Xác định vùng mang tính kháng nguyên của trình tự fliC và OmpN3, đồng thời trình tự nucleotide mã hóa cho các vùng này cũng được tối ưu hóa để biểu hiện trong Bacillus subtilis.
Trang 1XÁC ĐỊNH EPITOP TIỀM NĂNG TRÊN PROTEIN FLIC VÀ OMPN3
CỦA EDWARDSIELLA ICTALURI IN SILICO ĐỂ HƯỚNG ĐẾN ỨNG DỤNG
LÀM VACCIN PHÒNG BỆNH GAN THẬN MỦ
Nguyễn Thị Linh Giang * , Nguyễn Anh Minh * , Huỳnh Xuân Yến * , Trần Cát Đông * , Vũ Thanh Thảo *
TÓM TẮT
Mở đầu: Edwardsiella ictaluri là vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ trên cá da trơn Một số protein kháng
nguyên tiềm năng của E ictaluri đã được nghiên cứu như OmpN3 và fliC nhằm ứng dụng trong việc tạo vaccin tái tổ hợp để phòng bệnh Để các vaccin này có thể chủng ngừa qua đường niêm mạc, kháng nguyên
cần được cố định lên giá mang như Bacillus subtilis để tăng hiệu quả tác động
Mục tiêu: Xác định vùng mang tính kháng nguyên của trình tự fliC và OmpN3, đồng thời trình tự
nucleotide mã hóa cho các vùng này cũng được tối ưu hóa để biểu hiện trong Bacillus subtilis
Phương pháp: 30 chủng vi khuẩn phân lập từ cá bệnh gan thận mủ được định danh bằng phản ứng
sinh hóa và giải trình tự 16S rDNA Các gen fliC và OmpN3 được khuếch đại và giải trình tự để so sánh độ tương đồng Vùng mang tính kháng nguyên của fliC và OmpN3 được xác định bằng chương trình Imed, EpiC và Swiss-Model Quá trình tối ưu hóa vùng có tính kháng nguyên để biểu hiện trên Bacillus subitlis được thực hiện với chương trình ATGme
Kết quả: 30 chủng E ictaluri MS-17-156 đã được phân lập và định danh thành công Nghiên cứu đã
xác định và tối ưu hóa thành công đoạn gen mã hóa cho vùng kháng nguyên gồm 60 acid amin của protein fliC và OMPN3 với chỉ số CAI của trình tự sau tối ưu hóa lần lượt đạt 0,825 và 0,811
Kết luận: Trình tự đoạn nucleotide mã hóa cho vùng kháng nguyên của gen fliC và OmpN3 đã tối ưu
hóa in silico dự đoán có khả năng gây miễn dịch đặc hiệu đối với bệnh gan thận mủ, làm tiền đề cho các nghiên cứu phát triển vaccin tái tổ hợp
Từ khóa: fliC, OmpN3, epitope, E ictaluri
ABSTRACT
IDENTIFICATION OF POTENTIAL EPITOPES ON OMPN3 AND FLIC PROTEIN
FROM EDWARDSIELLA ICTALURI IN SILICO TO SERVE
AS VACCINE CANDIDATES AGAINST SEPTICEMIA
Nguyen Thi Linh Giang, Nguyen Anh Minh, Huynh Xuan Yen, Tran Cat Dong, Vu Thanh Thao
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 ‐ No 2‐ 2019: 32 – 39
Introduction: Edwardsiella ictaluri is the causative agent of Enteric septicemia in catfish (ESC)
OmpN3 and fliC protein from this bacteria have been proved to be potential vaccine candidates against ESC Therefore, in an attempt to develop recombinant mucosal vaccine, epitopes on these proteins are identified and presented on the flagella of Bacillus subtilis to induce effective immune responses
Method: 30 bacterial strains were isolated from catfish with ESC and identified based on their
biochemical profiles and 16S rDNA sequences fliC and OmpN3 genes of these strains were amplified, sequenced and aligned Their immunogenic regions were then identified and analyzed by bioinformatics software such as Imed, EpiC and Swiss-Model Besides, the coding sequence of the chosen immunogenic region for expression in Bacillus subtilis was optimized by using ATGme program
Trang 2Result: Collected strains are identified to be E ictaluri MS-17-156 The study has successfully
determined and optimized the nucleotide sequence encoding for 60 amino acids which has highest immunogenicity for fliC and OMPN3 candidate protein The CAI values of the optimized fliC and OmpN3 coding sequences are 0.825 and 0.811, respectively
