Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu định lượng Paraquat trong mẫu huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Luận văn được thực hiện với hai mục tiêu: Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách Paraquat trong huyết tương người và phân tích bằng HPLC để định lượng paraquat; xác định giá trị sử dụng của phương pháp và áp dụng định lượng paraquat trong huyết tương bệnh nhân ngộ độc paraquat tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội.

 Đ I H C QU C GIA HÀ N I Ạ Ọ Ố Ộ

TR ƯỜ NG Đ I H C KHOA H C T  NHIÊN Ạ Ọ Ọ Ự

=======

L i đ u tiên cho tôi g i l i c m  n sâu s c t i PGS.TS T  Th  Th o vàờ ầ ử ờ ả ơ ắ ớ ạ ị ả  TS. Hà Tr nầ  

H ng đã t n tình hư ậ ướng d n và t o m i đi u ki n giúp đ  tôi trong su t quá trình th c hi n đẫ ạ ọ ề ệ ỡ ố ự ệ ề tài và vi t lu n văn.ế ậ

Tôi xin được g i l i c m  n chân thành t i ban lãnh đ o và toàn th  nhân viên Trung tâmử ờ ả ơ ớ ạ ể  

Ch ng Đ c – B nh vi n B ch Mai đã t o đi u ki n thu n l i cho tôi đố ộ ệ ệ ạ ạ ề ệ ậ ợ ược h c t p và nghiênọ ậ  

c u.ứ

Tôi xin bày t  lòng bi t  n t i các th y cô giáo gi ng d y t i khoa Hoá, đ c bi t là cácỏ ế ơ ớ ầ ả ạ ạ ặ ệ  

th y cô trong b  môn Hoá Phân tích, đã cho tôi nh ng ki n th c quý giá trong quá trình h c t pầ ộ ữ ế ứ ọ ậ  

và th c hi n đ  tài này. ự ệ ề

Tôi cũng xin g i l i c m  n các anh ch , b n bè c a t p th  l p cao h c hoá K24, đ cử ờ ả ơ ị ạ ủ ậ ể ớ ọ ặ  

bi t là nh ng ngệ ữ ườ ại b n trong nhóm hoá phân tích K24 đã giúp đ , chia s  nh ng khó khăn trongỡ ẻ ữ  

su t quá trình tôi h c t p và th c hi n đ  tài này. ố ọ ậ ự ệ ề

Cu i cùng tôi xin g i l i c m  n t i gia đình và b n bè đã luôn đ ng viên, chia s  m iố ử ờ ả ơ ớ ạ ộ ẻ ọ  khó khăn cùng tôi

Hà N i, ngày 01 tháng 10  năm 2015 ộ

H c viênọ

Vũ Anh Phương

M C L C Ụ Ụ

DANH SACH BANG BIÊU ́ ̉ ̉

DANH SACH HINH ́ ̀

Chương 1

DANH M C CÁC CH  VI T T T Ụ Ữ Ế Ắ

Tên vi t t tế ắ Tên ti ng anhế Tên Ti ng vi tế ệ

% RSD % Relative standard deviation % Đ  l ch chu n tộ ệ ẩ ương đ iố

% RSDR % Reproducibility standard deviation %   Đ   l ch   chu n   tái   l pộ ệ ẩ ặ  

tương đ iố

AS Asymmetry factor H  s  đ i x ng picệ ố ố ứ

ATP Adenosin Triphophate Adenosin Triphophat

LOQ Limit of Quantification Gi i h n đ nh lớ ạ ị ượng

ppm Parts per million Ph n tri uầ ệ

R Relative  coefficient H  s  tệ ố ương quan

ROC Receiver operating characteristics Đường cong ROC

TCA Trichloroacetic acid Acid Tricloacetic 

tR Retention time Th i gian l uờ ư

UV­VIS Ultraviolet­Visible T  ngo i và kh  ki nử ạ ả ế

Đ T V N Đ Ặ Ấ Ề

Paraquat (viêt tăt cua ́ ́ ̉ paraquaternary bipyridyl) la môt thuôc diêt cò ̣ ́ ̣ ̉ gia thành re,́ ̉  hi u quệ ả diêt co dai nhanh chong̣ ̉ ̣ ́ , ít  nh hả ưởng t i môi trớ ườ  do đó hi n đang đng ệ ượ ử ục s  d ng r ng rãi ộ ở 

Vi t Nam v i nhi u tên thệ ớ ề ương m i khác nhau.ạ  Tuy nhiên, paraquat (PQ) l i ạ la môt chât hoa hoc̀ ̣ ́ ́ ̣  

vô cung đôc v i ng i. Li u t  vong c a PQ ̀ ̣ ớ ườ ề ử ủ ước tính là kho ng 10 mả l dung d ch 20%. Tai nhi uị ̣ ề  

n c phát tri n, PQ đa bi câm s  dung nh ng   Viêt Nam viêc thi u các chính sách và bi n pháp quanướ ể ̃ ̣ ́ ử ̣ ư ở ̣ ̣ ế ệ ̉  

ly s  dung hoa chât nay nên trong nh ng năm v a qua co rât nhiêu tr ng h p ngô đôc ́ử ̣ ́ ́ ̀ ữ ừ ́ ́ ̀ ườ ợ ̣ ̣ PQ đên c ṕ ấ  

c u [1]. Trên th  gi i, nhiêu ca t  vong do ng  đôc PQ đa đ c bao cao [10][19][27]. T i Trung tâmứ ế ớ ̀ ử ộ ̣ ̃ ượ ́ ́ ạ  

Ch ng đ c b nh vi n B ch Mai, trong nh ng năm g n đây, s  l ng b nh nhân ng  đ c ố ộ ệ ệ ạ ữ ầ ố ượ ệ ộ ộ PQ không 

ng ng gia tăng và tr  thành m t v n n n vô cùng nghiêm tr ng, v t ng ng 300 ca trong năm 2013ừ ở ộ ấ ạ ọ ượ ưỡ  

và năm 2014 lên t i 391 ca. Ti lê t  vong do ngô đôc PQ rât cao, th ng kho ng 70­80% theo nhiêuớ ̉ ̣ ử ̣ ̣ ́ ườ ả ̀ nghiên c u cua cac tac gia n c ngoai [29][32]. Tai Trung tâm ch ng đ c (TTCĐ) bênh viên Bachứ ̉ ́ ́ ̉ ướ ̀ ̣ ố ộ ̣ ̣ ̣  Mai, ti lê t  vong năm 2007 la 72,5% [̉ ̣ ử ̀ 4], năm 2011 là 72,9% [2], nghiên c u tai bênh viên Ch  Râỹứ ̣ ̣ ̣ ợ  thành ph  H  Chí Minh la 85%. ố ồ ̀

Trong ch n đoán và đi u tr  ng  đ c c p PQ, xét nghi m đ nh lẩ ề ị ộ ộ ấ ệ ị ượng  PQ  trong huy tế  

tương đóng vai trò đ c bi t quan tr ng, giúp xác đ nh m c đ  n ng c a ng  đ c, tiên lặ ệ ọ ị ứ ộ ặ ủ ộ ộ ượ  ng

b nh nhân cũng nh  đánh giá hi u qu  c a các bi n pháp đi u tr , đ c bi t là l c máu h p phệ ư ệ ả ủ ệ ề ị ặ ệ ọ ấ ụ. 

T  l  t  vong ỷ ệ ử do ng  đ c c p PQ r t cao ộ ộ ấ ấ vì thi u các bi n pháp đi u tr  hi u qu  G n đây, cácế ệ ề ị ệ ả ầ  nghiên c u c a nhi u tác gi  nứ ủ ề ả ước ngoài và m t s  tác gi  Vi t Nam cho th y các kĩ thu t l cộ ố ả ệ ấ ậ ọ  máu m i, nh t là l c máu h p ph  b ng c t than ho t ho c c t resin nh m tăng cớ ấ ọ ấ ụ ằ ộ ạ ặ ộ ằ ường đào th iả  

PQ cho k t qu  kh  quan, c u s ng m t s  không nh  b nh nhân ng  đ c c p PQ. Xét nghi mế ả ả ứ ố ộ ố ỏ ệ ộ ộ ấ ệ  

đ nh lị ượng n ng đ  ồ ộ PQ huy t tế ương cung c p công c  quan tr ng đ  đánh giá hi u qu  c a cácấ ụ ọ ể ệ ả ủ  

bi n pháp đi u tr  tăng th i tr  này. ệ ề ị ả ừ

Tuy nhiên, cho đ n nay t i Vi t Nam vi c xét nghi m ế ạ ệ ệ ệ PQ ch  d ng   m c đ  đ nh tínhỉ ừ ở ứ ộ ị  trong nước ti u b ng phể ằ ương pháp so màu đ  xác đ nh b nh nhân ng  đ c ể ị ệ ộ ộ PQ mà ch a có c  sư ơ ở xét nghi m nào có th  th c hi n vi c đ nh lệ ể ự ệ ệ ị ượng n ng đ  ồ ộ PQ máu v i k t qu  đáng tin c y.ớ ế ả ậ  

Đi u này d n đ n m t kho ng tr ng l n trong ch n đoán, tiên lề ẫ ế ộ ả ố ớ ẩ ượng cũng nh  đánh giá hi uư ệ  

qu  c a các bi n pháp l c máu làm cho vi c đi u tr  ng  đ c ả ủ ệ ọ ệ ề ị ộ ộ PQ t i Trung tâm ạ Ch ng đ c vàố ộ  các khoa h i s c c p c u trên c  nồ ứ ấ ứ ả ước g p r t nhi u khó khăn. ặ ấ ề

Đ  đ nh lể ị ượng PQ trong huy t tế ương trên th  gi i đã áp d ng các phế ớ ụ ương pháp s c kýắ  khí kh i ph  (GC­MS), đi n di mao qu n (CE), s c ký l ng kh i ph  (LC­MS)  T i Trung tâmố ổ ệ ả ắ ỏ ố ổ ạ  

ch ng đ c b nh vi n B ch Maiố ộ ệ ệ ạ   hi nệ   đang s  d ng máy  ử ụ s c ký l ng hi u năng cao  ắ ỏ ệ đ  xétể  

nghi m đ c ch t nh ng cũng ch a có quy trình chu n đ nh lệ ộ ấ ư ư ẩ ị ượng  PQ  huy t tế ương. Vì v y,ậ  chúng tôi ti n hành nghiên c u đ  tài  ế ứ ề “Nghiên c u đ nh lứ ị ượng Paraquat trong m u huy tẫ ế  

tương ngườ ằi b ng phương pháp s c ký l ng hi u năng cao”ắ ỏ ệ  v i hai m c tiêu: ớ ụ

1 Nghiên c u xây d ng quy trình chi t tách Paraquat trong huy t t ứ ự ế ế ươ ng ng ườ i và phân   tích b ng HPLC đ  đ nh l ằ ể ị ượ ng paraquat.

2 Xác đ nh giá tr  s  d ng c a ph ị ị ử ụ ủ ươ ng pháp  và áp d ng đ nh l ụ ị ượ ng paraquat trong huy t ế  

t ươ ng b nh nhân ng  đ c paraquat t i Trung tâm ch ng đ c b nh vi n B ch Mai ệ ộ ộ ạ ố ộ ệ ệ ạ , Hà 

N i ộ

PQ thu c nhóm h p ch t amonium b c 4 bipyridylium,  độ ợ ấ ậ ược t ng h p đ u tiên vào nămổ ợ ầ  

1882,  ng d ng trong nông nghi p làm thu c tr  c  t  nh ng năm 1950 [42]. ứ ụ ệ ố ừ ỏ ừ ữ

PQ có kh i l ng phân t  t ng đ i 186,2 có công th c hóa h c nh  hình 1.1: ố ượ ử ươ ố ứ ọ ư

Hình 1.: Công th c hóa h c c a paraquatứ ọ ủ

1.1.2. Tính ch t lý, hóa h c c a paraquat  ấ ọ ủ

PQ thường có màu tr ng h i vàng, không mùi, t  tr ng   20ắ ơ ỷ ọ ở oC là 1,240 ­ 1,260, đi mể  

ch y 175 ­ 180ả oC, đi m sôi kho ng 300ể ả oC và pH c a dung d ch PQ trong nủ ị ước 6,5 ­ 7,5

PQ thường   d ng dimethylsulphate ho c dichloride. D ng dichloride tinh th  tr ng,ở ạ ặ ạ ể ắ  

d ng dimethylsulphate ch y r a. PQ  n đ nh trong dung d ch môi trạ ả ữ ổ ị ị ường acid ho c trung tính vàặ  không  n đ nh trong môi trổ ị ường ki m. ề

PQ tan t t trong nố ước (đ  tan 700 g/l   20ộ ở oC), ít tan trong c n và h u nh  không tan trongồ ầ ư  các dung môi h u c  khác. ữ ơ

