thư dạ dày, ung thư đại tràng, ung thư vòmhọng, ung thư thực quản, ung thư phổi và ung thư vú (P.M.Kidd, 2000)

Nghiên cứu thực hiện bởi Tsang và cộng sự trên 34 bệnh nhân ung thưphổi giai đoạn tiến triển cho kết quả là sau 28 ngày điều trị bằng PSP, sốlượng tế bào máu, hàm lượng các kháng thể của những người được điều trịđều tăng cao hơn so với những người không được điều trị (K.W.Tsang et al.,2003)

Đặc biệt ở những người được điều trị, sự tiến triển của bệnh đã đượclàm chậm lại một cách đáng kể

Kết quả nghiên cứu do nhóm của tiến sỹ Kenyon ở trung tâm nghiêncứu điều trị lâm sàng Dove (Winchester, London) trên 30 bệnh nhân ung thưthuộc nhiều dạng khác nhau chỉ ra rằng điều trị bằng bột nghiền từ sinhkhối nấm Vân chi làm giảm mạnh mẽ hoạt tính của enzym telomerase (mộtenzym thiết yếu giúp các tế bào ung thư chống lại quá trình “tự chết”), đồngthời tăng cường đáng kể các phản ứng miễn dịch chống lại các khối u

Gần đây có nhiều nghiên cứu về việc dùng chất PSK cùng với các chế

độ như hóa trị liệu, xạ trị liệu và miễn dịch trị liệu để cải thiện tỉ lệ sống củacác bệnh nhân bị ung thư thực quản và ung thư mũi-hầu, Công ty Sankyo,Kureha tại Nhật Bản đã đưa ra trên thị trường sản phẩm Krestin từ năm 1977với giá 1000 Yên cho một gói 1g

Thuốc có tác dụng điều trị các loại ung thư đường tiêu hóa, ung thưphổi và ung thư vú

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở trong nước

Trong những nâm gần đây, Việt Nam đã bắt đầu đi sâu vào nghiên cứuđặc điểm sinh học, công nghệ nhân giống và nuôi trồng, đặc tính dược liệucủa nấm Vân chi Có rất nhiều công trình nghiên cứu mang ý nghĩa quantrọng phải kể đến như:

- Nghiên cứu đặc điểm sinh học và công nghệ nhân giống, nuôi trồng

nấm Sò vua (Pleurotus eryngii) và nấm Vân chi (Trametes versicolor) ở Việt

Nam của Nguyễn Thị Bích Thuỳ

- Nghiên cứu nhân giống nấm Vân chi (Trametes versicolor) dạng dịch

thể của Nguyễn Thị Bích Thuỳ, Cồ Thuỳ Vân, Đinh Xuân Linh, Trịnh TamKiệt, Nguyễn Trung Thành (2013)

- Nghiên cứu của Nguyễn Lân Dũng…

Từ các kết quả nghiên cứu trong nước và ngoài nước, dược tính củanấm Vân chi đã được áp dụng trong y học tạo ra nhiều sản phẩm quan trọng

NGUYỄN THỊ THUỲ

Hình 1.3 Một số hình ảnh sản phẩm triết xuất từ nấm Vân chi (Trametes

- Kỹ thuật nuôi trồng nấm Vân chi trải qua các bước:

Bước 1: Xử lý nguyên liệu

Bước 2: Hấp thanh trùng nguyên liệu

Bước 3: Cấy giống

Bước 4: Nuôi sợi

Bước 5: Chăm sóc, thu hái

1.3.1 Xử lý nguyên liệu

- Xử lý nguyên liệu bông phế loại

Bông để ủ nguyên liệu không bị mốc và chưa bị xử lý bằng hoá chất Ngâm bông hạt trong nước vôi trong (pH = 12 – 13), vớt bông vắt bớtnước và ủ đống, có kệ kê đáy Đống ủ rộng 1,5 – 1,8m; cao 1,5 – 1,8m; dài tốithiểu 1,5m; quây nilon xung quanh, để hở đỉnh

Ủ được 3 – 4 ngày dùng tay xé tơi bông và ủ lại 3 – 4 ngày nữa, sau đóđảo đều trước khi phối trộn với các thành phần khác

NGUYỄN THỊ THUỲ

- Xử lý nguyên liệu mùn cưa

Mùn cưa mới có thể dùng ngay nếu dùng dần phải phơi khô đóng baohoặc trộn ủ bảo quản chống mốc, chống mùn hóa làm mất dinh dưỡng

Đổ mùn cưa ra nền sạch, sau đó dùng bình ô doa tưới đều nước vôitrong (pH = 12 – 13) lên mùn cưa, vừa tưới, vừa đảo

Sau khi tưới đủ nước, dùng xẻng đảo đều từ 3 - 4 lần rồi ủ thành đống,che đậy bằng nilon để mùn cưa ngấm đủ nước và trương nở tế bào gỗ

