Mục tiêu nghiên cứu của luận văn nhằm xây dựng một quy trình chiết thích hợp để điều chế các phần chiết từ cây kinh giới, từ đó định hướng khảo sát thành phần hóa học các hợp chất có trong cây kinh giới. Nhận dạng một số hợp chất phân lập được từ các phân đoạn chiết của cây kinh giới. Khảo sát hoạt tính sinh học của các phần chiết cây kinh giới.
Trang 1B x
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -
Trần Phúc Đạt
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY KINH GIỚI
Ở VIỆT NAM
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Trang 2ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -
Trần Phúc Đạt
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY KINH GIỚI
Ở VIỆT NAM
Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 60440114
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS ĐỖ THỊ VIỆT HƯƠNG
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS Đỗ Thị Việt
Hương – giảng viên khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG Hà
Nội, người thầy luôn tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho em
thực hiện đề tài này
Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô thuộc bộ môn Hóa Dược, Khoa
Hóa học, trường ĐHKHTN, cũng như các thầy cô khoa Hóa học đã luôn hỗ trợ em
trong quá trình tiến hành thực hiện đề tài
Xin chân thành cảm ơn các anh chị, bạn bè làm việc tại phòng Hóa Dược, khoa
Hóa học, trường ĐHKHTN, các cô chú, anh chị làm việc tại phòng Hóa sinh ứng
dụng thuộc Viện Hóa học, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam luôn tạo
điều kiện thuận lợi để em hoàn thành kết quả đề tài này
Hà Nội, ngày tháng năm
Trang 4MỤC LỤC
BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT 8
1.1.1 Đặc điểm thực vật của cây kinh giới, loài Elscholtzia ciliata, họ
1.2.1 Tác dụng trị liệu theo kinh nghiệm dân gian 7
1.3.4 Một số hợp chất có trong tinh dầu E ciliata 14
Trang 52.3.2 Phân tách phần chiết n-hexan (EH) và phần chiết etyl acetat (EE) bằng
2.3.3 Khảo sát định tính các nhóm phân đoạn trên hệ thống sắc ký khổi phổ
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28
3.1 Khảo sát định tính các nhóm phân đoạn trên hệ thống GC/MS 28
Trang 6DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1 Thành phần hóa học được nghiên cứu của chi kinh giới 10
Bảng 1.2 Một số hợp chất được phân lập từ loài E ciliata 10
Bảng 2.1 Hiệu suất của các phần chiết từ mẫu cây kinh giới 20
Bảng 3.1 Kết quả phân tách cặn chiết n-hexan bằng sắc ký cột 28
Bảng 3.2 Thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexan 29
Bảng 3.3 Các tín hiệu phổ của H1 34
Bảng 3.4 Kết quả phân tách cặn chiết etyl acetat bằng sắc ký cột 37
Bảng 3.5 Thành phần hóa học trong dịch chiết etyl acetat 38
Bảng 3.6 Kết quả độ hấp thụ quang 43
Bảng 3.7 Khả năng ức chế enzym 𝛼-glucosidase của cặn chiết kinh giới 45
Trang 7
DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ
Hình 1.1 Cây, lá và hoa kinh giới 4
Hình 1.2 Cấu trúc của các flavonoid phân lập được từ loài E ciliata 11
Hình 1.3 Cấu trúc của daucosterol 14
Hình 2.1 Mẫu kinh giới thu mua 18