PQ b  phân h y dị ủ ưới ánh sáng UV, b  b t ho t b i các tác nhân ho t đ ng b  m t anionicị ấ ạ ở ạ ộ ề ặ  

và b i đ t sét, b  m t ho t tính nhanh khi ti p xúc v iở ấ ị ấ ạ ế ớ  đ t. PQ không bay h i. Dung d ch PQ đ cấ ơ ị ặ  

ăn mòn thép, t m thi c, s t m  k m và nhôm [43].ấ ế ắ ạ ẽ

PQ được s n xu t b i nhi u công ty khác nhau v i cac tên thả ấ ở ề ớ ́ ương mai và hàm ḷ ượ  ngkhác nhau, nói chung thường đ u   d ng dung d ch màu xanh. M t s  tên g i thề ở ạ ị ộ ố ọ ường g p c aặ ủ  

PQ nh : Gramoxone, ư Gfaxone, Hegaxone, Tungmaxone, Owen  [42]

Do đ c tính gây t  vong r t cao nên h u h t các nộ ử ấ ầ ế ước phát tri n đ u đã c m s  d ng PQể ề ấ ử ụ  

nh  là m t lo i hóa ch t b o v  th c v t (M  và các nư ộ ạ ấ ả ệ ự ậ ỹ ước Châu Âu). M t s  nộ ố ước nh  Nh tư ậ  

B n ch  cho phép l u hành ả ỉ ư PQ d ng dung d ch v i hàm lạ ị ớ ượng th p 4,5% s  giúp gi m thi uấ ẽ ả ể  

nguy c  n u b  ng  đ c. Th c t  hi n nay trên th  gi i v n có g n 130 nơ ế ị ộ ộ ự ế ệ ế ớ ẫ ầ ước cho phép s  d ngử ụ  

PQ trong đó có Vi t Nam ệ [42]. Hi n   Vi t Nam thu c t  c  PQ đệ ở ệ ố ừ ỏ ượ ưc l u hành d ng dung d chạ ị  20% do đó nguy c  ng  đ c c p tính r t l n.ơ ộ ộ ấ ấ ớ

M t đi u đáng nói là công ty s n xu t ộ ề ả ấ PQ l n nh t trên th  gi i hi n nay là Syngenta hayớ ấ ế ớ ệ  còn g i là Zeneca đ t nhà máy t i Trung Qu c và Anh. Trên đ t nọ ặ ạ ố ấ ước h  đã c m hoàn toàn ọ ấ PQ, 

ho t đ ng kinh doanh ch  y u xu t kh u sang các nạ ộ ủ ế ấ ẩ ước th  ba ứ [39]

1.1.3. C  ch  gây đ c c a paraquat  ơ ế ộ ủ

 C  ch  g y đ c c a PQ đơ ế ấ ộ ủ ược mô t  theo s  đ  sau [37]:ả ơ ồ

Hình 1  C  ch  gây đ c c a paraquat ơ ế ộ ủ [15]

Trong giai đo n đ u c a chu trình này, ion PQạ ầ ủ 2+ cùng v i NADPH tr i qua m t ph n  ngớ ả ộ ả ứ  

t o ra ion paraquat b  kh  (PQạ ị ử +) và NADP+. PQ+ ph n  ng h u nh  ngay l p t c v i oxy tái t oả ứ ầ ư ậ ứ ớ ạ  

l i PQạ 2+ và g c superoxid. Có s n NADPH và oxy, chu trình oxy hoá ­ kh  c a PQ x y ra liênố ẵ ử ủ ả  

t c, v i vi c NADPH liên t c b  m t đi và không ng ng t o ra g c superoxid. G c t  doụ ớ ệ ụ ị ấ ừ ạ ố ố ự  superoxid sau đó ph n  ng v i b n thân nó đ  t o ra peroxid hydro (Hả ứ ớ ả ể ạ 2O2), và v i Hớ 2O2 cùng Fe 

đ  t o thành g c t  do hydroxyl [18] [31]. C n ki t NADPH d n t i ch t t  bào. Chu trình oxyể ạ ố ự ạ ệ ẫ ớ ế ế  hoá ­ kh  t o thành g c t  do hydroxyl d n t i nhi u c  ch  làm t n thử ạ ố ự ẫ ớ ề ơ ế ổ ương t  bào: ph n  ngế ả ứ  

v i lipid trên màng t  bào (peroxide hoá lipid), DNA và các protein t i c n thi t cho t  bào s ngớ ế ố ầ ế ế ố  sót cũng b  các g c t  do hydroxyl phá h y [12] [39] [40].ị ố ự ủ

H u qu  lên t  bào do vi c hình thành các g c t  do (superoxid và các g c t  do khác) làậ ả ế ệ ố ự ố ự  

đ i tố ượng c a r t nhi u nghiên c u. Các th  nghi m đi u tr  nh m vào vi c thay đ i các g c tủ ấ ề ứ ử ệ ề ị ằ ệ ổ ố ự 

do b ng các ch t nh  desferioxamin, superoxid dismutase,  ­tocopherol và vitamin C cùng v i bàiằ ấ ư α ớ  

ni u cệ ưỡng b c. Tuy nhiên, cho đ n hi n nay không có ch t nào trong s  này đứ ế ệ ấ ố ược khuy n cáoế  dùng.

M c dù chi ti t đ y đ  v  đ c ch t h c c a các g c t  do do PQ sinh ra v n ch a đặ ế ầ ủ ề ộ ấ ọ ủ ố ự ẫ ư ượ  c

bi t nh ng nh ng gì ngế ư ữ ười ta đã bi t v  c  s  đ  ng  đ c là s  tế ề ơ ở ể ộ ộ ự ương tác gi a PQ, NADPH vàữ  oxy. Sau đó,   m c đ  t  bào, oxy là y u t  t i c n thi t cho vi c hình thành b nh lý do PQ.ở ứ ộ ế ế ố ố ầ ế ệ ệ  Đây là c  s  cho vi c h n ch  cung c p oxy trong vi c đi u tr  ban đ u b nh nhân ng  đ c PQ.ơ ở ệ ạ ế ấ ệ ề ị ầ ệ ộ ộ

PQ có tính ăn mòn và gây t n thổ ương gi ng nh  ki m khi ti p xúc v i da, m t và cácố ư ề ế ớ ắ  niêm m c. Các c  quan đích ch  y u trong ng  đ c toàn thân PQ là đạ ơ ủ ế ộ ộ ường tiêu hoá, th n vàậ  

ph i. D  dày, ru t b  t n thổ ạ ộ ị ổ ương n ng n  do tác d ng ăn mòn tr c ti p khi b nh nhân u ng PQặ ề ụ ự ế ệ ố  

có ch  ý v i n ng đ  cao. Th n là c  quan đào th i PQ và DQ và có n ng đ  bipyridyl cao h nủ ớ ồ ộ ậ ơ ả ồ ộ ơ  

so v i các c  quan khác. Riêng   ph i, PQ vào các ph  bào týp I và II không ph  thu c b c thangớ ơ ở ổ ế ụ ộ ậ  

n ng đ  mà theo c  ch  v n chuy n tích c c ph  thu c ATP.ồ ộ ơ ế ậ ể ự ụ ộ

Do v y PQ gây t n thậ ổ ương h u h t t t c  các c  quan trong c  th  vì đ u có liên quanầ ế ấ ả ơ ơ ể ề  

đ n chuy n hóa và hô h p t  bào, tuy nhiên t i các v  trí h p ph  nhi u PQ ho c liên quan đ nế ể ấ ế ạ ị ấ ụ ề ặ ế  

th i tr  PQ thì t n thả ừ ổ ương đ n s m h n, n ng h n và cũng là nguyên nhân hàng đ u gây t  vongế ớ ơ ặ ơ ầ ử  

nh  t n thư ổ ương ph i gây suy hô h p, suy th n, viêm gan, loét niêm m c đổ ấ ậ ạ ường tiêu hóa và bi nế  

ch ng nhi m trùng [6][13][37]. Viêc tiêp xuc v i lứ ễ ̣ ́ ́ ơ ượ́ ng PQ it h n se lam châm nguy c  t  vonǵ ơ ̃ ̀ ̣ ơ ử  

do x  phôi tiên triên va suy thân [33]. Môt sô nghiên c u gân đây còn cho thây ph i nhiêm PQ coơ ̉ ́ ̉ ̀ ̣ ̣ ́ ứ ̀ ́ ơ ̃ ́ liên quan v i hôi ch ng Parkinson [21][23].ớ ̣ ứ

Trong ngô đôc câp PQ, co thê tiên ḷ ̣ ́ ́ ̉ ượng bênh d a trên nông đô PQ trong huyêt ṭ ự ̀ ̣ ́ ương. Môṭ  

sô bao cao cho thây nông đô PQ huyêt t́ ́ ́ ́ ̀ ̣ ́ ương vượt qua 2 µg/ml thi hâu hêt t  vong, tuy nhiên môt̀ ̀ ́ ử ̣  vai tr̀ ương h p bênh nhân vân hôi phuc khi nông đô trong mau cao h n 2 µg/ml [7][10][22].̀ ợ ̣ ̃ ̀ ̣ ̀ ̣ ́ ơ

được h p thu đ n m c đ  đ  gây nhi m đ c. B i vì kích thấ ế ứ ủ ể ễ ộ ở ước các h t ch a PQ l n (h u h tạ ứ ớ ầ ế  trên 100  m) làm cho PQ không đi sâu được xu ng đố ường hô h p đ  h p thu [11]. M t ti p xúcấ ể ấ ắ ế  

v i PQ s  b  t n thớ ẽ ị ổ ương, nh ng không đ  đ  gây nhi m đ c toàn thân.ư ủ ể ễ ộ

Sau khi uông, PQ phân b  nhanh chóng nh t t i tât ca cac c  quan chinh nh  ph i, th n,́ ố ấ ớ ́ ̉ ́ ơ ́ ư ổ ậ  gan và c , đăc biêt la phôi, PQ se bi kh  thanh dang gôc t  do hoat tinh cao [8][22]. Th  tích phânơ ̣ ̣ ̀ ̉ ̃ ̣ ử ̀ ̣ ́ ự ̣ ́ ể  

b  c a PQ là 1,2 ­ 1,6 l/kg. ố ủ

PQ đ t đạ ược n ng đ  cao và t n t i lâu h n trong ph i, n ng đ  trong ph i có th  caoồ ộ ồ ạ ơ ổ ồ ộ ổ ể  

h n so v i n ng đ  huy t tơ ớ ồ ộ ế ương g p 50 l n. Sau u ng 5­7 gi , n ng đ  PQ trong t  ch c ph iấ ầ ố ờ ồ ộ ổ ứ ổ  

đ t cao nh t. Tuy nhiên, lạ ấ ượng PQ huy t tế ương cũng c n đ t đ n m t ngầ ạ ế ộ ưỡng t i h n đ  choớ ạ ể  quá trình h p thu   ph i di n ra [11]. ấ ở ổ ễ

PQ qua được nhau thai. Trong m t nghiên c u, n ng đ  PQ trong d ch  i và máu dây r n,ộ ứ ồ ộ ị ố ố  bào thai cao h n n ng đ  trong máu m  4­6 l n [11]. Không có bào thai nào s ng sót. Tuy nhiênơ ồ ộ ẹ ầ ố  

n u m  ng  đ c PQ còn s ng thì đ n l n có thai sau không nguy hi m đ n bào thai.ế ẹ ộ ộ ố ế ầ ể ế

1.1.4.3. Chuy n hoá, th i tr ể ả ừ

PQ được đào th i h u nh  hoàn toàn qua th n nh  c  quá trình l c c a c u th n và quáả ầ ư ậ ờ ả ọ ủ ầ ậ  trình bài ti t tích c c c a  ng th n. Trong vòng 12­24 gi  sau u ng, trên 90% ế ự ủ ố ậ ờ ố PQ được đào th iả  

dưới d ng không đ i qua th n, n u ch c năng th n bình thạ ổ ậ ế ứ ậ ường [11].Tuy nhiên có th  xétể  nghi m th y ệ ấ PQ trong nước ti u vài ngày sau do có s  tái phân b  PQ t  các c  quan. Th i gianể ự ố ừ ơ ờ  bán th i c a ả ủ PQ có th  kéo dài 12­120 gi  ho c lâu h n khi có suy th n. Ngoai ra PQ con đao thaiể ờ ặ ơ ậ ̀ ̀ ̀ ̉  qua phân dươi dang không đôi [8][22].́ ̣ ̉

1.1.5. Tiên l ượ ng b nh nhân d a vào n ng đ  paraquat trong huy t t ệ ự ồ ộ ế ươ ng

Tiên lượng b nh nhân ệ u ngố  PQ có th  ể d a vàoự  n ng đ  ồ ộ PQ huy t tế ương theo th iờ  gian. 

