Ngải trắng (Curcuma aromatica) là một vị thuốc nam phổ biến ở các tỉnh miền Tây Nam Bộ với các tác dụng đáng chú ý như kháng viêm, kháng ung thư… Zedoarondiol là một trong những hoạt chất của Ngải trắng có tác dụng kháng viêm. Hiện nay, Dược Điển Việt Nam V chưa quy định tiêu chuẩn cho dược liệu này. Nhằm mục tiêu đánh giá chất lượng dược liệu, quy trình định lượng zedoarondiol bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được xây dựng và thẩm định.
Trang 1XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ZEDOARONDIOL
TRONG THÂN RỄ NGẢI TRẮNG (RHIZOMA CURCUMAE AROMATICAE)
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Võ Thanh Hóa * , Lê Nữ Huỳnh Như * , Nguyễn Thị Quỳnh Trang * , Nguyễn Đức Hạnh *
TÓM TẮT
Mở đầu – mục tiêu: Ngải trắng (Curcuma aromatica) là một vị thuốc nam phổ biến ở các tỉnh miền
Tây Nam Bộ với các tác dụng đáng chú ý như kháng viêm, kháng ung thư… Zedoarondiol là một trong những hoạt chất của Ngải trắng có tác dụng kháng viêm Hiện nay, Dược Điển Việt Nam V chưa quy định tiêu chuẩn cho dược liệu này Nhằm mục tiêu đánh giá chất lượng dược liệu, quy trình định lượng zedoarondiol bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được xây dựng và thẩm định
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Các điều kiện khác nhau của quy trình xử lý mẫu và quy
trình sắc ký HPLC được sàng lọc và chọn lựa Quy trình định lượng zedoarondiol được thẩm định tính đặc hiệu, tính tương thích hệ thống, tính tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng theo hướng dẫn của ICH
Kết quả: Phương pháp chuẩn bị mẫu được chọn sử dụng dung môi methanol 100% để chiết xuất
zedoarondiol từ thân rễ Ngải trắng bằng phương pháp chiết Soxhlet Điều kiện sắc ký HPLC tối ưu bao gồm cột Hypersil gold C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), bước sóng phát hiện ở 258 nm, nhiệt độ cột 30 o C, tốc độ dòng 1 ml/phút Hỗn hợp acetonitril - nước được chọn làm dung môi pha động với tỷ lệ acetonitril lần lượt
là 2%, 8%, 16% và 18% ở thời điểm 0-3, 4-8, 9-18 và 22 - 30 phút Quy trình định lượng đạt yêu cầu độ đặc hiệu, tính tương thích hệ thống Tính tuyến tính được ghi nhận trong khoảng 7,47– 224,1 µg/mL (ŷ = 22,078x, R 2 =0,997) Độ lặp lại được xác định là 1,69% Độ đúng đạt yêu cầu với độ phục hồi trong khoảng
91,02-100,78%
Kết luận: Quy trình định lượng zedoarondiol từ thân rễ Ngải trắng bằng phương pháp HPLC đã được
xây dựng Quy trình định lượng đạt yêu cầu về thẩm định theo hướng dẫn của ICH và có thể được ứng dụng để xây dựng tiêu chuẩn dược liệu thân rễ Ngải trắng và các sản phẩm liên quan
Từ khóa: Rhizoma Curcumae aromaticae, zedoarondiol, định lượng, HPLC
ABSTRACT
ZEDOARONDIOL DETERMINATION FROM RHIZOMA CURCUMAE AROMATICAE
BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY METHOD
Vo Thanh Hoa, Le Nu Huynh Nhu, Nguyen Thi Quynh Trang, Nguyen Duc Hanh
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 - No 2- 2019: 249-255
Background – Objectives: Ngai trang (Curcuma aromatica) is a popularly medicine material of South
Vietnam folk medicine Zedoarondiol, one of the major bioactive compounds of C aromatica, has been reported to possess the anti-inflammatory activity Until now Vietnamese Pharmacopoeia has no monograph
