Cường aldosterone nguyên phát là bệnh lý hàng đầu gây ra tăng huyết áp thứ phát với nguyên nhân chủ yếu là do adenoma tuyến thượng thận sản xuất aldosterone (APA: aldosterone producing adenoma). Cơ chế phân tử của cường aldosterone nguyên phát được cho là có liên quan đến đột biến gen KCNJ5. Nghiên cứu này nhằm thiết lập và ứng dụng quy trình kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA nhằm xác định các đột biến của gen KCNJ5 trên quần thể bệnh nhân APA Việt Nam.
Trang 1XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN
KCNJ5 TRÊN BỆNH NHÂN CƯỜNG ALDOSTERON NGUYÊN PHÁT
DO ADENOMA TUYẾN THƯỢNG THẬN
Đỗ Đức Minh*, Trần Viết Thắng**, Mai Phương Thảo***
TÓM TẮT
Mục tiêu: Cường aldosterone nguyên phát là bệnh lý hàng đầu gây ra tăng huyết áp thứ phát với
nguyên nhân chủ yếu là do adenoma tuyến thượng thận sản xuất aldosterone (APA: aldosterone producing adenoma) Cơ chế phân tử của cường aldosterone nguyên phát được cho là có liên quan đến đột biến gen KCNJ5 Nghiên cứu này nhằm thiết lập và ứng dụng quy trình kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA nhằm xác định các đột biến của gen KCNJ5 trên quần thể bệnh nhân APA Việt Nam
Đối tượng và phương pháp: Chúng tôi thiết kế các cặp mồi đặc hiệu khuếch đại 2 exon 2, 3 và
vùng tiếp giáp exon-intron của gen KCNJ5 DNA được tách chiết từ mô tươi bệnh phẩm u tuyến thượng thận của bệnh nhân được chẩn đoán APA Các mẫu DNA này sau đó được khuếch đại và giải trình tự bằng kỹ thuật Sanger
Kết quả: Chúng tôi đã khuếch đại thành công được 2 exon 2, 3 và vùng tiếp giáp exon-intron của gen
KCNJ5 Kết quả giải trình tự cho thấy đột biến L168R ở 2 trong số 3 bệnh nhân được chẩn đoán APA
Kết luận: Kỹ thuật giải trình tự DNA phát hiện được đột biến trên gen KCNJ5 từ đó giúp tăng
cường hiểu biết về sinh lý bệnh của bệnh lý APA
Từ khóa: cường aldosteron nguyên phát, adenoma tuyến thượng thận, gen KCNJ5, đột biến gen,
PCR, giải trình tự DNA
ABSTRACT
TECHNICAL PROTOCOL TO IDENTIFY KCNJ5 SOMATIC MUTATION IN ADRENAL
ALDOSTERONE-PRODUCING ADENOMA
Do Duc Minh, Tran Viet Thang, Mai Phuong Thao
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 21 - No 2 - 2017: 84 - 89
Objectives: Primary hyperaldosteronism is the most common cause of secondary hypertension
and usually the consequence of adrenal aldosterone-producing adenoma (APA) Recently, molecular mechanism of APA has been shown to be associated with mutation in KCNJ5 gene We conduct this study to set up a DNA sequencing procedure to investigate the mutation of KCNJ5 gene in Vietnamese APA patients
Material - Methods: Primers for amplification of exon 2,3 and the exon-intron boundaries of
KCNJ5 gene were designed Genomic DNA was extracted from fresh adrenal tissue of APA patients These DNA were respectively amplified and sequenced by Sanger technique
Results: The whole coding site and the exon-intron boundaries of KCNJ5 gene were successfully
amplified After sequencing, 2 out of 3 patients with APA carry L168R somatic mutation