N ng đ  PQ ph i đo trồ ộ ả ước khi đi u tr  vì các bi n pháp đi u tr  có th  làm gi m n ng đ  PQề ị ệ ề ị ể ả ồ ộ  (dùng than ho t, l c máu h p ph …). Proudfoot và cạ ọ ấ ụ ộng s  [29] ự l n đ u tiên trình bày bi u đầ ầ ể ồ tiên lượng kh  năng s ng t  k t qu  đ nh lả ố ừ ế ả ị ượng n ng đ  PQ huy t tồ ộ ế ương t i nhi u th i đi mạ ề ờ ể  khác nhau trên 79 b nh nhân. Nh ng BN s ng có n ng đ  dệ ữ ố ồ ộ ưới 2,0; 0,6; 0,3; 0,16 và 0,1 mg/l 

tương  ng   4, 6, 10, 16, và 24 gi  sau u ng PQứ ở ờ ố  Schermann và c ng sộ ự [35] m  r ng đở ộ ườ  ngcong tiên lượng BN này lên đ n ngày th  7 sau nhi m đ c, và nghiên c u này cho th y nh ngế ứ ễ ộ ứ ấ ữ  

BN n ng đ  PQ huy t tồ ộ ế ương trên 10 mg/l (đ nh lị ượng trong vòng 8 gi ), thờ ường ch t vì s c timế ố  trong 24h, trong khi nh ng BN có n ng đ  th p h n (nh ng v n trên đữ ồ ộ ấ ơ ư ẫ ường tiên lượng), ch t vìế  

x  ph i và suy hô h p mu n h n 24 gi  sau u ng. Suzuki và cơ ổ ấ ộ ơ ờ ố ộng sự (1991) [36] đã k t h p dế ợ ữ 

li u c a Proudfoot (1979), Bismuth (1982), Scherrmann (1987), Sawada (1988) và thêm m t nhómệ ủ ộ  

78 BN, k t lu n r ng đ  th  tiên lế ậ ằ ồ ị ượng chính xác 101 trong 102 trường h p t  vong và 61 trongợ ử  

63 BN s ng đố ược đánh giá trong vòng 24 h sau u ng PQ. M c dù đ  th  khá chính xác, giúp xácố ặ ồ ị  

đ nh m c đ  n ng và tiên lị ứ ộ ặ ượng t  vong n u đ nh lử ế ị ượng được PQ ngay l p t c, đ  th  này cũngậ ứ ồ ị  

đôi khi tiên đoán sai. Nguyên nhân do ước tính th i gian t  khi u ng PQ d  sai, đ c bi t trong vàiờ ừ ố ễ ặ ệ  

gi  đ u tiên n ng đ  PQ huy t tờ ầ ồ ộ ế ương gi m nhanh sai s  v  th i gian th m chí 0,5 đ n 1h có thả ố ề ờ ậ ế ể thay đ i hoàn toàn m i quan h  n ng đ  và tiên lổ ố ệ ồ ộ ượng. Ngoài ra, n ng đ  PQ trong huy t tồ ộ ế ươ  ng

có th  không hoàn toàn chính xác vì để ược phân tích b ng m t s  phằ ộ ố ương pháp khác nhau và các nghiên c u thứ ường không trình bày rõ n ng đ  c a ion hay là mu i PQ, và th c t  có th  có khácồ ộ ủ ố ự ế ể  

bi t  gi a các b nh nhân v  m c đ  nh y c m v i tác d ng đ c c a PQ, tuy khác bi t này ch aệ ữ ệ ề ứ ộ ạ ả ớ ụ ộ ủ ệ ư  

được nghiên c u.ứ

Hình 1.: Bi u đ  liên quan gi a n ng đ  Paraquat huy t tể ồ ữ ồ ộ ế ương (µg/ml), th i gian sauờ  

u ng, và kh  năng s ng.ố ả ố

Năm 1988 Sawada và c ng sộ ự [34] báo cáo ch  ỉsố tiên lượ  ng  đ c PQ d a trên nghiênng ộ ộ ự  

c u n ng ứ ồ đ  ộ PQ huy t thanhế  ở 30 b nh nhân, 20 ệ t  vongử  và 10 BN s ng.ố  Ch  s  đ  ỉ ố ộ n ngặ  c aủ  

ng  đ c PQ (SIPPộ ộ : severity index of PQ poisoning) tính b ng ằ th i gian tờ ừ khi u ng ố (gi ) cho đ nờ ế  khi b t đ u đi u trắ ầ ề ị nhân v i ớ n ng đồ ộ PQ huy t thanh (µg/ml) ế khi vào vi n.ệ

SIPP = [n ng đồ ộ PQ huy t thanh (µg/ml)]ế  × [th i gian ờ t  u ng ừ ố đ n b t đ u đi u trế ắ ầ ề ị (h)]

Khi đi m SIPP ít h n 10, b nh nhân có th  s ng sót; ể ơ ệ ể ố đi m 50 ể phân bi tệ  t  vong mu n doử ộ  suy hô h p (10 <ấ  SIPP <50) v iớ  t  vongử  s m do suy tu n hoànớ ầ  (SIPP > 50). M c dù đây làặ  nghiên c u quan tr ng, Sawada xét nghi m đ nh lứ ọ ệ ị ượng dùng huy t thanh không ph i huy tế ả ế  

tương. Suzuki và cộng sự (1991) đã so sánh SIPP v i đ  th  tiên lớ ồ ị ượng s ng trên 167 BN nh pố ậ  

vi n trong vòng 24 h sau u ng PQ. Các k t c c c a BN d  đoán theo đ  th  c a Proudfoot đãệ ố ế ụ ủ ự ồ ị ủ  sai   1 trở ường h p t  vong và 2 BN s ng; trong khi đó, SIPP sai   1 BN s ng và 10 trợ ử ố ở ố ườ  ng

h p t  vong. Nh ng khác bi t này có ý nghĩa th ng kê, và tác gi  k t lu n r ng  ợ ử ữ ệ ố ả ế ậ ằ d a trênự  

n ng đồ ộ PQ trong 24  h đ uầ  sau u ng,ố   đ  th  c a Proudfoot tiên lồ ị ủ ượng chính xác h n  ơ SIPP [36].

1.2. Các phương pháp xác đ nh paraquat trong huy t tị ế ương

1.2.1. Ph ươ ng pháp quang phô  ̉

Rai M.K và c ng s   ộ ự [30] đ nh lị ượng PQ s  d ng ử ụ NaBH4 đ  kh  ể ử PQ trong môi trườ  ng

ki m t o ra dung d ch màu xanh h p th  c c đ i   bề ạ ị ấ ụ ự ạ ở ước sóng 600nm trong khi  Kato K. và c ng ộ  

sự [20] l i dùng Tetrabromophenolphthalein Ethyl Esterạ  (TBPE) ph n  ng v i PQ đ  t o ra dungả ứ ớ ể ạ  

d ch h u c  PQ­TBPE màu xanh da tr i, có th  chi t đị ữ ơ ờ ể ế ượ  b ng c ằ dichloromethane. Chang­bin Li 

và c ng s   ộ ự [24] đã đ nh lị ượng PQ trong huy t tế ương d a ự b ngằ  đo quang ph  ổ c a ủ d n xu tẫ ấ  khi 

ph n  ng v i ả ứ ớ Na2S2O4 10% và NaOH 5M

u đi m c a ph ng pháp kh  PQ b ng 

Ư ể ủ ươ ử ằ NaBH4 là đ  nh y cao, v i các đi u ki n khộ ạ ớ ề ệ ử 

PQ là nhi t đ  35­40ệ ộ °C, pH 10­11 thì màu có đ   n đ nh ộ ổ ị lên đ n 12hế  và không c n đ m đ   nầ ệ ể ổ  

đ nh màuị , kho ngả  n ng đ  0,05 ồ ộ ­ 0,5 µg/ml tuân theo đ nh lu t Lambert – Beerị ậ , trong khi gi i h nớ ạ  phát hi n là 0,03 µg/mệ l. Trong khi đó, phương pháp s  d ng TBPE thì mử ụ ẫu được phép đ  ể t i đaố  trong 20 phút. C  2 phả ương pháp này đ u đ  c p đ n DQ, trong khi ề ề ậ ế Rai M.K [30] lo i b  DQ thìạ ỏ  

Kato K. [20] l i đ nh lạ ị ượng đ ng th i c  PQ và DQ. ồ ờ ả

Phương pháp đ nh lị ượng PQ b ng NaBHằ 4 đã lo i đạ ượ ự ảc s   nh hưởng c a các thu c trủ ố ừ sâu thông thường và các ion kim lo i khác. DQ, có c u trúc g n gi ng ạ ấ ầ ố PQ, s  gây  nh hẽ ả ưởng khi 

đ nh lị ượng PQ. Tuy nhiên DQ, n u có, s  b  lo i khi thêm NaOH 0,2 N, trong khi ế ẽ ị ạ PQ không bị 

m t đi. Các ion kim lo i nh  Feấ ạ ư 3+ và Al3+, có th   nh hể ả ưởng do làm k t t a hydroxide, s  b  lo iế ủ ẽ ị ạ  

đi khi thêm 1 ml Natri EDTA 5% trước khi thêm dung d ch NaOH [30]. Còn theo ị Kato K [20], DQ 

cũng có th  chi t để ế ược v i TBPE trong dichloromethane cũng gi ng nh  PQ nh ng PQ­TBPE cóớ ố ư ư  quang ph  h p th  h i khác v i DQ­TBPE. Đo đ  h p ph  c a PQ   bổ ấ ụ ơ ớ ộ ấ ụ ủ ở ước sóng 603 nm & DQ ở 

bước sóng 608 nm v i dãy n ng đ  (4,5 ớ ồ ộ ­ 45,0)×10­7 M. Gi i h n phát hi n 4,77.10ớ ạ ệ ­7 M. 

Phương pháp đ nh lị ượng PQ b ng NaBHằ 4  đã đượ ức  ng d ng đ  đ nh lụ ể ị ượng  PQ  trong 

m u b nh ph m b nh nhân nh  máu, nẫ ệ ẩ ệ ư ước ti u, s a m  cũng nh  các m u th c ph m và cácể ữ ẹ ư ẫ ự ẩ  

m u trong môi trẫ ường

V i phớ ương pháp đo quang ph  thông thổ ường, không phát hi n đệ ược PQ t i bạ ước sóng 

257 nm. Nên Chang­bin Li và c ng s ộ ự [24] đã đ nh lị ượng n ng đ  PQ trong huy t tồ ộ ế ương d a trênự  

vi c đo quang ph  d n xu t th  2 (tuân theo đ nh lu t Lambert Beer v i ệ ổ ẫ ấ ứ ị ậ ớ r = 0,996). Dung d chị  

nước chu n PQ 10 ẩ μg/ml được quét bước sóng t  200 đ n 300 nm, v i m u tr ng là nừ ế ớ ẫ ắ ước c t.ấ  Huy t tế ương s ch và các dung d ch huy t tạ ị ế ương chu n PQ 50 và 10 ẩ μg/ml được thêm TCA 20% (t  l  6:1, v/v). L c xoáy, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. L y d ch trong ph n trên đi đo quétỉ ệ ắ ấ ị ầ  

bước sóng t  200 đ n 300 nm. Sau khi x  lý m u nh  trên, d ch trong ph n trên đừ ế ử ẫ ư ị ầ ược chuy nể  vào  ng Eppendorf m i, b o qu n tránh ánh sáng. Trố ớ ả ả ước khi đo, 400 μl m u đẫ ượ ắc l c tr n nhộ ẹ nhàng và hoàn toàn v i 100 ớ μl h n h p đ ng th  tích Naỗ ợ ồ ể 2S2O4 10% và NaOH 5M. Làm tương tự 

v i m u huy t tớ ẫ ế ương tr ng đ i chi uắ ố ế  và đo đ  h p th  quang trong kho ng ộ ấ ụ ả bước sóng t  300ừ  

đ n 500 nm (kho ng bế ả ước sóng Δ  λ = 0,5 nm). T  đó d n xu t th  2 này có th  đừ ẫ ấ ứ ể ược tính toán theo công th c ứ Δ2Abs/(Δλ)2 (kho ng bả ước sóng d n xu t ẫ ấ Δλ=4 nm) [24]

1.2.2. Ph ươ ng pháp s c ký khí kh i ph ắ ố ổ

Phương pháp GC­MS là phương pháp đ n gi n có đ  nh y và đ  tin c y cao, t  lâu đãơ ả ộ ạ ộ ậ ừ  