on C aromatica The aim of this study was to develop an analytical procedure for zedoarondiol determination from C aromatica by using high performance liquid chromatography (HPLC) method
Methods: The sample preparation methods and HPLC conditions were screened and selected The
HPLC analytical method was validated according to the ICH guidelines including the specificity, suitability, linearity, precision and accuracy
* Khoa Dược, Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh
Trang 2Results: Methanol 100% and Soxhlet extraction were chosen as the best solvent and method for the
sample preparation The optimized HPLC condition employed Hypersil Gold C18 column (250 x 4.6 mm; 5 µm), a detection wavelength of 258 nm, a column temperature of 30 o C, a flow rate of 1 ml/min and a mixture of acetonitrile and water as a mobile phase The ratios of acetonitrile were 2%, 8%, 16% and 18%
at 0-3 min, 4-8 min, 9-18 min and 22 - 30 min, respectively The specificity and system suitability were found to meet the requirements The good correlations between peak areas and concentrations were obtained within a range of 7.47– 224.1 µg/mL (R 2 = 0.997) The RSD value of precision and the recovery percentages were found to be at 1.69% and within a range of 91.02 – 100.78%, respectively
Conclusions: The analytical procedure for zedoarondiol determination from rhizoma Curcumae
aromaticae by using HPLC method has been successfully developed The quantitation method met the requirements of validation and could be useful for establishing the quality standard of rhizoma Curcumae aromaticae and its related products
Keywords: Rhizoma Curumae aromaticae, zedoarondiol, quantitation, HPLC
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngải trắng (Curcuma aromatica Salisb.,
Zingiberaceae) là một trong những thành
phần quan trọng của bài thuốc chữa bệnh kinh
nguyệt không đều, băng huyết, đau bụng
kinh, viêm gan mạn tính, ho gà, sỏi tắc mật,
bệnh mạch vành(1), tại tỉnh An Giang Với các
tác dụng dược lý quan trọng nêu trên, nhiều
công trình nghiên cứu khoa học đã xác định
thành phần hóa học và tác dụng dược lý của
Ngải trắng Zedoarondiol (Hình 1) là một hoạt
chất của Ngải trắng có nhiều tác dụng sinh
học đã được công bố như kháng viêm(5), chống
xơ vữa động mạch(3), bảo vệ tế bào gan(4)…
Tuy nhiên, hiện nay chưa có nghiên cứu về
quy trình định lượng zedoarondiol trong dược
liệu này Vì vậy, đề tài được thực hiện nhằm
mục tiêu xây dựng quy trình định lượng
zedoarondiol trong thân rễ Ngải trắng
(Rhizoma curcumae aromaticae) bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), góp
phần phục vụ công tác kiểm soát chất lượng
dược liệu
Hình 1: Công thức cấu tạo của zedoarondiol
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng, nguyên liệu, hóa chất, thiết bị
Thân rễ của cây Ngải trắng (C aromatica)
được thu hái tại tỉnh An Giang và đã được định danh bằng phương pháp giải trình tự gen tại Trung tâm Y Sinh học phân tử, Đại học
Y Dược TP Hồ Chí Minh Chất chuẩn làm việc zedoarondiol (hàm lượng nguyên trạng 98,6%) được cung cấp bởi khoa Dược, Đại học Y Dược
TP Hồ Chí Minh Acetonitril (Labscan, Ireland) và nước cất đạt yêu cầu HPLC Methanol, ethanol 96% (Labscan, Ireland) đạt yêu cầu phân tích
Khảo sát quy trình xử lí mẫu
Chọn loại dung môi chiết xuất zedoarondiol