Conclusion: DNA sequencing can detect somatic mutation in KCNJ5 gene This information can
cast more light in the pathophysiology of APA
Trang 2Keywords: primary aldosteronism, adrenal adenoma, KCNJ5 gene, somatic mutation, PCR,
DNA sequencing
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cường aldosterone nguyên phát là bệnh
lý hàng đầu gây ra tăng huyết áp thứ phát
với tỷ lệ khoảng 6-10% trên tổng số bệnh
nhân tăng huyết áp và lên tới 20% ở nhóm
bệnh tăng huyết áp kháng trị(4, 7) Nguyên
nhân thường gặp của cường aldosterone là
do adenoma tuyến thượng thận sản xuất
aldosterone (APA: adrenal
aldosterone-producing adenoma) hoặc tăng sản tuyến
thượng thận hai bên (bilateral adrenal
hyperplasia) Cơ chế phân tử của cường
aldosterone nguyên phát vẫn chưa được
hiểu biết rõ ràng và cho đến gần đây, một số
nghiên cứu đã chỉ ra rằng đột biến gen
KCNJ5 có liên quan mật thiết với nhóm
bệnh APA(3)
Gene KCNJ5nằm trên nhiễm sắc thể số số
11, mã hóa cho kênh ion Kali Kir 3.4, đột
biến gen này làm cho kênh kali bị mất tính
chọn lọc, các tế bào vùng cầu của vỏ thượng
thận bị khử cực liên tục dẫn đến việc sản
xuất quá mức aldosterone(3) Tỷ lệ đột biến
gene KCNJ5 trên nhóm bệnh nhân APA thay
đổi khá lớn tùy theo chủng tộc, tần suất dao
động từ khoảng 40% ở bệnh nhân Châu Âu
và lên tới 70% ở nhóm bệnh nhân Nhật Bản
và Trung Quốc(1,2,6,8)
Việc xây dựng quy trình kỹ thuật xác
định đột biến gene KCNJ5 trên nhóm bệnh
nhân APA không những giúp làm rõ cơ chế
bệnh sinh của bệnh lý này mà còn rất cần thiết cho việc đánh giá và tiên lượng bệnh vì
nhóm bệnh nhân có đột biến gen KCNJ5 có
khuynh hướng trẻ hơn, có nồng độ aldosterone cao hơn và có cải thiện tim mạch tốt hơn sau điều trị phẫu thuật(6)
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành khảo sát đột biến
gen KCNJ5 cho 3 bệnh nhân được chẩn đoán
adenoma tuyến thượng thận sản xuất aldosterone Các bệnh nhân này đều có biểu hiện lâm sàng của tình trạng tăng huyết áp,
hạ kali máu, có nồng độ aldosterone máu tăng cao và không bị ức chế khi làm test tải muối, nồng độ renin máu thấp và có khối u thượng thận 1 bên trên phim CT scan
Phương pháp nghiên cứu
Tách chiết Genomic DNA
Bệnh phẩm mô tươi khối u tuyến thượng thận được thu nhận từ quá trình phẫu thuật của bệnh nhân Sau đó mẫu mô tươi được cắt nhỏ và tách chiết DNA bằng bộ kit QIAamp DNA Kit (Qiagen, Mỹ), theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất
Thiết kế mồi
Bảng 1 Các cặp mồi dùng để khuếch đại và giải trình tự exon 2 và 3 của gen KCNJ5
Tên mồi Trình tự chuỗi (5’-3’) Đoạn gen khuếch đại
KCNJ5-2F CCTTCCATCTTGTGTTCTAG
Exon 2 và vùng lân cận (1073 bp) KCNJ5-2R TGCCTAAGTCTGAAGTGTAG
KCNJ5-3F1 GATGGATAGATGGATGGATG
Exon 3 và vùng lân cận (617 bp) KCNJ5-3R TTAGCCAGCACCTACAAGAG
KCNJ5-3F2 TGCTGTTTTCAGGAACGGAG
Exon 2 và vùng lân cận (1167 bp) KCNJ5-3R TTAGCCAGCACCTACAAGAG
Trang 3Gen KCNJ5 bao gồm 3 exon, trong đó
exon 1 không tham gia mã hóa protein, vì
vậy chúng tôi chỉ tiến hành giải trình tự
exon 2, 3 và các vùng lân cận Các đoạn mồi
được thiết kế dựa trên trình tử DNA của gen
