Khảo sát ảnh hưởng của sự biểu hiện vượt mức của protein FoxG1 đối với sự hình thành các gai thần kinh (dendritic spine) ở tế bào thần kinh (neuron) trên mô hình nuôi cấy tế bào.
Trang 1FOXG1 THÚC ĐẨY SỰ HÌNH THÀNH CÁC GAI THẦN KINH Ở NƠRON – MỘT CƠ CHẾ TIỀM NĂNG TRONG SINH LÝ BỆNH CỦA
HỘI CHỨNG WEST
Mai Phương Thảo*, Đỗ Đức Minh**
TÓM TẮT
Mục tiêu: Khảo sát ảnh hưởng của sự biểu hiện vượt mức của protein FoxG1 đối với sự hình thành các gai thần kinh (dendritic spine) ở tế bào thần kinh (neuron) trên mô hình nuôi cấy tế bào
Đối tượng – Phương pháp: Mô tả hàng loạt ca, nuôi cấy các tế bào thần kinh não chuột
Kết quả: Biểu hiện vượt mức protein FoxG1 thúc đẩy sự hình thành các gai thần kinh trên các sợi đuôi gai của tế bào thần kinh
Kết luận: Nghiên cứu này góp phần củng cố mối liên quan giữa hội chứng West và protein FoxG1 đồng thời cũng phần nào làm sáng tỏ cơ chế sinh bệnh của hội chứng West vốn chưa được hiểu biết tường tận
Từ Khóa: Protein FoxG1, biểu hiện vượt mức, tế bào thần kinh (neuron), sợi thần kinh (neurite), sợi trục (axon), đuôi gai (dendrite), gai thần kinh (dendritic spine), hội chứng West
ABSTRACT
FOXG1 PROMOTES THE FORMATION OF DENDRITIC SPINES – A POTENTIAL MECHANISM FOR
WEST SYNDROME PATHOPHYSYOLOGY
Mai Phuong Thao, Do Duc Minh* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No 1 - 2016: 24 - 28
Objective: Evaluating effects of FoxG1 overexpression in the formation of dendritic spines in vitro
Materials – Methods: Case series report using mouse neuronal culture
Results: Overexpression of FoxG1 promotesthe formation of dendritic spine
Conclusion: These findings consolidate the role of FoxG1 in West syndrome pathophysiology which remains unclear
Key words: FoxG1 (forkhead box protein G1), overexpression, neuron, neurite, axon, dendrite, dendritic spine, West syndrome
ĐẶT VẤN ĐỀ
Các gai thần kinh (dendritic spine) là phần
màng tế bào lồi ra trên sợi đuôi gai thần kinh, là
nơi tiếp hợp của các xi náp thần kinh, mà chủ
yếu là các xi náp kích thích (excitatory synapses)
của vùng vỏ đại não(15) Các gai thần kinh này
được hình thành và biến mất nhanh chóng,
thông thường, chúng sẽ được tăng cường hình
thành tại khu vực có hoạt động điện thế mạnh
với vai trò hỗ trợ các tín hiệu điện thế trong quá
trình dẫn truyền thần kinh(16) Gần đây, chúng tôi
phát hiện được mối liên quan giữa cơ chế bệnh
sinh của hội chứng West và protein FoxG1, cụ thể là khi được tăng cường biểu hiện protein FoxG1, các nơron thần kinh có khuynh hướng hình thành nhiều sợi thần kinh (neurite) hơn, đặc biệt là các sợi đuôi gai (dendrite) Forkhead box protein G1 (FoxG1) là protein được mã hóa
từ gen FOXG1 trên nhánh dài nhiễm sắc thể 14
(14q12) Đây là protein kiểm soát phiên mã có vai trò quan trọng trong việc hình thành não bộ trong giai đoạn phôi thai (hình thành não bộ, phân vùng não bộ, kiểm soát sự phân bào của các tế bào đầu dòng thần kinh…)(10,11) và trong
* Bộ sinh Sinh lý học, ĐH Y Dược TPHCM ** Trung tâm Y sinh học phân tử, ĐH Y Dược TPHCM
Trang 2giai đoạn trưởng thành (duy trì sự tân tạo các
neuron nhằm phục vụ cho các chức năng thần
kinh cao cấp)(6,14) Hội chứng West (West
syndrome), được đặt theo tên của bác sĩ người
anh William James West, là mội hội chứng động
kinh hiếm gặp ở trẻ em và trẻ nhũ nhi Tần suất
mắc bệnh ở trẻ mới sinh vào khoảng 1/2000 đến
1/4000(8) Biểu hiện lâm sàng của hội chứng West
gồm có tam chứng: động kinh, bất thường trên
EEG đột ngột, lan tỏa với hình ảnh sóng cao