- Xử lý nguyên liệu lõi ngô

Lõi ngô để nuôi trồng nấm Vân chi phải là lõi ngô không bị mốc hoặc

đã bị xử lý qua hóa chất Lõi ngô trước khi ủ nguyên liệu phải được say mịn,tránh vón cục

Tạo ẩm mùn cưa bằng nước vôi trong (pH = 12 – 13) cho đến khi độ

ẩm đạt

66 – 70%

Sau khi tạo ẩm, dùng xẻng đảo đều từ 3 - 4 lần rồi ủ thành đống, cheđậy bằng nilon

- Phối trộn nguyên liệu

Trước khi phối trộn nguyên liệu ta phải kiểm tra xem cơ chất bằngcách dùng tay nắm nguyên liệu lại, thấy không bị vỡ ra, đồng thời không bị rỉnước ở kẽ tay là được

Nếu đống ủ quá khô thì ta tạo ẩm lại bằng nước vôi trong (pH = 12 –13) rồi ủ lại 2 tới 3 ngày Nếu đống ủ quá ướt thì ta mang đi phơi

Dùng xẻng phối trộn bông, mùn cưa và các phụ gia gồm cám gạo, cámngô (để bột nhẹ khỏi bị vón cục), đường kính, bột nhẹ, đảo đi đảo lại 3 – 4lần

- Đóng bịch nguyên liệu

Nguyên liệu đã phối trộn ở trên

Túi nilon chịu nhiệt có kích thước 25 x 35 cm, cổ nút, chun vòng, bôngnút, nắp đậy Đóng nguyên liệu vào túi nilon chịu nhiệt

Túi nilon dầy thì chỉ cần một túi Nếu túi mỏng thì phải lồng hai túi vàonhau để tránh khỏi bị thủng túi

Đáy túi phải phẳng tròn, đặt xuống không bị đổ Xung quanh túi phẳng,không tạo nếp gấp, bề mặt túi hơi khum lên để khi cấy giống sẽ dàn đều bốnxung quanh

Trọng lượng mỗi túi khoảng 1,4 - 1,5 kg

Khi đóng túi xong ta làm cổ nút, làm nút bông, đậy nắp và chuyển vào

lò hấp khử trùng

1.3.2 Hấp khử trùng nguyên liệu

Sau khi đóng túi phải hấp khử trùng

NGUYỄN THỊ THUỲ

Nếu có nồi áp suất (autoclave) hấp khử trùng ở áp suất 1,3 – 1,4 atm,nhiệt độ 1210C trong thời gian 180 phút tính từ khi đạt áp suất

Để triển khai sản xuất trên diện rộng, rẻ tiền vẫn có hiệu quả, ta dùngphương pháp hấp trong hơi nước bão hòa, thời gian từ 9 – 10 giờ trong lò hấpxây bằng gạch thường, hoặc lò bằng sắt có các giỏ hấp để túi nấm thẩm thấunhiệt đều từ trong ra ngoài

Mỗi mẻ hấp có thể hấp được từ 120 - 150 bịch, tùy theo thể tích củabuồng hấp nhỏ hay lớn

Nguyên liệu đóng túi xong được đưa vào khử trùng càng nhanh càngtốt trong thời gian từ 4 – 8 giờ để tránh môi trường bị chua

1.3.3 Cấy giống

Sau khi khử trùng xong chuyển bịch vào nhà cấy giống, để nguội tớinhiệt độ phòng thì mới được cấy giống

- Chuẩn bị phòng cấy, dụng cụ cấy và giống nấm

Trước khi cấy giống ta cần chuẩn bị:

+ Giống: trước khi cấy giống vào bịch nuôi sợi ta phải tiến hành chọngiống theo đúng yêu cầu kỹ thuật, giống Vân chi trên hạt, có màu trắng đụcđồng nhất, sợi mượt, giống không bị nhiễm mốc, không có mùi chua, có mùiđặc trưng của giống, giống không quá già hoặc quá non, giống được sử dụng

là giống nấm cấp 2 hoặc cấp 3

+ Phòng cấy phải sạch sẽ, kín gió

+ Trước khi cấy phải thanh trùng phòng bằng cách phun foocmol(0,5%) xung quanh phòng hoặc đốt lưu huỳnh rồi đóng kín cửa từ 12 - 24 giờ

+ Mở cửa để hết mùi mới được vào cấy

+ Dụng cụ cấy gồm: tủ cấy vô trùng, que cấy, đèn cồn, khay đựng, lọđựng cồn, bông thấm cồn để vệ sinh và báo cắt thành miếng hình vuông 10 x

10 cm để bọc đầu sau khi cấy

+ Thao tác cấy

Sau khi đã chuẩn bị đầy đủ, ta tiến hành cấy giống theo các bước sau: Bước 1: Dùng bông có tẩm cồn vệ sinh lau sạch chai giống, dụng cụcấy và xung quanh tủ cấy