đượ ử ục s  d ng đ  đ nh lể ị ượng PQ trong d ch sinh h c. L. Gao [16] và ị ọ Almeida R. M. [5] cùng sử 

d ng phụ ương pháp GC­MS đ  đ nh lể ị ượng PQ. Trong c  hai nghiên c u, các tác gi  đã s  d ngả ứ ả ử ụ  

h  th ng ch n l c ion ệ ố ọ ọ (selected ion monitoring – SIM) đ  nh n bi t PQ, đ ng th i cũng thêmể ậ ế ồ ờ  EPQ làm ch t n i chu n, khí He đấ ộ ẩ ược dùng nh  là khí mang đ  đ a ch t phân tích vào c t. Dungư ể ư ấ ộ  

d ch m u phân tích đ u đị ẫ ề ược kh  b ng NaBHử ằ 4 trước khi đem phân tích trên h  s c ký khí. Tuyệ ắ  nhiên m i tác gi  l i nghiên c u các quy trình phân tích khác nhau.ỗ ả ạ ứ

Tác gi  L. Gao và c ng s  [16] l i s  d ngả ộ ự ạ ử ụ  c t mao qu n (10ộ ả  m  0,18 mm, đ  dày màngộ  0,25 µm). Nhi t đ  c a b m tiêm, interface và ngu n ion l n lệ ộ ủ ơ ồ ầ ượt là 280, 280, 200oC. Khí mang 

được b m đ ng dòng v i t c đ  là 1,01 mơ ẳ ớ ố ộ l/phút. M u đẫ ược đ a vào b ng ch  đ  tiêm chia dòngư ằ ế ộ  (10:1) và nhi t đ  gi i h p ph  lúc đ u là 70ệ ộ ả ấ ụ ầ oC trong 1 phút và tăng đ n 295ế oC v i t c đớ ố ộ 

25oC/phút. Nhi t đ  295ệ ộ oC được duy trì trong 10 phút. Trong đó các m nh ion 196 và 224 đả ượ  cdùng đ  đ nh lể ị ượng PQ & EPQ. Đ  thu h i c a m u máu và nộ ồ ủ ẫ ước ti u l n lể ầ ượt là 94,00 ­ 99,85% và 95,00 ­ 100,34%, kho ng tuy n tính 0,1 ­ 50 µg/mả ế l. Gi i h n phát hi n (S/N = 3) làớ ạ ệ  0,01 µg/ml đ i v i c  máu và nố ớ ả ước ti u. Phể ương pháp này đã được áp d ng đ  phân tích cácụ ể  

m u sinh h c thu đẫ ọ ượ ừc t  các n n nhân ch t do u ng PQ.ạ ế ố

Trong khi đó, Almeida R. M. và c ng sộ ự [5] s  d ng trên h  máy s c ký GC­MS (Gasử ụ ệ ắ  chromatograph model 6890 và Mass selective detector MSD model 5972) v i c t mao qu n fused­ớ ộ ảsilica HP­5MS (30 m × 0,25 mm, đ  dày màng phim 0,1 µm) và ch  đ  đ ng dòng v i t c đ  0,6ộ ế ộ ẳ ớ ố ộ  ml/phút. Nhi t đ  c a b m và interface (b  ph n ghép n i gi a GC và MS) là 270ệ ộ ủ ơ ộ ậ ố ữ oC. B m ho tơ ạ  

đ ng   ch  đ  chia dòng. Nhi t đ  c t duy trì 80ộ ở ế ộ ệ ộ ộ oC trong 1 phút, tăng nhi t 10ệ oC/phút đ n 200ế oC 

và 20oC/phút đ n 270ế oC và duy trì 270oC trong 4 phút. S  kh i c a các m nh ion đố ố ủ ả ược ch n choọ  các h p ch t là: m/z 108, 135, ợ ấ 190 (DQ); m/z 134, 148, 192 (PQ) và m/z 148, 162, 220 (EPQ), trong 

đó các m nh ion 192 và 162 đả ược dùng đ  đ nh lể ị ượng PQ & EPQ

35oC. B m m u 10 µl. Detector m ng photodiode Water 996 ho t đ ng t  bơ ẫ ả ạ ộ ừ ước sóng 210­400 nm 

v i đ  phân gi i 1,2 nm. Đ  h p th  UV đớ ộ ả ộ ấ ụ ược đo   258 nm.ở

C  hai tác gi  đ u s  d ng pha đ ng là ammonium formate và acetonitrile. Trong khiả ả ề ử ụ ộ  

ZhaohongWang dùng ammonium formate 250 mM (đi u ch nh đ n pH 3,7 b ng acid formic) vàề ỉ ế ằ  acetonitrile. Và ch y pha đ ng theo ch  đ  gradient v i t c đ  dòng 0,3 ml/phút. Ngay sau khiạ ộ ế ộ ớ ố ộ  tiêm m u, % acetonitrile gi m t  60% đ n 20% trong 0,5 phút, sau đó tăng t i 60%   1,5 phút vàẫ ả ừ ế ớ ở  duy trì 60%   1,5 phút ti p. T ng th i gian ch y là 3 phút. Thì tác gi  ở ế ổ ờ ạ ả Proenca P.  dùng pha đ ngộ  

g m acetonitrile và đ m ammonium formate (200 mM) pH 3,6 v i ch  đ  đ ng dòng (30:70, v/v)ồ ệ ớ ế ộ ẳ  

và t c đ  300 µl/phút. ố ộ

Các tác gi  trên đ u s  d ng ngu n ion hóa tia đi n dả ề ử ụ ồ ệ ương đ  ion hóa PQ và chu n n iể ẩ ộ  

nh ng có khác nhau v  đi u ki n kh i ph ư ề ề ệ ố ổ

Tác gi  ả ZhaohongWang  s  d ng b  phân tích ph  kh i ACQUITY BSM_SM_Quattroử ụ ộ ổ ố  Premier XE MS. T i  u hóa đi u ki n MS­MS b ng cách tiêm dòng PQ và ethyl viologen trongố ư ề ệ ằ  acetonitrile/dung d ch ammonium formate 250 mM (40:60, v/v) v i t c đ  khí cone là 50 l/h và t cị ớ ố ộ ố  

đ  dòng khí làm khô là 651 l/h   350ộ ở oC. Đi n áp mao qu n là 3,5 kV và đi n áp cone là 20 V,ệ ả ệ  

đi n áp extractor là 4,0 V và đi n áp th u kính RzFl à 0,5 V. Đ nh lệ ệ ấ ị ượng b ng k  thu t quét ionằ ỹ ậ  (multi­reaction monitoring, MRM), b t các m nh ion ban đ u có m/z 186 và các ion s n ph m cóắ ả ầ ả ẩ  m/z 155 và 171 đ i v i PQ; m nh ion ban đ u có m/z 214 và các ion s n ph m có m/z 158 và 185ố ớ ả ầ ả ẩ  

đ i v i chu n n i ethyl viologen [41].ố ớ ẩ ộ

Còn v i tác gi  ớ ả Proenca P [28] phát hi n ph  (MS) đ c th c hi n trên máy kh i ph  t ́ệ ổ ượ ự ệ ố ổ ư 

c c Water ZQ 2000. Thi t l p các đi u ki n: ngu n nhi t 120ự ế ậ ề ệ ồ ệ oC; nhi t đ  làm khô 400ệ ộ oC; t c đố ộ dòng khí cone (N2) 0 l/h và t c đ  dòng khí làm khô (Nố ộ 2) 600 l/h. Đi n th  capillary 3,5 kV; đi nệ ế ệ  

th  cone 40 V; extractor 4 V; năng lế ượng ion 0,5 V; Quét ph  t  m/z 130­500, th i gian quét 0,5 sổ ừ ờ  

và th i gian tr  (interscan) 0,1s. Đờ ễ ường chu n đ  ẩ ộ PQ trong máu tuy n tính t  0,010­2,0 µg/mlế ừ  trong máu (y=0,0142x+0,1497 v i ớ r2=0,9994) và tuy n tính t  0,025­10,0 µg/ml trong nế ừ ước ti u (yể  

= 0,0141x + 1,347 v i ớ r2 = 0,9994). Gi i h n phát hi n c a PQ trong máu và nớ ạ ệ ủ ước ti u l n lể ầ ượt là 

0,004 µg/ml và 0,007 µg/ml (LOD, S/N = 3) và gi i h n đ nh lớ ạ ị ượng (LOD, S/N = 10) là 0,0012 

µg/ml trong máu và 0,024 µg/ml trong nước ti u. Nghiên c u cũng ch ng minh m u máu tr ngể ứ ứ ẫ ắ  không có pic nào trùng th i gian l u v i PQ và ch t chu n n i ờ ư ớ ấ ẩ ộ

1.2.4. Ph ươ ng pháp s c ký l ng hi u năng cao ắ ỏ ệ

Có r t nh u tác gi  đã s  d ng phấ ề ả ử ụ ương pháp HPLC đ  đ nh lể ị ượng PQ trong d ch sinh h cị ọ  [7][17][26]. 

Arys K. và c ng s   ộ ự [7] s  d ng h  th ng HPLC. G m b m model 126 và tiêm m uử ụ ệ ố ồ ơ ẫ  type 210A v i vòng tiêm m u 50 µl. Bớ ẫ ước sóng ho t đ ng là 230 nm. C t phân tích Aluspherạ ộ ộ  

100 RP­select B (125 mm × 4,0 mm, kích thước h t 5 µm) v i c t b o v  100 RP­select B (4ạ ớ ộ ả ệ  

mm × 4,0 mm, kích thước h t 5 µm). Pha đ ng là h n h p dung d ch NaOH 0,0125 M trongạ ộ ỗ ợ ị  

nước (dung d ch A) và dung d ch NaOH 0,0125 M trong methanol (dung d ch B), t c đ  dòngị ị ị ố ộ  

1 ml/phút. Ch y pha đ ng ch  đ  gradient, dung d ch A t  90% đ n 10% trong th i gian 15ạ ộ ế ộ ị ừ ế ờ  phút. Sau khi ch y xong, ch y l i đi u ki n ban đ u trong 5 phút trạ ạ ạ ề ệ ầ ước khi chuy n sang ch yể ạ  

m u m i. Gi i h n phát hi n PQ c a phẫ ớ ớ ạ ệ ủ ương pháp trong máu và nước ti u l n lể ầ ượt là 63 và 

32 µg/l

Paixão  P.  [26]  đ nh l ng PQ trong huy t thanh  ị ượ ế và  huy t tế ương người được làm đ nơ  

gi n và nhanh b ng phả ằ ương pháp HPLC s  d ng  ử ụ 1,19­diethyl­4,49­  bipyridyldiylium (diethyl paraquat)  làm n i chu n.ộ ẩ   H  th ngệ ố  HPLC  g m bồ ơm m u model 1100,  n đ nh nhi t, detectorẫ ổ ị ệ  UV­VIS.  Vòng b m m u 50 µơ ẫ l, c t NovaPar Cộ 18  (150×4,6 mm, 5µm). Ti n c t Cề ộ 18  (100×4,6 

mm, 10µm). PQ và ch t n i chu n đấ ộ ẩ ượ ửc r a gi i   25ả ở oC v i t c đ  dòng 0,8 mớ ố ộ l/phút và bướ  csóng h p th  258 nm. Pha đ ng g m acid 1 ­ octanesulphonic 3,0 mM; acid orthophosphoric 0,1ấ ụ ộ ồ  

M trong 900 ml nước kh  khoáng đi u ch nh pH đ n 3,0 b ng diethylamine. Acetonitrile n ng đử ề ỉ ế ằ ồ ộ 10% (v/v). K t qu : Th i gian l u c a PQ và chu n n i là 6,5 và 9,5 phút. Gi i h n phát hi nế ả ờ ư ủ ẩ ộ ớ ạ ệ  (LOD) 0,1 µg/ml, gi i h n đ nh lớ ạ ị ượng (LOQ) 0,4 µg/ml trong huy t tế ương và huy t thanh. Đế ộ đúng trong ngày không vượt quá 3,5%; 3,2% đ i v i huy t tố ớ ế ương, huy t thanh. Đ  đúng trongế ộ  khác ngày không vượt quá 4,7%; 3,1% đ i v i huy t tố ớ ế ương, huy t thanh. Đ  thu h i trong huy tế ộ ồ ế  

tương và huy t thanh l n lế ầ ượt là 98,9% và 98,7%

Shuuji Hara [17] đ nh lị ượng đ ng th i PQ và DQ trong huy t tồ ờ ế ương b ng phằ ương pháp HPLC. H  s  d ng b m L­7120 (Hitachi, Tokyo, Nh t), van b m m u (20 µệ ử ụ ơ ậ ơ ẫ l)  Rheodyne 7125. 