KCNJ5 mang mã số NG_023406.2 trong kho
dữ liệu của NCBI và được tổng hợp bởi công
ty Integrated DNA Technologies, Hoa Kỳ
Thông tin các đoạn mồi được trình bày như
bảng 1
Thực hiện PCR
Mỗi tube PCR có thể tích 25 l chứa các
thành phần: PCR buffer, dNTP (250 M cho
mỗi loại), 2 mồi xuôi và ngược (0,5 M cho
mỗi loại), 1,25U TaKaRa TaqTM HotStart
Polymerase (Takara, Nhật Bản) và 50-100 ng
genomic DNA Chu trình luân nhiệt cho
Mastercycler@Pro S (Eppendorf, Đức) bao
gồm giai đoạn biến tính ban đầu ở 980C
trong 3 phút, theo sau bằng 40 chu kỳ gồm
biến tính ở 980C trong 10 giây, gắn mồi ở
540C trong 15 giây, tổng hợp chuỗi DNA ở
720C trong 1,5 phút và kết thúc bằng giai
đoạn kéo dài sản phẩm ở 720C trong 5 phút
Sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di
trên thạch agarose 0,7% có nhuộm ethidium
bromide và quan sát dưới hệ thống chụp
ảnh điện di Geldoc-ItTM (UVP, Mỹ) Sản
phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng
illustraTM GFXTM PCR DNA and Gel Band
Purification Kit (GE Healthcare, Anh) theo
hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất và
được kiểm tra lại bằng điện di trên thạch
agarose 0,7% Các phản ứng luôn kèm theo
một chứng âm không chứa DNA để kiểm
soát ngoại nhiễm
Thực hiện giải trình tự DNA
Sản phẩm PCR đã được tinh sạchsẽ được
thực hiện phản ứng cycle sequencing
vớiBigDye® Terminator v3.1 Cycle
Sequencing kit (Applied Biosystems, Mỹ)
theo hai chiều xuôi và ngược với các mồi trong Bảng 1 Sản phẩm sau đó được kết tủa bằng ethanol, hòa tan trong Hi-Di formanide, biến tính ở 95C trước khi làm lạnh đột ngột Trình tự DNA được đọc bằng máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP-7 polymer và capillary 50 cm (Applied Biosystems, Mỹ) Kết quả giải trình tự DNA được phân tích bằng phần mềm CLC Main Workbench
KẾT QUẢNGHIÊN CỨU Thiết lập kỹ thuật giải trình tự DNA
gen KCNJ5
Theo thiết kế ban đầu, 2 cặp mồi KCNJ5-2F, KCNJ5-2R và KCNJ5-3F1, KCNJ5-3R sẽ khuếch đại thành công exon 2 và 3 của gene
KCNJ5 và vùng intron lân cận Kết quả là
exon 2 được khuếch đại thành công với kích thước sản phẩm PCR như mong đợi, trong khi đó do cặp mồi KCNJ5-3F1, KCNJ5-3R bắt cặp không đặc hiệu hình thành sản phẩm PCR với kích thước không phù hợp với dự đoán ban đầu (<200bp thay vì phải là
671 bp) (hình 1) Để khắc phục tình trạng này, chúng tôi đã thiết kế lại mồi KCNJ5-3F2
và đã thành công khi khuếch đại được đoạn DNA kích thước phù hợp có chứa exon 3
của gen KCNJ5 (hình 2) Tất cả các cặp mồi
đều hoạt động ở nhiệt độ tối ưu là 540C Các sản phẩm PCR sau đó được tiến hành giải trình tự và cho kết quả hoàn toàn
phù hợp với trình tự của gen KCNJ5 mang
mã số NG_023406.2 trong kho dữ liệu của NCBI
Trang 4Hình 1 Kết quả phản ứng PCR khuếch đại exon 2
và 3 của gen KNCJ5 ở 2 nhiệt độ bắt cặp là 52 và
54 0 C bằng 2 cặp mồi KCNJ5-2F, KCNJ5-2R và
KCNJ5-3F1, KCNJ5-3R Exon 2 được khuếch đại
thành công, trong khi đó sản phẩm PCR exon 3
không phù hợp với dự đoán ban đầu
Hình 2 Kết quả phản ứng PCR khuếch đại exon 3