Bột thân rễ Ngải trắng (cân chính xác khoảng 1 g) được chiết xuất bằng thiết bị Soxhlet, sử dụng methanol 100% hoặc ethanol 96% trong cùng điều kiện nhiệt độ 100oC và thời gian chiết xuất là 120 phút Dịch chiết được cô dưới áp suất giảm tới cắn khô Hòa cắn với methanol 30% và cho vào bình định mức 25 ml, bổ sung thể tích vừa đủ, lọc qua màng lọc 0,22 μm và định lượng bằng phương pháp HPLC Chọn dung môi chiết được nhiều zedoaondiol và ít tạp nhất
Khảo sát thời gian chiết bằng Soxhlet
Bột thân rễ Ngải trắng (cân chính xác khoảng 1 g) được chiết xuất bằng thiết bị
Trang 3Soxhlet, sử dụng dung môi được chọn ở trên
trong các thời gian chiết xuất khảo sát lần lượt
là 60, 120 và 180 phút và nhiệt độ 100oC Dịch
chiết được cô dưới áp suất giảm tới cắn khô
Hòa cắn với methanol 30% và cho vào bình
định mức 25 ml, bổ sung thể tích vừa đủ, lọc
qua màng lọc 0,22 μm và định lượng bằng
phương pháp HPLC Chọn thời gian khảo sát
cho kết quả chiết xuât thu được nhiều
zedoaondiol nhất
Khảo sát điều kiện HPLC định lượng
zedoarondiol
Khảo sát điều kiện HPLC định lượng
zedoarondiol trong thân rễ Ngải trắng sử
dụng máy HPLC Azura (Knauer, Đức),
detector UVD 2.1L (Đức), cột sắc ký Hypersil
gold C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) và tiền cột
HQ 105 C18 (10 ×4,6 mm; 5 μm) (Thermo
Scientific, Mỹ), nhiệt độ cột 30oC, bước sóng
phát hiện 258 nm, tốc độ dòng 1 ml/phút và
thể tích tiêm mẫu 20 μl Thăm dò 4 chương
trình gradient pha động sử dụng hỗn hợp
acetonitril - nước làm dung môi rửa giải Chọn
điều kiện HPLC sao cho pic zedoarondiol tách
hoàn toàn khỏi các pic tạp và các thông số sắc
ký đạt yêu cầu
Thẩm định quy trình định lượng zedoarondiol
Thẩm định quy trình định lượng
zedoarondiol trong thân rễ Ngải trắng theo
hướng dẫn của ICH(2) về tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ chính xác và độ đúng
KẾT QUẢ
Khảo sát điều kiện HPLC định lượng
zedoarondiol
Khảo sát các chương trình pha động với các tỷ lệ dung môi acetonitril – nước khác nhau trình bày trong Bảng 1
Kết quả khảo sát chương trình pha động được trình bày trong Hình 2
Bảng 1: Các chương trình pha động HPLC định
lượng zedoarondiol
Chương trình pha động
Thời gian và tỉ lệ dung môi nước:
acetonitril
I 0 - 20 phút (90:10); 27 - 40 phút (10:90)
II 0 - 15 phút (98:2); 20 - 40 phút (27:73) III 0 - 15 phút (98:2); 20 - 40 phút (85 : 15)
IV 0 - 3 phút (98:2); 4 - 8 phút (92:8); 9 - 18
phút (84:16); 22 - 30 phút (82:18)
Hình 2: Sắc ký đồ HPLC phân tích mẫu thử với các chương trình pha động khác nhau
Zedaoarondiol
Trang 4Chương trình I, II (Hình 2) cho pic
zedoarondiol rửa giải ở thời gian lưu khoảng 25
phút, tuy nhiên, pic zedoarondiol chưa tách hòa
toàn khỏi các pic liền trước và sau Chương trình
III cho pic zedoarondiol đã tách ra khỏi tạp, độ
phân giải cao Tuy nhiên, thời gian lưu của pic
zedoarondiol kéo dài khoảng 33 phút Chương
trình IV có pic zedoarondiol gọn, cân đối, độ
phân giải cao, thời gian lưu khoảng 25 phút, các
thông số khác của pic đều nằm trong khoảng cho
phép Vì vậy, điều kiện IV được chọn để tiến
hành thẩm định quy trình định lượng
zedoarondiol thân rễ Ngải trắng
Khảo sát quy trình xử lí mẫu
Chọn loại dung môi chiết xuất zedoarondiol
Bảng 2: Kết quả khảo sát dung môi chiết zedoarondiol (n=3)
zedoarondiol (mAu.s)
Hình 3: Sắc ký đồ HPLC khảo sát dung môi chiết
zedoarondiol
Kết quả sắc ký HPLC khảo sát thành phần
dịch chiết thân rễ Ngải trắng bằng Soxhlet với 2