không đồng dạng (hypsarrhythmia) đặc trưng
và chậm phát triển trí tuệ Các biểu hiện lâm
sàng này có thể giải thích bằng tình trạng tăng
hoạt động điện quá mức ở não bộ(3, 5) Như đã mô
tả ở trên, các gai thần kinh sẽ được tăng cường
hình thành tại khu vực hoạt động điện thế
mạnh, vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu
này nhằm khảo sát sự thay đổi của mật độ gai
thần kinh trên các sợi đuôi gai của các tế bào
thần kinh khi chúng được tăng cường biểu hiện
protein FoxG1
ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Động vật thực nghiệm
Dòng chuột CD1 wild-type (wt) được dùng
trong nghiên cứu này được nuôi dưỡng và phát
triển tại cơ sở động vật của viện SISSA,
Trieste-Italy
Nuôi cấy tế bào thần kinh
Mô não chuột 16.5 ngày tuổi sẽ được cắt nhỏ
trong vòng 5-8 phút trong dung dịch lạnh chứa
1X PBS-0,6% glucose-0,1% DNaseI Các mẫu này
sau đó được ủ với dung dịch trypsin nồng độ
1mg/ml trong 5 phút Dung dịch trypsin được
trung hòa bằng FBS 10%, các mẫu mô lớn sẽ lắng
xuống đáy ống nghiệm sau 5 phút và được tách
bỏ, phần tế bào trong dung dịch phía trên sẽ
được thu và đếm số lượng Cuối cùng các tế bào
này sẽ được nuôi cấy trong môi trường dành
riêng cho nơron: 1:1 Neurobasal A, 1X Glutamax
(Gibco), 1X yếu tố B27 (Invitrogen), 0,5mM
glutamine, 25μM β-Mercaptoethanol, 1X
Penicillin/Streptomycin (Gibco), 10 pg/ml
fungizone (Gibco) với mật độ ban đầu là 3*105 tế
bào/giếng trong đĩa nuôi cấy 24 giếng Môi trường nuôi cấy được thay mới mỗi 3,5 ngày Lenti virus vector
Lenti virus thế hệ thứ 3 được chuẩn bị theo protocol của Follenzi và Naldini bằng cách biến nạp các plasmid khung của virus và các plasmid mang bộ gen cần biểu hiện vào tế bào HEK293T(7) Sau 24 – 48 giờ, đem môi trường nuôi cấy tế bào ly tâm 100.000g để thu các virion
và hòa tan virion trong PBS Nồng độ virion được định lượng bằng RT-PCR(13)
Miễn dịch huỳnh quang
Tế bào nuôi cấy được cố định bằng dung dịch paraformaldehyt 4% trong 20 phút Sau đó, các tế bào được ủ với dung dịch blocking (1X PBS, 10% FBS, 1mg/ml BSA và 0.1% Triton X100) trong 1 giờ, kháng thể 1 được ủ qua đêm ở nhiệt
độ 4oC, và kháng thể 2 được ủ trong 2 giờ ở nhiệt
độ phòng Cuối cùng, các tế bào được nhuộm với dung dich DAPI (4’,6’-diamino-2-phenylindone) trong 10 phút ở nhiệt độ phòng
Phân tích và xử lý hình ảnh Hình ảnh được chụp bằng kính hiển vi Confocal Leica vật kính 63X và sau đó được xử
lý bằng phần mềm GIMP 2.6 và Image J để phân tích Các gai thần kinh sẽ được đếm số lượng và chia cho diện tích bề mặt của sợi đuôi gai để thu được thông số mật độ gai thần kinh trên một điện tích sợi đuôi gai
Phân tích thống kê Các thí nghiệm đều được thực hiện lặp lại
ít nhất 3 lần Kết quả được kiểm định bằng t-test và được cho là có ý nghĩa thống kê khi trị
số p < 0,05
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU FoxG1 thúc đẩy sự hình thành các gai thần kinh trên các nơron
Để đánh giá tác động của FoxG1 trên sự hình thành các gai thần kinh, chúng tôi phân lập các tế bào thần kinh từ phôi chuột 16,5 ngày tuổi và sau đó gây nhiễm các tế bào này với
Trang 3phức hợp các vector lenti virus như hình 1 Mỗi
vector virus sẽ được dùng để gây nhiễm với hệ
số là 8 (MOI=8, trong đó MOI: Multiplicity of
infection), nghĩa là dùng 8 virion để gây nhiễm
1 tế bào Để có thể kích hoạt và bất hoạt gen
FoxG1 vào bất kì thời điểm nào trong quá trình
thí nghiệm, chúng tôi sử dụng kĩ thuật
TetON(2) Trong kĩ thuật này, FoxG1 sẽ không
được biểu hiện trực tiếp dưới sự tác động của