Hình 3.1 Sắc ký đồ GC-MS của phân đoạn EH2 cây kinh giới 29
Hình 3.2 Các acid béo mạch dài trong dịch chiết kinh giới 31
Hình 3.3 Tecpenoid trong dịch chiết kinh giới 32
Hình 3.4 Flavonoid trong dịch chiết kinh giới 32
Hình 3.5 Phổ NMR của hợp chất H1 33
Hình 3.6 Cấu trúc của H1 33
Hình 3.7 Sắc ký đồ của H2 35
Hình 3.8 Phổ khối của H2 36
Hình 3.9 Sắc ký đồ GC-MS của phân đoạn EE2 cây kinh giới 37
Hình 3.10 Cấu trúc của E1 39
Hình 3.11 Sắc ký đồ của hợp chất E1 39
Hình 3.12 Phổ khối lượng của E1 so sánh với thư viện MS 40
Hình 3.13 Cấu trúc của E2 41
Hình 3.14 Sắc ký đồ GC của E2 41
Hình 3.15 Phổ khối của E2 so sánh với thư viện MS 42
Hình 3.16 Đường chuẩn phenolic 43
Hình 3.17 Tổng phenolic của các dịch chiết từ kinh giới 44
Hình 3.18 Tổng lượng flavonoid trong dịch chiết kinh giới 45
Hình 3.19 Đồ thị khảo sát khả năng ức chế enzym 𝛼-glucosidase 46
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ chiết từ mẫu khô 20
Sơ đồ 2.2 Phân tách các phân đoạn dịch chiết n-hexan 22
Sơ đồ 2.3 Phân tách các phân đoạn dịch chiết etyl acetat 23
Trang 8BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Ý nghĩa
EE Cặn chiết etyl acetat
GC-MS Phương pháp phân tích sắc ký khí kết hợp khối phổ
IC50 Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử
LD50 Liều gây chết 50% đối tượng thử
MIC Nồng độ ức chế tối thiểu
Trang 9MỞ ĐẦU
Nước Việt Nam chúng ta nằm trong vùng nhiệt đới cho nên những điều kiện khí hậu như nhiệt độ, lượng mưa, ánh sáng…và hơn hết điều kiện thổ nhưỡng đặc trưng thích hợp cho nhiều loài thực vật có giá trị tồn tại và phát triển Đó là nguồn tài nguyên sinh học quý giá, thuộc loại tài nguyên tái tạo được Từ thời xa xưa cho đến
xã hội loài người hiện nay đều khai thác nguồn tài nguyên này để làm thực phẩm, thuốc chữa bệnh, các vật liệu cũng như nhiên liệu cho cuộc sống thường ngày
Kinh giới, được biết đến là một loại rau thơm, không chỉ dùng trong bữa ăn hàng ngày nhờ vị bạc hà đặc trưng, mà còn sử dụng như một loài nước xông chữa
một số bệnh ngoài da ở trẻ em Kinh giới thuộc chi Elsholtizia, họ Lamaecia rất phổ
biến ở nước ta Do tính chất sử dụng rộng rãi, nên đã nhiều công trình khoa học nghiên cứu về thực vật cũng như hóa học, nhằm lựa chọn nâng cao giá trị sử dụng của mỗi loài Tuy nhiên sự nghiên cứu các loài kinh giới về thành phần hóa học, công dụng cũng như số lượng các loài kinh giới còn chưa đầy đủ và không đồng nhất ở một số tài liệu Để góp phần vào việc nghiên cứu một cách sâu hơn và rộng hơn các loài riềng có ở trong nước, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt
tính sinh học trong cây Kinh giới (Elsholtzia ciliata) ở Việt Nam” và từ đó đưa ra
hướng khai thác và ứng dụng loài kinh giới này trong đời sống Vì vậy, nhiệm vụ đặt
ra cho chúng tôi là:
1 Xây dựng một quy trình chiết thích hợp để điều chế các phần chiết từ cây kinh giới, từ đó định hướng khảo sát thành phần hóa học các hợp chất có trong cây kinh giới
2 Nhận dạng một số hợp chất phân lập được từ các phân đoạn chiết của cây kinh giới
3 Khảo sát hoạt tính sinh học của các phần chiết cây kinh giới
Trang 10