dung môi methanol 100% và ethanol 96% trong
120 phút được trình bày trong Hình 3
Methanol 100% và ethanol 96% đều chiết được zedoarondiol Tuy nhiên, methanol 100% chiết được nhiều zedoarondiol hơn ethanol 96% (Bảng 2) Vì vậy, methanol 100% được chọn làm dung môi chiết xuất zedoarondiol từ thân rễ Ngải trắng
Khảo sát thời gian chiết bằng Soxhlet Bảng 3: Kết quả khảo sát thời gian chiết zedoarondiol
(n=3)
zedoarondiol (mAu.s)
Hình 4: Kết quả sắc ký đồ HPLC khảo sát thời gian chiết zedoarondiol
Kết quả sắc ký HPLC khảo sát thành phần dịch chiết thân rễ Ngải trắng được chiết bằng phương pháp Soxhlet, sử dụng dung môi được chọn methanol 100% với các thời gian chiết khác nhau được trình bày trong Hình 4
Ethanol 96%
Methanol 100%
180 phút
120 phút
60 phút
Trang 5Bảng 3 cho thấy thời gian chiết Soxhlet càng
dài, lượng zedoarondiol thu được càng lớn Tuy
nhiên, sau 2 giờ và 3 giờ chiết, diện tích pic
zedoarondiol thu được thay đổi không đáng kể
(p>0,05) Vì vậy, 120 phút được chọn là thời gian
chiết xuất phù hợp bằng Soxhlet với dung môi
methanol 100%
Quy trình định lượng zedoarondiol trong
thân rễ Ngải trắng
Mẫu thử
Cân chính xác 1 g bột thân rễ Ngải trắng
cho vào bình chiết Soxhlet Tiến hành chiết với
methanol 100% ở 100oC trong 120 phút Dịch
chiết được cô dưới áp suất giảm tới khi thu
được cắn khô Hòa tan cắn với methanol 30%
và cho vào bình định mức 25 ml, bổ sung thể
tích vừa đủ, lọc qua màng lọc 0,22 μm
Mẫu đối chiếu
Dung dịch chuẩn đối chiếu zedoarondiol
nồng độ 100 μg/ml trong methanol
Điều kiện sắc ký HPLC: Điều kiện IV
Hàm lượng zedoarondiol (%) trong thân rễ
Ngải trắng đươc tính theo công thức sau:
m
V C
S
S
C
10000 1
X: % zedoarondiol trong dược liệu
St, Sc: lần lượt là diện tích pic zedoarondiol
của dung dịch thử và dung dịch chuẩn đối chiếu
Cc: nồng độ zedoarondiol của dung dịch
đối chiếu (μg/ml)
V: thể tích dung dịch thử (ml)
m: khối lượng cân của dược liệu (g)
h: độ ẩm của dược liệu
k: độ tinh khiết của chuẩn
Thẩm định quy trình định lượng zedoarondiol trong thân rễ Ngải trắng
Tính tương thích hệ thống
Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống
được trình bày trong Bảng 4 Các thông số thời
gian lưu, diện tích pic có RSD% ≤ 2% Hệ số bất đối, độ phân giải, số đĩa lý thuyết đạt yêu cầu phân tích Vậy, phương pháp đã xây dựng đạt tính tương thích hệ thống
Bảng 4: Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống
Rt
Trung bình 25,461 1723,782 815726 0,800 1,980
Tính đặc hiệu
Hình 5 cho thấy sắc ký đồ mẫu trắng (dung môi methanol 30%) không có pic xuất hiện trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic zedoarondiol trong mẫu chuẩn Sắc ký đồ của mẫu thử có pic có thời gian lưu tương ứng với pic zedoarondiol trong mẫu chuẩn Khi thêm chuẩn vào mẫu thử thì chiều cao và diện tích pic zedoarondiol trong mẫu thử tăng lên Độ tinh khiết pic zedoarondiol (trên hệ thống máy HPLC Alliance Water, đầu dò PDA 2969, phần mềm Empower) đạt yêu cầu
Kết quả khảo sát mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ zedoarondiol được trình bày trong Hình 6 Kết quả xử lý thống kê cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ zedoarondiol trong khoảng nồng độ 7,47– 224,1 (R2=0,997)
Độ lặp lại
Kết quả khảo sát độ lặp lại (Bảng 5) cho thấy %RSD=1,69% < 2% Vì vậy, quy trình đạt
yêu cầu về độ lặp lại