Bước 2: Đốt kỹ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn

Bước 3: Để nguội que cấy, mở nút chai giống từ từ trên ngọn lửa đèncồn, kều bỏ lớp giống cũ trên bề mặt chai giống

Bước 4: Mở túi nguyên liệu từ từ dưới ngọn lửa đèn cồn

Bước 5: Dùng que cấy kều giống từ chai giống sang bịch nguyên liệu,lắc đều để hạt giống phân bố đều trên bề mặt bịch

NGUYỄN THỊ THUỲ

Chú ý: Khi cấy chai giống luôn phải đặt nằm ngang, gần đèn cồn vớibán kính 20 cm Trong khi cấy bịch đang cấy phải nằm nghiêng để tránh hiệntượng có những sợi nấm dại từ trên rơi vào trong bịch nấm

Sau khi cấy xong đậy nút bông, bọc đầu bằng báo, ghi rõ mỗi côngthức, tên giống cấy, ngày cấy và vận chuyển vào nhà ươm

1.3.4 Ươm bịch và nuôi sợi

Các túi cơ chất đã cấy giống xong chuyển vào nhà ươm

Nhà ươm bịch phải đảm bảo:

Phòng sạch sẽ, thoáng mát, có cửa ra vào và lối đi giữa các giàn rộng

để tiện vận chuyển; giàn giá nên có nhiều tầng để tăng diện tích, mỗi giàn nên

có 5 - 7 tầng, mỗi tầng cách nhau 50 - 60cm Diện tích phòng phụ thuộc vàodiện tích đất sử dụng

Độ ẩm nhà ươm là một trong yếu tố quan trọng để sợi nấm phát triển Nhiệt độ là yếu tố hàng đầu chi phối sự phát triển của sợi nấm Vì thếtrong thời gian nuôi sợi càng ít biến động về nhiệt độ càng tốt

Bịch nấm được chuyển nhẹ nhàng lên giàn giá, miệng túi phía trên,giữa các giàn có lối đi để kiểm tra

Trong quá trình ươm bịch không cần tưới nước, hạn chế tối đa việc dichuyển (nếu vận chuyển nhiều sợi nấm dễ bị tổn thương)

Trong thời gian này cần phải kiểm tra loại bỏ bịch nhiễm, nếu pháthiện thấy nhiễm cần loại bỏ ngay ra khỏi khu vực nuôi để tránh lây lan sangbịch khác

Sau 35 – 40 ngày sợi phát triển ăn kín đáy túi ta chuyển sang giai đoạnchăm sóc, thu hái

1.3.5 Chăm sóc - Thu hái

Thường xuyên tưới nước bổ sung độ ẩm Theo dõi loại bỏ bịch bịnhiễm

Khi nấm trưởng thành, đạt kích thước nhất định thu hái

Sau khi hái hết đợt đầu xong, ngừng tưới nước 3 – 4 ngày, buộc lại cổnút, thay bông để nấm ra đợt 2

Quá trình chăm sóc thu hái như đợt 1

Chú ý: Thu hoạch cần đúng tuổi thì mới đảm bảo về năng suất và chất

lượng của sản phẩm Nếu thu hoạch sớm quá sẽ làm giảm năng suất nấm cònthu muộn quá sẽ làm giảm giá trị của sản phẩm

NGUYỄN THỊ THUỲ

Chương II: Đối tượng – phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng

Hai chủng Vân chi có nguồn gốc từ Trung Quốc và Hàn Quốc được sửdụng trong nghiên cứu, được lấy từ quỹ gen thuộc Viện di truyềnnông nghiệp

2.2 Nguyên – vật liệu

2.2.1 Nguyên liệu

- Mùn cưa: không mốc, phải là gỗ của cây không có tinh dầu, của cây

gỗ cứng, không dính dầu máy, chưa xử lý qua hoá chất Tốt nhất là mùn cưacao su và bồ đề

- Lõi ngô: lõi ngô không bị mốc, chưa xử lý qua hoá chất, được nghiền

- Cám gạo: nghiền mịn thật nhỏ, còn nguyên mùi thơm của cám,

không mốc, không lẫn hạt to

- Bột nhẹ (CaCO3)

- Nước vôi trong (pH = 12 – 13)

Chú ý: phải sử dụng nguồn nước sạch

- Dụng cụ tưới: bình phun sương mù

- Dụng cụ cấy giống: tủ cấy vô trùng, que cấy, đèn cồn, khay đựng và báo cắt thành miếng hình vuông 10 x 10 cm để bọc đầu sau khi cấy

- Dụng cụ đo: nhiệt kế, giấy đo pH

- Một số dụng cụ khác: cân, xẻng, găng tay cao su, chậu nhựa

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Tạo một số môi trường giá thể khác nhau

- Đánh giá ảnh hưởng của nguồn giống đến sự hình thành quả thể

ở nấm Vân chi

- Nghiên cứu sự ảnh hưởng của độ ẩm đối với sự sinh trưởng và phát triển của nấm Vân chi