Chương 1- TỔNG QUAN
1.1 Khái quát về kinh giới
Chi kinh giới (Elsholtzia Willd) thuộc họ Lamiaceae, có khoảng 40 loài kinh giới trên thế giới phân bố chủ yếu ở Đông Á, Châu Phi, Bắc Mỹ, và một số quốc gia Châu Âu [10, 33] Ở Việt Nam, có 7 loài thuộc chi kinh giới được nghiên cứu và ứng dụng làm thực phẩm và dược phẩm
1.1.1 Đặc điểm thực vật của cây kinh giới, loài Elscholtzia ciliata, họ
Lamiaceae
Tên khoa học: Elsholtzia ciliata (Thunb.) Hyland, họ Lamiaceae
Tên thông thường: Kinh giới rìa, Kinh giới trồng [1]
Tên đồng nghĩa: Sideritis ciliata Thunb., Elsholtzia cristata Will., Hyssopus ocymifolius Lamk., Mentha ovata Cav., Mentha patrini Lepech., Perilla polystachya
D Don, Elsholtzia pattini (Lepech.) Garcke
Một số tên khác: Khương giới [3], Giả tô, Nhả nát bom (Thái), Phjăc bom khao (Tày), Bài hương thảo
Mô tả thực vật
Kinh giới là cây thảo sống hằng năm có đặc điểm như sau:
Thân thuộc loại cỏ đứng, cao 0,6-0,8 m, toàn cây có lông màu trắng, có mùi rất thơm [3] Thân non màu xanh, tiết diện vuông hơi khuyết ở bốn cạnh Thân già màu nâu tía có bốn góc lồi tròn dọc thân
Lá đơn, mọc đối chéo chữ thập Phiến là màu xanh đậm hơn ở mặt trên, hình trứng đinh nhọn, gốc hình nêm men một phần dọc theo hai bên cuống lá, kích thước 3-7 x 2,5-5 cm, bìa răng cưa nhọn không đều ở 2/3 phía trên, mặt dưới nhiều chấm nhỏ (lông tiết) Gân lá hình lông chim, nổi rõ ở mặt dưới, 4-7 cặp gân phụ hơi cong
ở ngọn Cuống lá hình trụ hơi phẳng ở mặt trên, gốc cuống lồi thành u nhỏ, mặt trên
có lông rậm màu trắng ở giữa, dài 2,5-4cm
Trang 11Hoa mọc thành cụm xim co tạo thành gié giả dài 5-12 cm ở ngọn cành, tạt về một phía dày đặc hoa Một đến hai xim co ở nách lá bắc, mỗi xim có 3-5 hoa Lá bắc màu xanh hay xanh tím nhiều gân nổi, hình thoi rộng mũi nhọn, nhiều lông ở mặt ngoài, kích thước 3-5 x 6-7 mm Cuống hoa màu xanh rất ngắn hoặc gần như không
có Lá đài màu xanh, gần đều, dính nhau thành một ống hình chuông dài khoảng 1,5
mm, trên chia 5 phiến tam giác nhọn khoảng 1 x 0,5 mm, mặt ngoài đầy lông tơ trắng, nhiều hơn ở rìa Cánh hoa màu trắng hay tím nhạt đậm dần phía trên, mặt ngoài phủ đầy lông dài màu trắng và có nhiều điểm tuyến màu vàng, dính nhau ở dưới thành ống hơi thắt ở gần đáy, dài khoảng 2-3 mm, trên chia môi 2/3: môi trên xẻ cạn làm 2 thùy giống nhau, hình hơi tròn, kích thước nhỏ, khoảng 0,5 x 0,5 mm; môi dưới chia
3 thùy không đều, hai thùy bên giống nhau hình cung to hơn thùy môi trên, thùy giữa
to nhất hơi khum hình gần tròn, rìa hơi lượn, kích thước khoảng 1,5 x 1,5 mm Nhị kiểu 2 trội, chỉ nhị dạng sợi mảnh màu trắng hay tím nhạt, nhẵn, đính khoảng giữa ống tràng xen kẽ với cánh hoa, nhị trước dài khoảng 0,6-0,7 cm, nhị sau dài 0,3-0,4
cm Bao phần màu đỏ tím, hai buồng xếp thành hình số tám dọc, nút dọc, hướng trong, đính giữa, chung đới dạng đòn cân ở mặt ngoài Hạt phấn rời màu trắng sữa, hình bầu dục có rãnh, mặt ngoài có nhiều vân, kích thước 37,5-45 x 30-32,5 μm Lá noãn phần bầy trên hình cầu hai ô, có vách giả chia làm bốn ô rời, mỗi ô một noãn đính đáy Một vòi nhụy màu trắng trong mờ, nhẵn, dạng sợi đính ở đáy bầu giữa các