Bảng 5: Kết quả độ lặp lại
Trang 6Hình 5: Kết quả HPLC khảo sát độ đặc hiệu (R t pic zedoarondiol ≈ 25 phút)Khoảng tuyến tính
Hình 6: Tương quan giữa nồng độ và diện tích pic zedoarondiol
Độ đúng
Bảng 6: Kết quả khảo sát độ đúng
Mức nồng độ
thêm vào
Tỷ lệ phục hồi
80%
SD = 2,18 RSD = 2,25%
97,55 98,39 100%
SD = 3,77 RSD = 3,91%
94,05 94,92 120%
SD = 4,86 RSD = 5,05%
96,64 91,02
Độ đúng được tiến hành bằng cách thêm
chất chuẩn vào mẫu dược liệu 3 mức 80%,
100% và 120% so với nồng độ định lượng
zedoarondiol Mỗi mức chuẩn bị 3 mẫu Kết
quả đánh giá dựa vào tỷ lệ phục hồi Kết
quả khảo sát độ đúng được trình bày trong
Bảng 6
Ứng dụng quy trình định lượng để khảo sát hàm lượng zedoarondiol trong mẫu thân
rễ Ngải trắng X được thu hái tại tỉnh An Giang Kết quả được trình bày trong bảng 7
Bảng 7: Hàm lượng zedoarondiol trong mẫu X
Hàm lượng
%
BÀN LUẬN
Quy trình xử lý mẫu định lượng zedoarondiol trong thân rễ Ngải trắng đã được khảo sát dựa trên 2 yếu tố ảnh hưởng đáng kể đến lượng zedoarondiol chiết được là
Mẫu thử thêm chuẩn
Mẫu chuẩn
Mẫu thử
Mẫu trắng
Trang 7loại dung môi chiết và thời gian chiết xuất
bằng phương pháp Soxhlet Dung môi
methanol 100% được chọn làm dung môi chiết
xuất vì cho lượng zedoarondiol chiết được
nhiều hơn dung môi ethanol 96% trong cùng
một điều kiện chiết xuất Thời gian chiết bằng
phương pháp Soxhlet đã được xác định có ảnh
hưởng đáng kể kến lượng zedoarondiol chiết
được Thời gian tốt nhất để xử lý mẫu thử là
120 phút với dung môi được chọn là methanol
100% Tỷ lệ phục hồi của phương pháp định
lượng trong khoảng 91,02-100,78% thuộc
khoảng cho phép 90 - 107% và các giá trị
%RSD đều nhỏ hơn 5,3% Vì vậy, quy trình
định định lượng zedoarondiol trong thân rễ
Ngải trắng đạt yêu cầu thẩm định của một quy
trình định lượng
KẾT LUẬN
Quy trình định lượng zedoarondiol trong
thân rễ Ngải trắng đã được xây dựng và thẩm
định Kết quả thẩm định đạt các yêu cầu về độ
đặc hiệu, tính tương thích hệ thống, tính tuyến
tính, độ lặp lại (1,69%) và độ đúng với độ
phục hồi trong khoảng 91,02 - 100,78% Quy
trình này có thể được ứng dụng trong việc
định lượng và xây dựng tiêu chuẩn thân rễ Ngải trắng, đồng thời là dữ liệu quan trọng cho việc xây dựng quy trình định lượng cho các sản phẩm liên quan
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Đỗ Huy Bích (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt
Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr 391-2
2 Guideline ICH “Q2A text on validation of Analytical
Procedures”, Fed Regist 60.
3 Huimin M, Tianqi T, Dandan S (2016), “Zedoarondiol inhibits platelet-derived growth factor-induced vascular
smooth muscle cells proliferation via regulatin AMP-activated protein kinase signaling pathway”, Cell Physiol
Biochem, 40, pp 1506-20
4 Toshio M, Hisashi M (2002), “Potent protective effects of
sesquiterpenes and curcumin from Zedoariae rhizoma on
D-galactosamine/lipopolysaccharide or tumor necrosis
factor-α”, Biol Pharm Bull, 25 (5), pp 627-31
5 Woong C, Joo WN, Hyun JK (2009), “Zedoarondiol isolated
from the rhizoma of Curcuma heyneana is involved in the
inhibition of iNOS, COX-2 and pro-inflammatory cytokines via the down regulation of NF-κB pathway in
LPS-stimulated murine macrophages”, Int Immunopharmacol, 9,
pp 1049-57
Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018