PQ, DQ, IS được tách trên c t pha đ o Capcell PaK C18 UG120 (150­4,6 mm, c  h t 5µm, c aộ ả ỡ ạ ủ  Shiseido Co., Tokyo, Nh t) b ng dung d ch r a gi i c a methanol và  200 mM axit phosphoricậ ằ ị ử ả ủ  

v i diethyl amine 0,1M và sodium 1­heptane sulphonate 12 mM (1:4, v/v). T c đ  dòng c a phaớ ố ộ ủ  

đ ng 0ộ ,5 ml/phút và nhi t đ  c t trong kho ng t  15­20ệ ộ ộ ả ừ oC. D ch r a t  c t HPLC đị ử ừ ộ ược tr n v iộ ớ  dung d ch ki m c a Sodium hydrosulfite b ng thi t b  tr n. T c đ  dòng 0,4 mị ề ủ ằ ế ị ộ ố ộ l/phút. H n h pỗ ợ  

được d n vào s i dây (1 m x 0,5 mm) và đẫ ợ ược làm  m trong b  nấ ể ước SB­9 (EYELA, Tokyo, 

Nh t)   nhi t đ  20ậ ở ệ ộ oC và đo   bở ước sóng 391 nm b ng detector UV Hitachi L­ 7405. Đ  cao c aằ ộ ủ  pic được dùng đ  đ nh lể ị ượng b ng máy C­R6A Chromatopak (Shimadzu, Kyoto, Nh t). Gi i h nằ ậ ớ ạ  phát hi n c a PQ và DQ là 50 và 100 ng (0,19 và 0,29 nmol) trên mệ ủ l huy t tế ương

Đ nh lị ượng PQ trong huy t tế ương s  d ng s c ký l ng hi u năng cao pha đ o c p ion đãử ụ ắ ỏ ệ ả ặ  

đượ Brunetto M.R. th c hi nc  ự ệ  trên h  th ng s c ký đệ ố ắ ượ ử ục s  d ng có 2 b m, 1 b m 2 nòng đơ ơ ể chuy n pha đ ng vào c t phân tích và b m Knauer Model 64 đ  chuy n pha đ ng vào c t chi t.ể ộ ộ ơ ể ể ộ ộ ế  Van tiêm (V1) 6 c a có các vòng m u 20, 100 ho c 200 µử ẫ ặ l đ  đ a m u vào c t chi t. S  d ngể ư ẫ ộ ế ử ụ  các c t 25 ­ 4 mm độ ượ ấc l p đ y các h t LiChrospher RP­18 ADS (kích thầ ạ ước h t 25 µm) và c tạ ộ  VARIAN ODS C­18 (25 cm × 4,6 mm, h t 5 µm) l n lạ ầ ượt là c t chi t và c t phân tích. C t chi tộ ế ộ ộ ế  

và c t phân tích độ ược g n v i van xoay 6 c a Rheodyne đắ ớ ử ược đi u khi n b ng b m 2 nòng. Sề ể ằ ơ ử 

d ng detector UV­DAD Perkin­Elmer LC 235   bụ ở ước sóng 258 nm v i flowcell 12 µm đ  phátớ ể  

Các dung d ch và pha đ ng đị ộ ượ ọc l c màng 0,45 µm và lo i khí trong b  siêu âm trạ ể ước khi 

s  d ng. Gi i h n phát hi n, t  l  tín hi u (Signal) / Nhi u đử ụ ớ ạ ệ ỉ ệ ệ ễ ường n n (Noise) v i S/N > 3, làề ớ  0,005 µg/ml PQ v i th  tích tiêm m u 200 µg [9].ớ ể ẫ

Chen Lu và c ng s   ộ ự [25] đã s  d ng phử ụ ương pháp s c ký l ng hi u năng cao đ  xác đ nhắ ỏ ệ ể ị  

PQ trong huy t thanh ngế ười. Trong thí nghi m này, các m u huy t thanh đã đệ ẫ ế ược k t t a proteinế ủ  

l n lầ ượt 30% acid perchloric, acetonitrile và dichlormethane, thu được 50 ml dung d ch. Pha đ ngị ộ  acetonitrile­đ m (10:90), dung d ch đ m ch a natri heptanesulfonate 0,02 M và acid phosphoricệ ị ệ ứ  0,26 M, đi u ch nh pH đ n 2,0 b ng triethylamine. T c đ  dòng 1,2 ml/phút, bề ỉ ế ằ ố ộ ước sóng phát hi nệ  

256 nm, nhi t đ  c t 40ệ ộ ộ oC. Đường chu n tuy n tính v i n ng đ  PQ huy t thanh t  0,1 ­ 40 mg/lẩ ế ớ ồ ộ ế ừ  (r = 0,9999). Gi i h n phát hi n là 0,1 mg/l (S/N = 3). Đ  lêch chuân (RSD) c a các m u ch ngớ ạ ệ ộ ̣ ̉ ủ ẫ ư  ́

n ng đ  th p, trung bình và cao là trong vòng 3,061% ­ 6,149%, đ  lêch chuân gi a các lô 0,705%ồ ộ ấ ộ ̣ ̉ ữ  

­ 2,796%, và đô thu hôi cua pḥ ̀ ̉ ương phap x  ly mâu 96,79 % ­ 100,07%, và đô thu h i ph́ ử ́ ̃ ̣ ồ ươ  ngpháp là 91,66% ­ 108,49%. Phương pháp này là đ n gi n, nh y c m, chính xác, nhanh chóng vàơ ả ạ ả  cũng ch  ra r ng có th  đỉ ằ ể ượ ử ục s  d ng trong ch n đoán lâm sàng. ẩ

* Ngoai ra, môt vai ph̀ ̣ ̀ ương phap khac cung đa đ́ ́ ̃ ̃ ược nghiên c u đê đinh lứ ̉ ̣ ượng PQ trong mau nh : miên dich phong xa [14], điên di mao quan [38]…́ ư ̃ ̣ ́ ̣ ̣ ̉

1.3. Các phương pháp x  lý m u huy t tử ẫ ế ương phân tích Paraquat

M t trong nh ng y u t  quy t đ nh đ n hi u qu  c a phộ ữ ế ố ế ị ế ệ ả ủ ương pháp đ nh lị ượng đó là 

phương pháp x  lý m u.ử ẫ

Có r t nhi u nghiên c u s  d ng k  thu t chi t pha r n đ  x  lý m u sinh h c trongấ ề ứ ử ụ ỹ ậ ế ắ ể ử ẫ ọ  phân tích PQ [5][16][20][28][41]. M t s  tác gi  dùng đ m phosphate đ  thêm vào m u th  trộ ố ả ệ ể ẫ ử ướ  ckhi cho qua c t chi t pha r n [5][16][41]. ộ ế ắ

C t chi t pha r n C18ộ ế ắ  thường được dùng đ  chi t ể ế PQ & DQ trong m u thẫ ử [20]. Dung 

d ch m u đã lo i protein đị ẫ ạ ược ch nh pH đ n 11 b ngỉ ế ằ  NaOH. C t độ ược ho t hóa b ng 5 mạ ằ l nướ  c,

5 ml methanol và 20 ml nước trước khi b m m u vào c t. 3 mơ ẫ ộ l nước c t đấ ược b m qua c t đơ ộ ể 

lo i b  hoàn toàn các h p ch t khác trong máu. Sau đó, 3 ml acid hydrochloric 0,2 M và 1 mạ ỏ ợ ấ l × 3 

nước kh  khoáng đử ược cho qua c t đ  r a gi i PQ & DQ. V i d ch thu độ ể ử ả ớ ị ược thêm 3 ml dung 

d ch ị NaOH 0.2 M. M u này đẫ ược mang đi đo quang [20]

Chang­bin Li [5] cũng dùng c t C18 đ  chi t PQ, c t độ ể ế ộ ượ ửc r a v i 2 mớ l methanol và 2 ml 

đ m phosphate (pH 8,0). Dung d ch m u đệ ị ẫ ược đ a qua c t r i r a v i 2 mư ộ ồ ử ớ l nước kh  khoáng.ử  

Cu i cùng, r a gi i v i 2 mố ử ả ớ l methanol và d ch r a gi i đị ử ả ược bay h i   nhi t đ  phòng dơ ở ệ ộ ưới dòng khí nitrogen. Hòa tan c n trong 100 µắ l methanol và b m 1 µơ l vào h  th ng GC­MS.ệ ố

Zhaohong Wang [41] x  lýử  1,0 ml máu, thêm 3 ml đ m phosphate 0,1M (pH 7) và dungệ  

d ch chu n n i 100ị ẩ ộ  ng/ml. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 10 phút. Các c t Waters Oasis WCX 3 mộ l 

được cho ch y qua l n lạ ầ ượt 3 ml methanol, 3 ml nước kh  khoáng và 1 mử l đ m phosphate 0,1 Mệ  (pH 7). Sau khi cho m u ch y qua c t, r a c t v i 3 mẫ ạ ộ ử ộ ớ l đ m phosphate 0,1 M (pH 7), 3 mệ l nướ  c

kh  khoáng và 3 mử l methanol. S y khô chân không c t trong 10 phút. Ch t phân tích đấ ộ ấ ượ ử  c r a

gi i b ng 2 mả ằ l dung d ch acid formic 2% trong acetonitrile 80%. Bay h i d ch r a gi i b ng dòngị ơ ị ử ả ằ  khí nitrogen   45ở oC. Hòa tan c n b ng 50  ắ ằ μl  pha đ ng (dung d ch acetonitrile và ammoniumộ ị  formate 250 mM t  l  1:1).ỉ ệ

Proenca P [28] x  ly mâu băng cach lây 1 mử ́ ̃ ̀ ́ ́ l máu ho c 1 mặ l nước ti u thêm 50 µể l chu nẩ  

n i (10 µg/mộ l) và 2 ml acetonitrile. L c, ly tâm 2500 ắ vòng/phút trong 10 phút. C t chi t pha r nộ ế ắ  (Oasis, 3 cc) đượ ửc r a v i l n lớ ầ ượt 1 ml methanol và 1 ml nước kh  khoáng. Đ a m u qua c tử ư ẫ ộ  

chi t pha r n. R a c t v i 1 mế ắ ử ộ ớ l đ m phosphate pH 7,1 mệ l nước kh  khoáng và 1 mử l methanol. Sau khi làm khô 10 phút trong chân không, r a gi i c t v i 1,5 mử ả ộ ớ l acetonitrile/water/TFA (84:14:2, v/v/v). D ch r a gi i đị ử ả ược bay h i đ n c n dơ ế ắ ưới dòng khí nitrogen   40ở oC. C n đắ ược hòa tan trong 100 µl methanol và b m 10 µơ l vào h  th ng LC­ESI­MS.ệ ố

Kyoko KATO, P. Paixão đ u dùng acid perchloric đ  lo i protein [20][26].ề ể ạ  Tuy nhiên, m tộ  

s  công trình khác s  d ng acid trichloracetic đ  k t t a protein trong m u huy t tố ử ụ ể ế ủ ẫ ế ương [7][17][24][30] r t đ n gi n và cho hi u qu  cao vì v y có th  áp d ng r ng rãi   các đ n v  xétấ ơ ả ệ ả ậ ể ụ ộ ở ơ ị  nghi m. ệ

Phương pháp này đượ Rai M.K. và c ng sc  ộ ự áp d ng đ  đ nh l ng ụ ể ị ượ PQ trong máu, nướ  c

ti u và s a m  Thêm 1 mể ữ ẹ l dung d ch EDTA 5% và 1mị l acid trichloracetic 1% vào đ  lo i s   nhể ạ ự ả  

hưởng c a các ion kim lo i và lo i protein. Ly tâm 1850ủ ạ ạ  vòng/phút trong 10 phút. L y ph n d chấ ầ ị  trong   trên đem đo quang [30].ở

Huy t tế ương s ch và các dung d ch huy t tạ ị ế ương chu n PQ 50 và 10 ẩ μg/ml được thêm TCA 20% (t  l  6:1). L c xoáy, li tâm 13000ỉ ệ ắ  vòng/phút trong 5 phút. L y d ch trong ph n trên điấ ị ầ  

đo quét bước sóng t  200 đ n 300 nm [24].ừ ế

Arys K [7] x  ly mâu băng cach lây 1 mử ́ ̃ ̀ ́ ́ l (ho c 1 g) m u, thêm 50 µặ ẫ l chu n n i và thêmẩ ộ  

nước v a đ  4 mừ ủ l. T a protein b ng acid trichloroacetic là bủ ằ ước làm s ch đ u tiên c a các m uạ ầ ủ ẫ  máu, gan, th n. Thêm 1,5 mậ l dung d ch acid trichloroacetic 25%, l c 10 phút, ly tâm 400ị ắ  vòng/phút trong 5 phút. Sau khi chuy n d ch trong   trên saể ị ở ng  ng nh a s ch, ph n t a protein phía dố ự ạ ầ ủ ướ  i

được hòa tan l i b ng 2,5 mạ ằ l  dung d ch   acid trichloroacetic 5%, l c 10 phút, ly tâm 1100ị ắ  vòng/phút trong 5 phút, g p ph n d ch trong l i, chuy n sang  ng silan hóa. Tuy nhiên   m tộ ầ ị ạ ể ố ở ộ  

s  trố ường h p đã đợ ược ch ng minh c n thêm bứ ầ ước ly tâm n a (2200 ữ vòng/phút trong 10 phút) 