ô, dài 0,7-0,8 cm, tận cùng hai nhánh đầu nhụy màu hơi tím nhật dài khoảng 1 mm choãi ra hướng trước sau Đĩa mật ở gốc bầu dạng bồ gờ nạc Quả bế hình bầu dục có cạnh, màu nâu, dài khoảng 0,5 mm, rốn hẹp ở đáy, mang trong đài tồn tại khô xác màu nâu
Trang 12Hình 1.1 Cây, lá và hoa kinh giới Đặc điểm vi mẫu (giải phẫu)
Thân vi phẫu hình vuông lõm ở bốn cạnh Các mô gồm: Biểu bì một lớp tế bào hình chữ nhật hay đa giác gần tròn kích thước nhỏ, gần đều, lớp cutin mỏng hơi răng cưa Trên biểu bì rải rác có lỗ khí, lông tiết đa bào, lông che chở đa bào Lông tiết ngắn với đầu hình tròn hay lõm ở giữa gồm một, hai hoặc bốn tế bào Lông che chở
đa bào kích thước to, phía trên là một dãy 4-5 tế bào, phía dưới cùng mức hoặc hơi cao hơn mức biểu bì gồm một vài tế bào Mô dày góc 1-5 lớp tế bào đa giác hay gần tròn, kích thước không đều lớn hơn tế bào biểu bì, tập trung nhiều ở bốn góc lồi Mô mềm vỏ khuyết 2-4 lớp tế bào hình bầu dục nằm ngang hay gần tròn, to, không đều, thường bị ép dẹp Ở thân già tần bì sinh xuất hiện trong lớp mô mềm vỏ sinh bần ở ngoài lục bì ở trong, tế bào hình chữ nhật vách hơi lượn xếp xuyên tâm Nội bì khung Caspary Trụ bì ít tế bào hóa mô cứng nằm rải rác thường có trên các đám libe gỗ Libe ít, tế bào hình đa giác, kích thước nhỏ, vách uốn lượn xếp lộn xộn Libe tế bào hình chữ nhật vách lượn xếp xuyên tâm với tế bào gỗ Gỗ nhiều, mạch gỗ hình đa giác hay gần tròn, kích thước lớn không đều, xếp lộn xộn, mô mềm gỗ bao quanh mạch, tế bào hình đa giác kích thước nhỏ, không đều, tẩm chất gỗ, một số vách cellulose Mô mềm gỗ tạo thành cụm nằm dưới lớp gỗ, cụm dưới mỗi góc thường có 15-20 bó, cụm ở cạnh thường 1-3 bó, mỗi bó 3-5 mách Mô mềm gỗ gồm tế bào hình
đa giác, vách tẩm cellulose hoặc tẩm chất gỗ Tia tủy hẹp 1-2 dãy tế bào và nhiều ở bốn cạnh tạo các khoảng giang bó, gồm nhiều dãy tế bào hình chữ nhật hoặc đa giác,
Trang 13kích thước lớn dần từ trong ra ngoài Mô mềm tủy đạo, tế bào kích thước lớn, không đều, hình gần tròn đôi khi có vài tế bào hình đa giác dẹp xếp khít nhau Tinh bột nhiều
ở mô mềm vỏ, nội bì, tia tủy, libe và mô mềm quanh vùng tủy Hạt tinh bột nhỏ, hình tròn dẹp, tụ thành đám
Lá: Cuống lá: mặt trên hơi lõm, mặt dưới lồi, hai bên có tai Tế bào biểu bì hình tròn hay đa giác, kích thước nhỏ, không đều lớp cutin mỏng hơi răng cưa Trên biểu bì rải rác có lỗ khí, lông che chở nhiều hơn ở mặt trên và lông tiết đa bào giống
ở thân Mô dày góc 3-5 lớp dưới biểu bì trên, 1-3 lớp trên biểu bì dưới, thường bị gián đoạn bởi mô mềm khuyết có lục lạp ở hai bên eo phía dưới tai, tế bào đa giác hoặc gần tròn, kích thước lớn không đều, đôi khi bị tách lớp Mô mềm đạo tế bào tròn hay
đa giác gần tròn, kích thước lớn, không đều Mô dẫn với gỗ ở trên, libe ở dưới, xếp thành hình cung ở giữa và 2-4 bó nhỏ hơn ở hai bên phia trên và hai tai Ở bó chính, mạch gỗ hình tròn hoặc đa giác xếp thành 15-22 dãy, mỗi dạy có 1-6 mạch không đều, xen kẽ với mô mềm gồm 1-4 dãy tế bào hình chữ nhật hay đa giác vách cellulose Libe tế bào hình đa giác nhỏ, không đều, sắp xếp lộn xộn thành nhiều đám không liên tục xen kẽ với mô mềm vách dày cellulose Mô mềm vách dày cellulose 2-4 lớp tế bào đa giác nhỏ, không đều, bao bên ngoài cung libe gỗ Tinh bột nằm rải rác trong một vài tế bào mô mềm đạo dưới vùng libe Hạt tinh bột nhỏ, hình tròn dẹp