của gen KNCJ5 ở 2 nhiệt độ bắt cặp là 52 và 540C bằng cặp mồi KCNJ5-3F2, KCNJ5-3R Exon3 được khuếch đại thành công
Hình 3 Đột biến L168R trên gen KCNJ5 của bệnh nhân 1
520C 540
C
1500
1000 500
bp
520C
540C
1500
1000
500
bp
Trang 5Hình 4 Không phát hiện đột biến trên gen KCNJ5 của bệnh nhân 3
Phát hiện đột biến gen KCNJ5 trên các
mẫu bệnh phẩm
Ứng dụng các kỹ thuật giải trình tự
chuỗi DNA của gen KCNJ5, chúng tôi phát
hiện đột biến sai nghĩa L168R nằm trên exon
2 của 2 bệnh nhân tham gia nghiên cứu Đây
là một đột biến phổ biến đã được báo cáo
trên nhóm bệnh nhân APA châu Á Trên
mẫu bệnh phẩm còn lại, chúng tôi chưa phát
hiện được đột biến trên gen KCNJ5
BÀN LUẬN
Gần đây, các nhà khoa học đã chứng
minh rằng đột biến sinh dưỡng trên gen
KCNJ5 liên quan mật thiết đến APA Các đột
biến trên gen KCNJ5 làm mất tính chọn lọc
của kênh Kali Kir 3.4 nằm trên các tế bào
vùng cầu thượng thận sản xuất aldosterone
dẫn đến tình trạng ion Natri cũng có thể dễ
dàng qua kênh ion này, gây khử cực liên tục
các các tế bào vùng cầu vỏ thượng thận, sản
xuất một lượng lớn aldosterone mà không
phụ thuộc vào nồng độ kali máu Bên cạnh
đó, chính sự kích thích liên tục này cũng
làm tăng sinh các tế bào vùng cầu vỏ thượng
thận quá mức cần thiết và cuối cùng dẫn đến hậu quả hình thành khối u tiết aldosterone (APA: aldosterone producing adenoma)(3) Ngoài ra, đột biến dòng mầm
trên gen KCNJ5 gây ra tình trạng cường
aldosterone gia đình típ 3 với đặc điểm di truyền trội nhiễm sắc thể thường , bệnh khởi phát ở tuổi trẻ kèm theo khối u thượng thận hai bên rất lớn(5) Từ đó có thể thấy vai
trò hết sức quan trọng của gen KCNJ5 trong
sinh bệnh học của u tuyến thượng thận tăng sản aldosterone
KẾT LUẬN
Chúng tôi đã xây dựng thành công quy
trình kỹ thuật giải trình tự gen KCNJ5 từ
DNA tách chiết từ mẫu mô u tuyến thượng thận Việc xác định các đột biến trên gen
KCNJ5 sẽ giúp tăng cường hiểu biết về cơ
chế phân tử trong bệnh lý u thượng thận tăng tiết aldosterone
TÀI LIỆU THAM KHẢO
mutations affecting the selectivity filter of KCNJ5 are frequent in 2 large unselected collections of adrenal
aldosteronomas" Hypertension 59 (3): 587–591
Trang 6in primary aldosteronism" Hypertension 59 (3): 592–
598
in adrenal aldosterone-producing adenomas and
hereditary hypertension" Science 331 (6018): 768–772
primary hyperaldosteronism in resistant hypertension:
a retrospective observational study" Lancet 371 (9628):
1921–1926
Kashgarian M, Lifton RP (2008)."A novel form of
nonglucocorticoid-remediable aldosteronism" J Clin
Endocrinol Metab 93 (8): 3117–3123
M, Nishikawa T (2015)."Comparison of cardiovascular
complications in patients with and without KCNJ5
gene mutations harboring aldosterone-producing
adenomas" J Atheroscler Thromb 22 (2): 191–200
surgically correctable forms, in centers from five
continents" J Clin Endocrinol Metab 89 (3): 1045–1050
characteristics of somatic mutations in Chinese
Hypertension 65 (3): 622–628.
Ngày nhận bài báo: 21/11/2016 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 14/12/2016 Ngày bài báo được đăng: 01/03/2017