đ  thu để ược ph n d ch s ch hoàn toàn. Đ i v i nầ ị ạ ố ớ ước ti u và d ch d  dày, bể ị ạ ước lo i proteinạ  

có th  b  qua và làm ngay bể ỏ ước ti p theo là kh  PQ b ng natri borohydride. Đi u ch nh pHế ử ằ ề ỉ  

c a dung d ch đ n pH l n h n 10 b ng 1 mủ ị ế ớ ơ ằ l NaOH 1M (đ i v i nố ớ ước ti u và d ch d  dày)ể ị ạ  

ho c 1 mặ l NaOH 5M (đ i v i các m u khác). Sau đó, thêm 250 mg b t NaBHố ớ ẫ ộ 4 và l c   60ắ ở oC trong 25 phút. Sau khi làm mát   nhi t đ  phòng, chi t dung d ch v i 8 mở ệ ộ ế ị ớ l diethyl ether b ngằ  máy trong 15 phút. Sau khi ly tâm (1100 vòng/phút trong 10 phút), chuy n l p h u c  phía trênể ớ ữ ơ  sang  ng silan hóa hình nón. Bay h i d ch chi t đ n khô b ng dòng khí nitrogen. C n đố ơ ị ế ế ằ ắ ượ  chòa tan trong 60 µl pha đ ng (dung d ch A : dung d ch B là 50:50, v/v) và tiêm 50 µộ ị ị l vào hệ 

th ng HPLC.ố

Theo nghiên c u c a ứ ủ Shuuji Hara và c ng s ộ ự [17] ch  c n l y 200 µỉ ầ ấ l huy t thanh tr n v iế ộ ớ  

20 µl dung d ch n i chu n (10 µg/mị ộ ẩ l) và 120 µl TCA 10% và l c xoáy trong 20 giây, ly tâm 1000ắ  vòng/phút trong 5 phút. Sau đó, l y 20 µấ l d ch n i   trên b m vào máy.ị ổ ở ơ

Tóm l i, t ng quan tài li u tham kh o cho th y vi c đ nh lạ ổ ệ ả ấ ệ ị ượng PQ trong m u huy tẫ ế  

tương ch  y u đủ ế ược th c hi n b ng phự ệ ằ ương pháp HPLC. Trong đó m u huy t tẫ ế ương được lo iạ  

b  protein b ng cách k t t a v i TCA và đ nh lỏ ằ ế ủ ớ ị ượng trên h  HPLC c t tách C8 dung môi phaệ ộ  

đ ngộ  theo th  tích (5:95) g m ACN – Đ m photphat pH=2,5 g m ể ồ ệ ồ (natri heptanesulfonate; KCl; PEG ; triethylamine; MeOH)

CH ƯƠ NG 2:  Đ I T Ố ƯỢ NG  VÀ PH ƯƠ NG PHÁP NGHIÊ N C U Ứ

2.1. Đ i tố ượng nghiên c uứ

Đ  xây d ng và  ể ự xác đ nh giá tr  s  d ng c aị ị ử ụ ủ   ph ng pháp phân tích Pươ Q  trong huy tế  

tương người, chúng tôi ti n hành nghiên c u trên các đ i tế ứ ố ượng sau:

­ M u tr ng: là huy t t ng ng i c a vi n Huy t h c và truy n máu ẫ ắ ế ươ ườ ủ ệ ế ọ ề trung  ngươ

­ M u chu n: là m u tr ng đ c thêm l ng xác đ nh Pẫ ẩ ẫ ắ ượ ượ ị Q t o thành mâu.ạ ̃

­ M u th : là huy t tẫ ử ế ương b nh nhân ng  đ c Pệ ộ ộ Q thu đượ ừ ẫc t  m u máu, ly tâm l yấ  

­ Các dung môi dùng cho s c ký l ng hi u năng cao (MeOH, ACN  ) c a hãng Merckắ ỏ ệ ủ

­ KCl tinh th , đ  tinh khi t: 99,5% c a hãng Merck.ể ộ ế ủ

­ Acid trichloroacetic tinh khi t 98,5% c a hãng Merck.ế ủ

­ Acid phosphoric (H3PO4) đ c (d=1,685 g/cmặ 3) c a hãng Merck.ủ

­ Các dung môi, hoá ch t dùng đ  x  lý m u c a hãng Merck và đ t tiêu chu n tinh khi tấ ể ử ẫ ủ ạ ẩ ế  phân tích (P.A.)

­ Nướ ấ ử ục c t s  d ng là nướ ấc c t hai l n đã đầ ược deion hoá

­ Dung d ch   đ m  pha đ ng pH = 2,5  đị ệ ộ ược chu n b  b ng cách  sau: g m 1,1 g  ẩ ị ằ ồ natri heptanesulfonate; 2 g KCl; 2 ml polyetylenglycol 400; 200 ml MeOH; 0,5 ml triethylamine thêm 

nước xâp xi 1000 ml. Đi u ch nh pH c a pha đ ng b ng H́ ̉ ề ỉ ủ ộ ằ 3PO4 đ n các giá tr  pH mong mu n.ế ị ố  

Đ nh m c v a đu 1000 ml băng nị ứ ừ ̉ ̀ ươc deion.́  

­ Pha   dung   d ch   chu n   g c   PQ:ị ẩ ố   Hòa   tan   100   mg   ch t   chu n   paraquat  ấ ẩ dichloride (C12H14Cl2N2.xH2O), hòa tan trong 100 ml nước đ  để ược dung d ch g c. T  đó pha thành các dungị ố ừ  

d ch chu n th  c p có n ng đ  0,1 ­ 20 ị ẩ ứ ấ ồ ộ µg/ml trong nước. Tr n các n ng đ  dung d ch chu n thộ ồ ộ ị ẩ ứ 

c p v i huy t tấ ớ ế ương tr ng đ  có n ng đ  ắ ể ồ ộ PQ 0,02 ­ 10 µg/ml đ  kh o sát và ể ả xác đ nh giá tr  sị ị ử 

d ng c a phụ ủ ương pháp. 

2.2.3. Thi t b , d ng c ế ị ụ ụ

Thi t b ế ị

­ Thi t b  s c ký l ng hi u năng cao Agilent 1200, g m b m tr n dung môi gradient ápế ị ắ ỏ ệ ồ ơ ộ  

su t cao, b  đu i khí tr c tuy n b ng chân không, bu ng  n nhi t, thi t b  tiêm m u t  đ ng,ấ ộ ổ ự ế ằ ồ ổ ệ ế ị ẫ ự ộ  detector m ng ả Diode (DAD), th  vi n ph  đ c ch t s  d ng detector m ng Diode, máy tính, máyư ệ ổ ộ ấ ử ụ ả  in

­ C t pha đ o Agilent C8 (ộ ả 150 mm x 4,6 mm; 5 µm) và c tộ  b o vả ệ C8 (20 mm x 4,0 mm, 

­ Ống nghi m l y máu ch a EDTA và  ng nghi m có nút xoáy.ệ ấ ứ ố ệ

T t c  các d ng c  th y tinh đ u ph i đấ ả ụ ụ ủ ề ả ượ ử ạc r a s ch, tráng b ng nằ ước c t, sau đó trángấ  

b ng MeOH và đ  khô, tráng n­hexan 3 l n sau đó s y   105ằ ể ầ ấ ở oC trong vòng 1 gi , l y ra đ  ngu iờ ấ ể ộ  

nước và các dung môi, chúng tôi l a ch n nự ọ ước đ  hòa tan PQ vì nể ước không đ c h i, thân thi nộ ạ ệ  

v i môi trớ ường h n EtOH,  MeOH. ơ

2.3.1.2. Ph ươ ng pháp tách PQ t  huy t t ừ ế ươ ng

D a theo tính ch t lý hóa c a PQ, theo các tài li u đã công b  va trang thiêt bi phong thiự ấ ủ ệ ố ̀ ́ ̣ ̀ ́ nghiêm, chúng tôi ti n hành kh o sát các đi u ki n đ  tách PQ t  huy t ṭ ế ả ề ệ ể ừ ế ương nh  sau:ư

V i 1 mớ l m u huy t tẫ ế ương, thêm dung dich TCA đ  lo i protein, l c xoáy và ly tâm v ị ể ạ ắ ớ  

n ng đ  dung dich TCA thay đ i là: 2,0%ồ ộ ̣ ổ ; 4,0%; 5,0%; 6,0% và th i gian l c xoáy: 30 ờ ắ giây, 1 phút, 2 phút

2.3.1.3. Ph ươ ng pháp k h o sát đi u ki n s c ký đ  đ nh l ả ề ệ ắ ể ị ượ ng PQ trong huy t t ế ươ ng

Đ  đánh giá kh  năng tách PQ ra kh i n n m u huy t tể ả ỏ ề ẫ ế ương, các m u chu n chi t PQẫ ẩ ế  trong n n m u đề ẫ ược chu n b  b ng cách cho TCA, l c xoáy, ly tâm, l c r i ch y s c ký. D aẩ ị ằ ắ ọ ồ ạ ắ ự  trên tR, AS, RSD đánh giá tính phù h p c a đi u ki n đo.ợ ủ ề ệ

* C t s c ký: C t tách có vai trò quan tr ng trong vi c quy t đ nh quá trình tách có độ ắ ộ ọ ệ ế ị ộ phân gi i t t hay không [ả ố 3]. Đ  ch n lo i pha tĩnh phù h p c n căn c  vào c u trúc phân t  vàể ọ ạ ợ ầ ứ ấ ử  

đ  phân c c c a ch t phân tích. D a trên kh o sát các tài li u tham kh o và đi u ki n c  s  v tộ ự ủ ấ ự ả ệ ả ề ệ ơ ở ậ  

ch t s n có t i Trung tâm Ch ng đ c, chúng tôi s  d ng c t pha đ o Agilent C8 (150 mm x 4,6ấ ẵ ạ ố ộ ử ụ ộ ả  mm; 5 µm) và c tộ  b o vả ệ C8 (20 mm x 4,0 mm, 5 μm) trong nghiên c u này.ứ

* Bước sóng ( ): là c c đ i h p th  c a PQ trong m u th , xác đ nh c c đ i h p th  c aλ ự ạ ấ ụ ủ ẫ ử ị ự ạ ấ ụ ủ  

PQ d a vào ph  h p th  UV trong kho ng 210 ­ 400 nm theo máy ự ổ ấ ụ ả s c ký l ng hi u năng caoắ ỏ ệ  Agilent 1200, detector DAD

* Th  tích tiêm m u: thay đ i th  tích tiêm m u t  10 ­ 50 µể ẫ ổ ể ẫ ừ l

* Pha đ ng: d a vào các tài li u tham kh o, ti n hành kh o sát các h  pha đ ng có khộ ự ệ ả ế ả ệ ộ ả năng tách, th i gian l u phù h p và cho các pic cân đ i thu n l i cho phân tích đ nh lờ ư ợ ố ậ ợ ị ượng g mồ  các h  pha đ ng sau:ệ ộ

­ H  A: Kênh 1 là h n h p dung d ch ệ ỗ ợ ị NaOH 0,0125M trong nước và kênh 2 là dung d chị  NaOH 0,0125M trong methanol. T c đ  dòng 0,5 mố ộ l/phút. T  l  th  tích 2 kênh tỷ ệ ể ương  ng là 90 :ứ  10

­ H  B: G m kênh 1 là ACN kênh 2 là dung d ch đ m pH = 3 (10:90, v/v). Thành ph nệ ồ ị ệ ầ  

đ m g m acid 1 ­ octanesulphonic 3,0 mM; acid orthophosphoric 0,1 M trong 900 mệ ồ l nước khử khoáng đi u ch nh pH đ n 3,0 b ng diethylamine.ề ỉ ế ằ

­ H  C: ACN – dung d ch đ m (5:95, v/v) pH = 2,5 g m 1,1 g ệ ị ệ ồ natri heptanesulfonate; 2 g KCl; 2 ml polyetylenglycol 400; 0,5 ml triethylamine; 200 ml MeOH thêm nước xâp xi 1000 ḿ ̉ l. 