Gân giữa: Mặt trên hơi lồi, mặt dưới lồi nhiều và uốn lượn không đều Biểu bì
có thể bong tróc khỏi mô dày, tế bào hình tròn hay đa giác, kích thước nhỏ, không đều, gần giống nhau ở hai mặt, lớp cutin mỏng hơi có răng cưa cạn tách khỏi lớp biểu
bì dưới Cả hai lớp biểu bì có lỗ khí, lông che chở đa bào và lông tiết đa bào giống ở thân Lông che chở đa bào nhiều ở mặt trên, rải rác ở mặt dưới Mô dày góc 1-5 lớp biểu bì trên, 1-2 lớp trên biểu bì dưới, tế bào hình tròn hay đa giác, kích thước lớn hơn tế bào biểu bì, không đều, thường bị tách tạo khuyết Mô mềm đạo tế bào tròn hay đa giác gần tròn, to, không đều Mô dẫn với gỗ ở trên libe ở dưới xếp hình cung
ở giữa và 1-3 bó nhỏ hơn ở hai bên phía trên bó chính Ở bó chính, mạch chỗ hình tròn hoặc đa giác gần tròn xếp thành 15-20 dãy, mỗi dãy có 1-6 mạch không đều, xen
kẽ với 1-3 dãy mô mềm tế bào đa giác vách cellulose Libe ít, tế bào nhỏ, hình đa
Trang 14giác, sắp xếp lộn xộn thành nhiều đám không liên tục xen kẽ với mô mềm Bao bên ngoài cung libe gỗ có 2-4 lớp tế bào mô mềm hình đa giác, không đều, xếp khít nhau Tinh bột rải rác trong một vài tế bào mô mềm đạo
Phiến lá: tế bào biểu bì trên hình bầu dục hoặc đa giác dài, kích thước không đều Tế bào biểu bì dưới nhỏ hơn biểu bì trên Cả hai biểu bì rải rác có lông tiết đa bào giống ở thân, lông che chwor đa bào thường có ở vùng gân phụ, lỗ khí nhiều hơn
ở mặt dưới Nhiều chỗ biểu bì lõm xuống dính lông tiết Mô mềm giậu một lớp tế bào hình chữ nhật, 2-4 tế bào thẳng góc dưới mỗi tế bào biểu bì trên Mô mềm khuyết nối
từ mô mềm giậu đến biểu bì dưới, gồm 4-6 lớp tế bào đa giác vách hơi lượn, kích thước không đều, chứa lục lạp, xếp chừa khuyết to không đều Nhiều bó gân phụ gỗ
ở trên, libe ở dưới rải rác trong thịt [2]
1.1.2 Vùng phân bố, thu hát và chế biến
1.1.2.1 Vùng phân bố
Elsholtzia ciliata (Kinh giới) được phân bố rộng rãi ở Đông Nam Á như Lào,
Campuchia, Châu Phi, Châu Á như Ấn Độ, Nêpal, Mianma, Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên, Bắc Mỹ và một số quốc gia châu Âu như Nga Chủ yếu kinh giới mọc nhiều ở nơi có độ ẩm và nhiều ánh sáng, ở độ cao trên 600 m [1]
Ở Việt Nam, Elsholtzia ciliata được trồng chủ yếu ở các tỉnh phía bắc như Lào
Cai (Sa Pa), Cao Bằng (Bảo Lạc, Trà Lĩnh), Lạng Sơn (Bắc Sơn), Phú Thọ (Thanh Sơn, Phù Ninh), Vĩnh Phúc (Vĩnh Yên), Hà Tây (Bà Vì), Hòa Bình (Mai Châu), Hà Nội (Từ Liêm), Ninh Bình [1] và một số ít phía nam như Lâm Đồng, thành phố Hồ Chí Minh [2]
Một số loài Elsholtzia khác được phân bố như sau:
Elscholtzia blanda (E blanda), Kinh giới rừng, phân bố nhiều ở Ấn Độ, Nêpal,
Trung Quốc, Mianma, Lào, Malayxia, Indônêxia Ở Việt Nam, kinh giới rừng mọc nhiều ở một số tỉnh Tây Bắc như Lai Châu, Lào Cai, Sơn La (Mộc Châu), và một số tỉnh Tây Nguyên như Lâm Đồng (Đà Lạt), Khánh Hòa (Nha Trang) [1]