promoter ptα1 mà sẽ được kích hoạt gián tiếp
qua promoter TRE (tetracycline respone
element), promoter TRE lại chịu sự kiểm soát
của phức hợp ptα1-rtTA Trong môi trường
nuôi cấy có chứa Doxycycline (dẫn xuất của
nhóm tetracycline) thì rtTA sẽ kích hoạt TRE và
từ đó phiên mã gen FoxG1 và ngược lại trong
môi trường không có Doxycycline, quá trình
này sẽ bị bất hoạt Các tế bào được chia làm 2
nhóm, nhóm được gây nhiễm với vector giúp
tăng biểu hiện protein FoxG1 (phức hợp a-b1)
và nhóm chứng được gây nhiễm với vector
biểu hiện protein PLAP (phức hợp a-b2); một
protein không có hoạt tính sinh học trên tế bào
thần kinh
Hình 1: Các vector lenti virus dùng trong nghiên cứu
Sau khi được gây nhiễm, các tế bào này sẽ
được nuôi cấy và biệt hóa trong vòng 5 ngày mà
không có doxycyclin (các gen tăng biểu hiện
protein FoxG1 và PLAP chưa được kích hoạt)
Sau 5 ngày, 2μg/ml Doxycyclin được thêm vào
môi trường nuôi cấy nhằm kích hoạt sản xuất
protein FoxG1 và PLAP ở các tế bào Đến ngày
thứ 10 (5 ngày sau khi thêm Doxycyclin), các tế
bào ở 2 nhóm FoxG1 và PLAP lại được chia làm
2 nhóm với 1 nhóm chứng và một nhóm được
kích thích gây khử cực bằng cách thêm vào môi
trường nuôi cấy 50mM KCl trong vòng 12 giờ
(hình 2) Mục đích của việc khử cực này nhằm
đánh giá khả năng hình thành các gai thần kinh
ở các nơron khi các tế bào này tăng cường hoạt động điện(9)
Hình 2: Tóm tắt quy trình thực hiện nghiên cứu
Cuối cùng các tế bào này sẽ được nhuộm miễn dịch huỳnh quang với Map2 (nhằm đánh giá cấu trúc của các sợi đuôi gai) và PSD95 (đánh giá các gai thần kinh) (hình 3)
Hình 3: Kết quả miễn dịch huỳnh quang các sợi đuôi gai (MAP2) và các gai thần kinh (PSD95)
Vì hình ảnh thu được từ kính hiển vi confocal là các hình ảnh 2 chiều, đồng thời do cấu trúc của các sợi đuôi gai khác nhau, nên chúng tôi lựa chọn phân tích mật độ của các gai thần kinh trên một đơn vị diện tích đuôi gai Từ các hình ảnh thu được sau khi chụp với kính hiển vi confocal, chúng tôi đếm số lượng các gai thần kinh trên từng sợi đuôi gai, diện tích của các sợi đuôi gai sẽ được tính bằng phần mềm ImageJ Như đã được mô tả trước đó, khi ta khử cực các nơron bằng dung dịch kali clorua, mật
độ các gai thần kinh tăng lên 1,66 lần Điều đặc biệt là đối với các tế bào được tăng cường biểu hiện FoxG1 đơn thuần, mật độ gai thần kinh tăng lên 2,63 lần so với các tế bào chứng, và khi kết hợp kali clorua và tăng biểu hiện protein FoxG1, mật độ gai thần kinh tăng lên đến 3,34
Trang 4lần (mật độ gai thần kinh của nhóm chứng trung
bình là 0,17±0,03/μm2) (hình 4)
Hình 4: Biểu đồ so sánh mật độ gai thần kinh trên
một diện tích đuôi gai ở các thí nghiệm (so với nhóm
chứng không khử cực bằng kali clorua và không tăng
cường biểu hiện FoxG1)
BÀN LUẬN
Từ kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi có thể
kết luận rằng việc tăng cường biểu hiện FoxG1
trên tế bào thần kinh sẽ thúc đẩy sự hình thành
các gai thần kinh nhiều hơn so với các tế bào
thần kinh thông thường Kết quả này như là một
bằng chứng gián tiếp cho thấy sự tăng cường
hoạt động điện của các nơ ron thần kinh được
tăng biểu hiện protein FoxG1 và từ đó cho thấy
mối liên quan giữa tình trạng lặp đoạn trên
nhiễm sắc thể số 14 mang gene FOXG1 và hội
chứng West Cơ chế phân tử của việc thúc đẩy
hình thành các gai thần kinh bởi FoxG1 được
kiến nghị như hình 5, trong đó FoxG1 ức chế các
protein pSmad (pSmad2,3), các protein pSmad
này cần thiết cho sự hình thành protein Mdm2
để 1 lần nữa ức chế PSD95 là một protein rất
quan trọng trong việc hình thành và duy trì sự