Đi u ch nh pH b ng Hề ỉ ằ 3PO4 đ c. Đ nh m c v a đu 1000 mặ ị ứ ừ ̉ l băng ǹ ươ  deion. ć

* Sau khi ch n đọ ược h  dung môi pha đ ng phù h p chúng tôi tiên hanh kh o sát thànhệ ộ ợ ́ ̀ ả  

ph n c a pha đ ng. Giá tr  pH pha đ ng cũng đầ ủ ộ ị ộ ược kh o sát trong kho ng t  2,5 đ n 4,5.ả ả ừ ế

*   Kh o   sát   thành   ph n   dung   d ch   đ m:   n ng   đ  ả ầ ị ệ ồ ộ natri   heptanesulfonate,   KCl   & polyethylenglycol

* T c đ  dòng: thay đ i t c đ  pha đ ng t  0,2 ­ ố ộ ổ ố ộ ộ ừ 0,8 ml/phút đ  xác đ nh để ị ượ ốc t c độ phù h p cho m t th i gian l u t i  u.ợ ộ ờ ư ố ư

* Các k t qu  thu đế ả ượ ức  ng v i t ng kh o sát đớ ừ ả ược đánh giá, so sánh v  th i gian l uề ờ ư  

c a các ch t phân tích (tủ ấ R), đ  phân gi i (Rộ ả S) và h  s  đ i x ng pic (Aệ ố ố ứ S). Phương pháp đánh giá này d a trên lý thuy t Van Deemter sao cho 0,9 < Aự ế S < 1,2, tR c a các ch t ph i không quá l nủ ấ ả ớ  

Chu n b  các m u huy t tẩ ị ẫ ế ương tr ng, thêm PQ đ  thu đắ ể ược các m u chu n có n ng đẫ ẩ ồ ộ 

PQ t  0,02 ­ 10 µg/mừ l. Chúng tôi xây d ng đự ường chu n v i 8 n ng đẩ ớ ồ ộ PQ được them vào m uẫ  huy t tế ương tr ngắ  l n lầ ượt là 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 5 và 10 µg/ml. Sau đó x  lý m u vàử ẫ  

ti n hành phân tích.ế

2.3.2.3. Gi i h n phát hi n và gi i h n đ nh l ớ ạ ệ ớ ạ ị ượ ng

Ti n hành x  lý các m u huy t tế ử ẫ ế ương tr ng và m u chu n có n ng đ  kho ng 0,01 ­ 0,1ắ ẫ ẩ ồ ộ ả  µg/ml và phân tích trên h  th ng HPLC, tính đ  l ch chu n c a phệ ố ộ ệ ẩ ủ ương trình h i quy và xác đ nhồ ị  LOD theo quy t c 3 , LOQ theo quy t c 10  ắ ϭ ắ ϭ

2.3.2.4. Đánh giá đ  đúng (đ  thu h i) và đ  ch m (đ  l p l i) ộ ộ ồ ộ ụ ộ ặ ạ

­ Đ  đúng ộ : chu n b  các m u PQ trong huy t tẩ ị ẫ ế ương tr ng   ắ ở 5 n ng đ  khác nhau, m iồ ộ ỗ  

n ng đ  làm 5 l n, x  lý m u và phân tích s c ký r i so sánh giá tr  trung bình gi a các l n đ nhồ ộ ầ ử ẫ ắ ồ ị ữ ầ ị  

lượng c a m i n ng đ  v i giá tr  ủ ỗ ồ ộ ớ ị ch t thêm vào ấ trong m u.ẫ

­ Đ  l p l i:  ộ ặ ạ

+ Đ  l p l i trong ngàyộ ặ ạ : chu n b  các m u PQ trong huy t tẩ ị ẫ ế ương tr ng   3 n ng đ  khácắ ở ồ ộ  nhau, m i n ng đ  làm 5 l n, x  lý m u và phân tích s c ký nh  ph n đ  đúng, đánh giá đ  l chỗ ồ ộ ầ ử ẫ ắ ư ầ ộ ộ ệ  chu n tẩ ương đ i c a các m u theo t ng n ng đ ố ủ ẫ ừ ồ ộ

+ Đ  l p l i khác ngàyộ ặ ạ   : ti n hành tế ương t  nh  trên nh ng làm   5 ngày khác nhau.ự ư ư ở

2.3.2.5. Đ   n đ nh ộ ổ ị

Xác đ nh đ   n đ nh c a ch t phân tích trong d ch sinh h c trong th i gian phân tích vàị ộ ổ ị ủ ấ ị ọ ờ  

th i gian b o qu n.  ờ ả ả

­ Đ   n đ nh trong th i gian phân tích ộ ổ ị ờ : chu n b  3 m u PQ n ng đ  1 µg/mẩ ị ẫ ồ ộ l trong huy tế  

tương, x  lý m u r i ti n hành s c ký ngay và ti p t c c  m i gi  1 l n trong vòng 5 giử ẫ ồ ế ắ ế ụ ứ ỗ ờ ầ ờ, xác 

đ nh RSDị r

­ Đ   n đ nh trong th i gian b o qu n ộ ổ ị ờ ả ả : chu n b  3 m u nh  trên, l y 1 ph n ra x  ẩ ị ẫ ư ấ ầ ử lý và 

ti n hành s c ký ngay, ph n còn l i b o qu n   ­30ế ắ ầ ạ ả ả ở oC trong 21 ngày. L y các m u đang b oấ ẫ ả  

qu n ra đ  x  lý và ti n hành s c ký ngay vào các ngày th  7, 14 và 21.ả ể ử ế ắ ứ

2.3.3. Phân tích PQ trong m u huy t t ẫ ế ươ ng b nh nhân ệ  ­ áp d ng th c t  tiên l ụ ự ế ượ ng b nh ệ  

nhân và đánh giá hi u qu  l c máu h p ph ệ ả ọ ấ ụ

2.3.3.1. Đ i t ố ượ ng nghiên c u ứ

31 b nh nhân ng  đ c PQ đi u tr  t i Trung tâm Ch ng đ c b nh vi n B ch Mai t  thángệ ộ ộ ề ị ạ ố ộ ệ ệ ạ ừ  

3 đ n tháng 5 năm 2015.ế

Ch n đoán ng  đ c ẩ ộ ộ PQ d a vào: b nh nhân có 1 trong 2 tiêu chu n:ự ệ ẩ

­ B nh nhân u ng thu c tr  c  PQ và có bi u hi n lâm sàng ng  đ c ệ ố ố ừ ỏ ể ệ ộ ộ PQ

­ Xét nghi m đ nh tính đ c ch t nệ ị ộ ấ ước ti u tìm th y ể ấ PQ

2.3.3.2. Tiêu chu n lo i tr  b nh nhân ẩ ạ ừ ệ

­  B nh nhân có ti n s  b nh ph i, th n, gan.ệ ề ử ệ ổ ậ

­ Tên lo i thu c tr  c  có ạ ố ừ ỏ PQ, hàm lượng PQ trong thu c tr  c , lố ừ ỏ ượng PQ u ng,ố  

th i gian đ n vi n, th i gian b t đ u đi u tr ờ ế ệ ờ ắ ầ ề ị

­ Tri u ch ng lâm sàng, c n lâm sàng.ệ ứ ậ

­ Đi u tr  l c máu h p ph  đề ị ọ ấ ụ ược áp d ng.ụ

­ Các đi u tr  khác: than ho t,  c ch  mi n d ch, li u pháp lipid. ề ị ạ ứ ế ễ ị ệ

Các s  li u này đố ệ ược dùng trong đánh giá hi u qu  đi u tr  và m c đ  nhi m đ cệ ả ề ị ứ ộ ễ ộ

* L y m u đ nh lấ ẫ ị ượng PQ huy t tế ương khi vào vi n, trệ ước và sau các l n l c máuầ ọ  

h p ph :ấ ụ

­ Ti n hành l y máế ấ u b nh nhân ng  đ c PQệ ộ ộ  đi u tr  t i Trung tâm Ch ng đ c ề ị ạ ố ộ b nh vi nệ ệ  

B ch Mai ngay vào vi n ạ ệ khi đượ ch n đoán c  ẩ xác đ nh ng  đ c PQ. Các b nh nhân l c máu h pị ộ ộ ệ ọ ấ  

ph  đụ ượ ấc l y máu ngay trước và sau l c. L y máu tĩnh m ch cánh tay vào  ng nghi m có ch aọ ấ ạ ố ệ ứ  EDTA, ly tâm l y huy t tấ ế ương

­ M u huy t tẫ ế ương được x  lý và phân tích b ng phử ằ ương pháp HPLC đã xây d ng. M iự ỗ  

m u đẫ ược phân tích l p l i 3 l n (n=3), tính k t qu  trung bình. Phặ ạ ầ ế ả ương pháp đ nh lị ượng là 

phương pháp đường chu n.ẩ

­ K t qu  n ng đ  PQ trong m u (µg/mế ả ồ ộ ẫ l) trong dung d ch th  đị ử ược tính d a vào đự ườ  ngchu n.ẩ

* Thu th p k t qu  đi u tr  T  l  t  vong t i vi n, sau 3 tháng: ghi s  đi n tho iậ ế ả ề ị ỷ ệ ử ạ ệ ố ệ ạ  

c a BN và ngủ ười nhà, g i đi n tho i xác đ nh tình tr ng BN s ng/t  vong sau 3 tháng.ọ ệ ạ ị ạ ố ử

Các ch  s  nghiên c u chính: ỉ ố ứ

* T  l  t  vong sau 3 tháng ỷ ệ ử

*  N ng đ  ồ ộ PQ  huy t tế ương khi vào vi n, dùng n ng đ  này tính đi m  ệ ồ ộ ể SIPP  s a đ iử ổ  (severity index of PQ poisoning: ch  s  đ  ỉ ố ộ n ngặ  c a ng  đ c PQ)ủ ộ ộ  – liên quan t  l  t  vong.ỉ ệ ử

SIPP = [n ng đồ ộ PQ huy t tế ương (µg/ml)] × [th i gian ờ t  khi u ng ừ ố đ n b t đ u ế ắ ầ đ nh lị ượng (h)]

* Hi u qu  l c PQ c a l c máu h p ph  (HP) (d a vào n ng đ  ệ ả ọ ủ ọ ấ ụ ự ồ ộ PQ huy t tế ương trước và sau các l n l c máu h p ph )ầ ọ ấ ụ

*X  lý s  li u: ử ố ệ   b ng ph n m m SPSS for Windows 16.0. S  li u đằ ầ ề ố ệ ược trình bày dướ  i

d ng trung bình ± đ  l ch chu n, ho c trung v  và t  phân v  n u phân b  không chu n, đánh giáạ ộ ệ ẩ ặ ị ứ ị ế ố ẩ  giá tr  tiên lị ượng t  vong c a n ng đ c Paraquat vào vi n b ng cách tính di n tích dử ủ ồ ộ ệ ằ ệ ướ ườ  i đ ngROC, so sánh giá tr  n ng đ c Paraquat giá tr  trị ồ ộ ị ước sau đi u tr  b ng test Wilcoxon.ề ị ằ

CH ƯƠ NG 3: K T QU  VÀ TH O LU N Ế Ả Ả Ậ

3.1. T i  u hoa cac đi u ki n ch y s c lý l ng hi u năng caoố ư ́ ́ ề ệ ạ ắ ỏ ệ

3.1.1. Xác đ nh b ị ướ c sóng phát hi n ch t phân tích v i detector DAD ệ ấ ớ

Detector là b  ph n theo dõi phát hi n các ch t tan trong pha đ ng t  c t s c ký ch y raộ ậ ệ ấ ộ ừ ộ ắ ả  

m t cách liên t c. Nó là m t b  ph n thu nh n và phát hi n các ch t hay h p ch t d a theo m tộ ụ ộ ộ ậ ậ ệ ấ ợ ấ ự ộ  tính ch t nào đó c a ch t phân tíchấ ủ ấ  [4]. Paraquat là ch t có tính h p th  quang t t trong vùng UVấ ấ ụ ố  

do đó detector DAD (Diode ­ Array Detector) r t t t cho vi c đ nh tính và đ nh lấ ố ệ ị ị ượng ch t phânấ  tích. 