Conclusion: The chosen antigenic regions of fliC and OMPN3 prove to be potential epitopes for
development of recombinant vaccines against ESC
Key words: fliC, OmpN3, epitope, E ictaluri
MỞ ĐẦU
Edwardsiella ictaluri là trực khuẩn Gram (‐)
thuộc họ Enterobacteriaceae, gây bệnh gan thận
mủ ở cá da trơn, đặc biệt là cá tra Bệnh ảnh
hưởng lên cá ở mọi giai đoạn, phát triển
nhanh chóng, lây lan mạnh và gây tỷ lệ chết
cao(1) Điều trị với kháng sinh chỉ hiệu quả
trong giai đoạn đầu khi cá mới nhiễm bệnh
Do đó, biện pháp thích hợp nhất để dự phòng
bệnh cho cá là sử dụng vaccin Các nghiên cứu
trong giai đoạn đầu chủ yếu sử dụng vaccin vi
khuẩn bất hoạt Tuy nhiên, khả năng gây miễn
dịch ở cá không được kéo dài(8) Sau đó, các
nghiên cứu hướng đến việc sử dụng vaccin
giảm độc lực để chủng ngừa cho cá Các
vaccin dạng này thường dùng dưới dạng tiêm
phúc mô vì vậy không thể áp dụng với số
lượng cá thể lớn Do đó, việc phát triển vaccin
tái tổ hợp có thể chủng ngừa qua đường niêm
mạc sẽ giúp khắc phục các nhược điểm này
Đối với các vaccin tái tổ hợp, việc lựa chọn
kháng nguyên có tính chất quyết định hiệu
quả chủng ngừa của vaccin Trong số các
kháng nguyên của E ictaluri, protein màng
ngoài (Outer membrane protein ‐ Omp), và
protein tiêm mao được chứng minh có khả
năng gây đáp ứng miễn dịch tốt, đây là các
ứng viên tiềm năng trong việc tạo vaccin tái tổ
hợp Omp là protein màng ngoài được nhận
diện cao bởi kháng thể trong huyết thanh của
cá nhiễm E ictalurid (7) Trong ba loại OmpN đã
được xác định ở E ictaluri, OmpN3 có khả
năng gây đáp ứng miễn dịch ở cá tốt nhất(11)
Đối với protein tiêm mao, gen mã hóa cho
protein fliC của E tarda tái tổ hợp vào E coli
được sử dụng để tạo vaccin DNA phòng bệnh
cho cá(3) Gần đây, Panangala và cs đã xác
định trên E ictaluri có hai flagellin 35 và 37 kDa được mã hóa bởi 4 gen fliC1, fliC2, fliC3 và fliC4 (6) có tính kháng nguyên và thể ứng dụng làm vaccin gan thận mủ
Sự phát triển của tin sinh học kết hợp với những tiến bộ trong công nghệ DNA tái tổ hợp, kiến thức về đáp ứng miễn dịch của vật chủ và vật liệu di truyền của tác nhân gây bệnh đã mở ra một hướng đi mới cho sản xuất vaccin Các phần mềm dự đoán vùng mang
tính kháng nguyên in silico từ trình tự amino
acid được phát triển dựa trên nhiều yếu tố, bao gồm cấu trúc biểu hiện trên bề mặt dự đoán, tính linh động của cấu trúc và các nhân
tố trong trình tự gen có liên quan đến tính gây miễn dịch như epitope của tế bào T và tế bào
B(9) Hiện nay, phương pháp thông dụng nhất
để dự đoán cấu trúc protein là mô phỏng tương đồng Trong đó, trình tự protein đích được so sánh với cơ sở dữ liệu Protein Data Bank, từ đó tìm ra trình tự nào đã được xác định cấu trúc bằng thực nghiệm tương đồng với trình tự mục tiêu Dựa trên trình tự này, các phần mềm sẽ xây dựng cấu trúc dự đoán của protein mục tiêu Bên cạnh đó, gen mục tiêu cần được tối ưu hóa cho sự biểu hiện bởi chủng tái tổ hợp dự kiến nhằm tránh hiện tượng dị biệt codon Tần suất sử dụng các codon đồng nghĩa thường có sự khác biệt giữa các loài, và đây thường được xem như một trong những nguyên nhân chính tác động đến
Trang 3mức độ biểu hiện protein(10) Chỉ số tương
thích codon (Codon Adaption Index ‐ CAI) và
số lượng codon hoạt động hiệu quả (Effective
number of codon ‐ ENc) là hai chỉ số thường
được quan tâm khi tiến hành tối ưu hóa
Nghiên cứu tiến hành xác định và tối ưu hóa
đoạn nucleotide mã hóa vùng mang tính
kháng nguyên của protein OmpN3 và fliC của
E ictaluri Các trình tự mang tính kháng
nguyên này sẽ được chèn vào vùng biến động
(acid amin 144‐217) ở giữa cấu trúc tiêm mao