ổn định của các gai thần kinh(1,4, 12) Bước tiếp theo
chúng tôi sẽ đào sâu con đường tín hiệu này
nhằm hiểu biết rõ hơn về vai trò phân tử của
FoxG1 trong hôi chứng West
Hình 5: Cơ chế phân tử giả thiết để giải thích hiện tượng FoxG1 thúc đẩy hình thành các gai thần kinh
KẾT LUẬN Các nơron thần kinh biểu hiện vượt mức protein FoxG1 hình thành nhiều gai thần kinh hơn như là một bằng chứng gián tiếp cho thấy
sự tăng cường hoạt động điện thế ở các nơron này Từ đó cho thấy protein FoxG1 là một nguyên nhân tiềm năng trong sinh lý bệnh của hội chứng West
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Araki S, Eitel JA, Batuello CN, Bijangi-Vishehsaraei K, Xie XJ, Danielpour D, Pollok KE, Boothman DA, Mayo LD (2010) TGF-beta1-induced expression of human Mdm2 correlates with late-stage metastatic breast cancer J Clin Invest, 120(1):290–302
2 Brancaccio M, Pivetta C, Granzotto M, Filippis C, Mallamaci
A (2010) Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis Stem Cells Dayt Ohio, 28(7):1206–1218
3 Chugani HT, Shields WD, Shewmon DA, Olson DM, Phelps
ME, Peacock WJ (1990) Infantile spasms: I PET identifies focal cortical dysgenesis in cryptogenic cases for surgical treatment Ann Neurol, 27(4):406–413
4 Colledge M, Snyder EM, Crozier RA, Soderling JA, Jin Y, Langeberg LK, Lu H, Bear MF, Scott JD (2003) Ubiquitination regulates PSD-95 degradation and AMPA receptor surface expression Neuron, 40(3):595–607
5 Desguerre I, Pinton F, Nabbout R, Moutard ML, N’Guyen S, Marsac C, Ponsot G, Dulac O (2003) Infantile spasms with basal ganglia MRI hypersignal may reveal mitochondrial disorder due to T8993G MT DNA mutation Neuropediatrics, 34(5):265–269
6 Fasano CA, Phoenix TN, Kokovay E, Lowry N, Elkabetz Y, Dimos JT, Lemischka IR, Studer L, Temple S (2009) Bmi-1 cooperates with Foxg1 to maintain neural stem cell self-renewal in the forebrain Genes Dev, 23(5):561–574
7 Follenzi A, Naldini L (2002) HIV-based vectors Preparation and use Methods Mol Med, 69:259–274
8 Hrachovy RA, Frost JD (1989) Infantile spasms Pediatr Clin North Am, 36(2):311–329
9 Kim TK, Hemberg M, Gray JM, et al (2010) Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers Nature, 465(7295):182–187
10 Martynoga B, Morrison H, Price DJ, Mason JO (2005) Foxg1 is required for specification of ventral telencephalon and region-specific regulation of dorsal telencephalic precursor proliferation and apoptosis Dev Biol, 283(1):113–127
11 Muzio L, Mallamaci A (2005) Foxg1 confines Cajal-Retzius neuronogenesis and hippocampal morphogenesis to the dorsomedial pallium J Neurosci Off J Soc Neurosci, 25(17):4435–4441
Trang 512 Rodriguez C, Huang LJ, Son JK, McKee A, Xiao Z, Lodish HF
(2001) Functional cloning of the proto-oncogene brain factor-1
(BF-1) as a Smad-binding antagonist of transforming growth
factor-beta signaling J Biol Chem, 276(32):30224–30230
13 Sastry L, Johnson T, Hobson MJ, Smucker B, Cornetta K
(2002) Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA
and marker expression methods Gene Ther, 9(17):1155–1162
14 Shen L, Nam HS, Song P, Moore H, Anderson SA (2006)
FoxG1 haploinsufficiency results in impaired neurogenesis in
the postnatal hippocampus and contextual memory deficits
Hippocampus, 16(10):875–890
15 Spruston N (2008) Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration Nat Rev Neurosci, 9(3):206–221
16 Yuste R (2013) Electrical compartmentalization in dendritic spines Annu Rev Neurosci, 36:429–449