Trong quá trình nghiên c u, chúng tôi đã ki m tra ph  h p th  ánh sáng c a PQ trong d iứ ể ổ ấ ụ ủ ả  

bước sóng 210 t i 400 nm trên thi t b  s c ký l ng hi u năng cao Agilent 1200 v i detector DAD.ớ ế ị ắ ỏ ệ ớ  

Hình 3.: Phô hâp thu UV cua PQ̉ ́ ̣ ̉

K t qu  trên cho th y PQ h p th  ánh sáng c c đ i t i bế ả ấ ấ ụ ự ạ ạ ước sóng 259 nm. Do đó chúng tôi ch n bọ ước sóng phát hi n ch t phân tích đ i v i PQ ệ ấ ố ớ là 259 nm

3.1.2. Kh o sát  nh h ả ả ưở ng c a th  tích m u tiêm vào c t ủ ể ẫ ộ

Trên th c t , m t trong nh ng khó khăn c a phép tách s c ký là: s  doãng chân pic d nự ế ộ ữ ủ ắ ự ẫ  

đ n hi n tế ệ ượng ch ng pic, trong đó th  tích b m m u vào c t cũng là m t nguyên nhân gây raồ ể ơ ẫ ộ ộ  

hi n tệ ượng này; n u lế ượng m u b m vào c t quá l n d n đ n hi n tẫ ơ ộ ớ ẫ ế ệ ượng m t ph n m u vàoộ ầ ẫ  

c t tách trộ ước, m t ph n ra sau d n đ n trong quá trình tách trên c t s  có m t ph n ch t phânộ ầ ẫ ế ộ ẽ ộ ầ ấ  tích ra trước và m t ph n ra sau gây ra hi n tộ ầ ệ ượng doãng chân pic. Tuy nhiên, n u th  tích b mế ể ơ  

m u là quá nh  thì sai s  s  r t l n. H  th ng HPLC Agilent 1200 có trang b  b  ph n tiêm m uẫ ỏ ố ẽ ấ ớ ệ ố ị ộ ậ ẫ  

t  đ ng do đó chúng tôi ti n hành kh o sát đ  l a ch n th  tích m u tiêm vào c t sao cho hi uự ộ ế ả ể ự ọ ể ẫ ộ ệ  

qu  tách là t t nh t. Th  tích tiêm m u đả ố ấ ể ẫ ược khao sat gi i h n trong kho ng 10 µl đ n 50 µl.̉ ́ ớ ạ ả ế  

Quá trình kh o sát đả ược th c hi n trong đi u ki n c  đ nh nh  sau: s  d ng pha đ ng là ACN –ự ệ ề ệ ố ị ư ử ụ ộ  dung d ch đ m pH 2,5 (5:95, v/v) v i t c đ  dòng là 0,5 ml/phút, PQ có n ng đ  5,0 µg/ml.ị ệ ớ ố ộ ồ ộ

Hình 3.: Săc đô khao sat thê tich b m mâú ̀ ̉ ́ ̉ ́ ơ ̃a: 10 µl,     b: 20 µl,     c: 30 µl,     d: 40 µl,      e: 50 µl

B ng 3.:  nh hả Ả ưởng c a thê tich b m mâu ủ ̉ ́ ơ ̃

Thê tich tiêm mẩ ́ ̃u (µl) Th i gian l uờ ư  (phut́) AS

Nh n xét th y th  tích m u tiêm vào c t  nh hậ ấ ể ẫ ộ ả ưởng rõ r t đ n k t qu  phân tích. N uệ ế ế ả ế  

lượng m u tiêm vào côt nho h n 30 μl thì pic c a PQ s  không đ i x ng t t, giá tr  di n tích picẫ ̣ ̉ ơ ủ ẽ ố ứ ố ị ệ  

c a các pic này nho, chiêu cao pic thâp không chính xác và d n t i k t qu  phân tích sai. Con v iủ ̉ ̀ ́ ẫ ớ ế ả ̀ ơ  ́thê tich mâu l n h n 30 μl thi pic bi keo đuôi, đi u này đ̉ ́ ̃ ớ ơ ̀ ̣ ́ ề ược gi i thích theo thuy t t c đ  (thuy tả ế ố ộ ế  Van Deemter), khi lượng m u tăng thì s  đĩa lý thuy t (N) c a c t gi m, đ  phân gi i gi m theoẫ ố ế ủ ộ ả ộ ả ả  

vì RS    [10]. K t qu  trong b ng 3.1 cho th y, v i lế ả ả ấ ớ ượng m u tiêm vào c t là 30 μl thì cho k tẫ ộ ế  

qu  tách t t nh t. Vì v y, chúng tôi ch n th  tích m u tiêm vào c t là 30 μl cho các kh o sát ti pả ố ấ ậ ọ ể ẫ ộ ả ế  theo.   

3.1.3. Khao sat́ ̉  l a ch n  ự ọ loaị pha đ ng ộ

Kh o sát kh  năng phân tách PQ trong huy t tả ả ế ươ  tr ngng ắ  v i các h  pha đ ng ớ ệ ộ chu n bẩ ị 

nh  trong m c 2.3.1.3. S c đ  quá trình tách PQ ra kh i n n m u khi s  d ng các h  khác nhauư ụ ắ ồ ỏ ề ẫ ử ụ ệ  thu đượ ởc   hình 3.3, hình 3.4, hình 3.5

Hình 3.: Săc đô phân tích PQ v i hê dung môi A (́ ̀ ớ ̣ dung d ch ị NaOH 0,0125M trong nước và 

dung d ch NaOH 0,0125M trong methanol theo t  l  90:10, v/v)ị ỷ ệ

Hình 3.: Săc đô phân tích PQ v i hê dung môi B́ ̀ ớ ̣(ACN và dung d ch đ m pH = 3 t  l  ị ệ ỷ ệ 10:90, v/v)

Hình 3.: Săć đô phân tích PQ v i hê dung môi C̀ ớ ̣(ACN ­ dung d ch đị ệ  t  l  5:95, v/v)m ỷ ệ

K t qu  kh o sát cho th y s  d ng h  pha đ ng ACN ­ đ m (5:95, v/v) pha tĩnh c tế ả ả ấ ử ụ ệ ộ ệ ộ  C8 là phù h p nh t, có kh  năng tách t t và ch n l c đ i v i PQ trong huy t tợ ấ ả ố ọ ọ ố ớ ế ương, cho pic cân đ i và có th i gian l u h p lý. Do v y trong nghiên c u này chúng tôi s  d ng c t C8 vàố ờ ư ợ ậ ứ ử ụ ộ  

ch n h  dung môi ACN ­ Đêm (5:95, v/v) làm pha đ ng.ọ ệ ̣ ộ

3.1.4. Khao sat́ ̉  thành ph n pha đ ng ầ ộ

Thành ph n pha đ ng  nh hầ ộ ả ưởng r t l n đ n hi u qu  tách ch t. Pha đ ng có th   nhấ ớ ế ệ ả ấ ộ ể ả  

hưởng t i nh ng v n đ  sau trong phép tách s c ký:ớ ữ ấ ề ắ

­ Đ  ch n l c c a h  phaộ ọ ọ ủ ệ

­ Th i gian l u tr  c a ch t tanờ ư ữ ủ ấ

­ Hi u l c c t tách (đ i lệ ự ộ ạ ượng Nef)

­ Đ  phân gi i c a ch t trong m t pha tĩnhộ ả ủ ấ ộ

­ Đ  r ng c a pic s c kýộ ộ ủ ắ

Pha đ ng trong s c ký l ng hi u năng cao thộ ắ ỏ ệ ường là nước có tr n v i m t s  dung môiộ ớ ộ ố  

h u c  đ  thu đữ ơ ể ược dung d ch có đ  phân c c t  cao t i th p, phù h p v i quá trình tách. Căn cị ộ ự ừ ớ ấ ợ ớ ứ theo tài li u s  [ệ ố 3] ta có ch  s  đ  phân c c c a nỉ ố ộ ự ủ ước là 10,2 đ n v , c a ACN là 5,8 đ n v , tơ ị ủ ơ ị ừ 

đó ta tính được đ  phân c c c a các h  dung d ch pha đ ng ACN và đ m  ng v i các t  l  thộ ự ủ ệ ị ộ ệ ứ ớ ỷ ệ ể tích khác nhau t  3:97, 5:95, 10:90, 15:85 và 20:80. Công th c tính đ  phân c c là:ừ ứ ộ ự

PI = %Vi x PIi/ 100 (CT 2)Trong nghiên c u này, chúng tôi s  d ng Cứ ử ụ 7H15SO3­ đ  t o ph c liên h p ion v i ion PQể ạ ứ ợ ớ 2+, 

ph c ch t này là ch t không phân c c. Trong khi đó, ứ ấ ấ ự pha tĩnh được ch n cũng là c t pha đ o kémọ ộ ả  phân c c, v y pha đ ng dùng đ  tách ph i có đ  phân c c v a ph i thì quá trình tách m i t i  u.ự ậ ộ ể ả ộ ự ừ ả ớ ố ư  

K t qu  kh o sát đế ả ả ược cho trong b ng 3.2.ả

Hình 3.: Săc ḱ ý đô khao sat ti lê pha đông ACN : Đêm %v/v̀ ̉ ́ ̉ ̣ ̣ ̣a: 20:80;       b: 15:85;        c: 10:90;        d: 5:95;         e: 3:97 

B ng 3.:  nh hả Ả ưởng c a ti lê pha đông t i đ  phân c c, th i gian l u, h  s  đ i x ng picủ ̉ ̣ ̣ ớ ộ ự ờ ư ệ ố ố ứ

Ti lê pha đông ̉ ̣ ̣(ACN: Đêm, v/v) ̣

PI (đ n v )ơ ị

Th i gian l u ờ ư(phút) AS

“­” là không xu t hi n pic PQ trên s c đ , ch  ch a pic n n m u.ấ ệ ắ ồ ỉ ứ ề ẫ

K t qu  cho th y khi tăng thành ph n ACN trong pha đ ng đ  phân c c c a pha đ ngế ả ấ ầ ộ ộ ự ủ ộ  

gi m, th i gian l u ng n h n.   t  l  th  tích 15:85 và 20:80, đ  phân c c c a pha đ ng th p,ả ờ ư ắ ơ Ở ỷ ệ ể ộ ự ủ ộ ấ  làm cho PQ không tách ra kh i n n m u.   t  l  10:90, đã tách đỏ ề ẫ Ở ỷ ệ ược PQ ra kh i n n m u tuyỏ ề ẫ  nhiên tín hi u đo th p và pic không cân đ i. Khi đ  phân c c c a dung d ch pha đ ng tăng, ch tệ ấ ố ộ ự ủ ị ộ ấ  

b  gi  trong c t lâu làm cho th i gian l u tăng dài, pic doãng.   t  l  5:95, pic ch t cân đ i Aị ữ ộ ờ ư Ở ỷ ệ ấ ố S: 0,87, th i gian l u ng n h n, pic tách t t ra kh i n n m u. Do đó, chúng tôi ch n t  l  th  tíchờ ư ắ ơ ố ỏ ề ẫ ọ ỷ ệ ể  5:95 là đi u ki n t i  u.ề ệ ố ư

3.1.5. Khao sat anh h ̉ ́ ̉ ưở ng pH cua pha đông ̉ ̣

Sau khi ch n đọ ược h  dung môi pha đ ng phù h p là ACN ­ đ m t  l  5:95, chúng tôiệ ộ ợ ệ ỷ ệ  

kh o sát l i pH c a pha đ ng. Trong s c ký l ng pha đ o RP ­ HPLC, pH có vai trò quanả ạ ủ ộ ắ ỏ ả  

tr ng, nó  nh họ ả ưởng t i d ng t n t i c a ch t phân tích, d ng t n t i thay đ i thì th i gianớ ạ ồ ạ ủ ấ ạ ồ ạ ổ ờ  

l u tr  ch t phân tích trên c t cũng thay đ i. Do đó ph i l a ch n pH cho phù h p v i quáư ữ ấ ộ ổ ả ự ọ ợ ớ  trình tách và s  an toàn c a c t tách. Trong nghiên c u này, chúng tôi l a ch n kh o sát pHự ủ ộ ứ ự ọ ả  trong kho ng t  2,5 t i 4,5. Vì PQ có pKa ~ 9 – 9,5ả ừ ớ  trong nước nên c n duy trì pH < pKa đ  PQầ ể  

t n t i   d ng ion dồ ạ ở ạ ương RN+H, t o liên h p ion v i ạ ợ ớ natri heptanesulfonate. Ti n hành kh o sátế ả  

t i các pH khác nhau s  d ng pha đ ng là ACN ­ đ m (5:95, v/v) v i t c đ  dòng là 0,5 ml/phút,ạ ử ụ ộ ệ ớ ố ộ  

PQ có n ng đ  5 µg/ml, th  tích b m m u là 30 µl.ồ ộ ể ơ ẫ

K t qu  kh o sát các giá tr  pH đế ả ả ị ược cho trong b ng sau:ả

Hình 3.: Săc đô khao sat anh h́ ̀ ̉ ́ ̉ ưởng cua pH̉a: pH=4,5;        b: pH=4,0;         c: pH=3,5;        d: pH=3,0;        e: pH=2,5

B ng 3.: ả Ả  hnh ưởng cua pH̉  t i ớ th i gian l u, h  s  đ i x ng picờ ư ệ ố ố ứ

“­” là không xu t hi n pic PQ trên s c đ , ch  ch a pic n n m u.ấ ệ ắ ồ ỉ ứ ề ẫ

T  k t qu  kh o sát  nh hừ ế ả ả ả ưởng c a pH pha đ ng   b ng trên, chúng tôi nh n th y:ủ ộ ở ả ậ ấ  T iạ  giá tr  pH = 2,5, pic s c nét và khá  n đ nh. Th i gian l u th p h n so v i các giá tr  pH khác, hị ắ ổ ị ờ ư ấ ơ ớ ị ệ