hag của B subtilis nhằm hướng đến ứng dụng
làm vaccin niêm mạc phòng bệnh gan thận mủ
ở cá tra
VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vi khuẩn
30 chủng vi khuẩn phân lập từ cá tra bị gan thận mủ ở Đồng bằng sông Cửu Long
được cung cấp bởi công ty Vemedim E ictaluri medium (EIM) là môi trường chọn lọc
để phân lập vi khuẩn Kit API 20E (BioMerieux) dùng để khảo sát các đặc điểm
sinh hóa của vi khuẩn
Định danh các chủng vi khuẩn
Vi khuẩn thu nhận được cấy trên môi trường EIM, quan sát và mô tả đặc điểm của khuẩn lạc
Bảng 1: Danh sách mồi sử dụng trong nghiên cứu
1492R TACGGYTACCTTGTTACGACTT
fliC4_R GCCAATCGGCCATATACACTGG
OmpN3_R AGCATAGGGTATCAGAGGGTATC
Các chủng vi khuẩn được định danh dựa
trên đặc điểm sinh hóa thông qua kit API 20E
Đồng thời, các chủng vi khuẩn được định
danh ở cấp độ phân tử bằng giải trình tự gen
16S rDNA (Bảng 1) Mỗi mẫu được giải trình
tự với 2 phản ứng sử dụng mồi 27F và 1492R,
thực hiện bởi công ty Base I (Malaysia) Trình
tự thu được từ các phản ứng này được lắp ráp
lại dựa trên vùng gối đầu của các trình tự
bằng chương trình SeqMan (Lasergene 7.0)
Trình tự được đưa lên NCBI nBLAST để so
sánh với dữ liệu DNA của GenBank Các loài
có giá trị E thấp nhất và vùng Query Coverage
cao nhất là tương đối gần nhất với các chủng
giải trình tự
Xác định trình tự mang tính kháng nguyên
của fliC và OmpN3
Nghiên cứu của Panangala và cs đã xác
định và giải trình tự được 4 gen fliC1, fliC2,
fliC3 và fliC4 cùng quy định cho tiêm mao fliC
của E ictaluri, có trình tự acid amin trên cơ sở
dữ liệu NCBI tương ứng lần lượt là AVZ83421.1, AVZ83422.1, AVZ83423.1 và AVZ83424.1(6) Các trình tự acid amin này được gióng hàng cho thấy vùng bảo tồn thuộc acid amin 1‐160 ở đầu tận N và 74 acid amin cuối ở đầu tận C, tương ứng với domain D0/D1 của cấu trúc flagella vi khuẩn Gram
âm Domain D0/D1 sẽ gấp cuộn và tương tác với Toll‐like Receptor 5 gây đáp ứng miễn dịch Vì vậy, lựa chọn trình tự mang tính kháng nguyên trên vùng biến động của gen để
tạo được miễn dịch đặc hiệu đối với E ictaluri
Khi so sánh vùng biến động của các trình tự
fliC1‐fliC4, nhận thấy vùng biến động trong của trình tự acid amin quy định bởi gen fliC4
biểu hiện trên bề mặt của phân tử protein (theo kết quả mô phỏng cấu trúc của protein
từ chương trình Swiss‐Model), do đó sẽ có khả
Trang 4năng tạo miễn dịch tốt hơn(2) Cụ thể, một
trình tự biểu hiện lên bề mặt sẽ tương tác
được với kháng thể hiệu quả hơn (hoạt động
như B‐cell epitope) Vì vậy, nhóm nghiên cứu
lựa chọn gen fliC4 là gen đích để xác định
vùng mang tính kháng nguyên đặc hiệu đối
với E ictaluri Neema và cs đã ứng dụng tin
sinh học xác định cấu trúc và chức năng của
OmpN Kết quả, ở E ictaluri có 3 OmpN
(OmpN1, OmpN2 và OmpN3)(5) Yang và cs đã
tạo dòng và biểu hiện thành công rOmpN để
thử nghiệm khả năng bảo vệ chống lại E
ictaluri Kết quả cho thấy chủng ngừa bằng
protein rOmpN3 có phần trăm sống sót tương
đối là 67,5%, cao hơn so với rOmpN1 và
rOmpN2(11) Vì vậy, nhóm nghiên cứu lựa
chọn gen OmpN3 là gen đích để xác định vùng
mang tính kháng nguyên
Trình tự fliC4 và OmpN3 được khuếch đại
bằng phản ứng PCR với DNA nhiễm sắc thể
của 30 chủng E ictaluri phân lập được sau đó
được tinh chế và giải trình tự với cặp mồi
tương ứng (Bảng 1), đưa lên NCBI BLASTx để
so sánh với dữ liệu của GenBank và so sánh độ
tương đồng bằng phần mềm MegAlign
(Lasergene 7.0) Trình tự mang tính kháng
nguyên được dự đoán bằng chương trình
Imed (imed.med.ucm.es) và EpiC
(bioware.ucd.ie/epic) với tiêu chí: có tính kích
thích miễn dịch mạnh, quy định cho chuỗi 60
acid amin và nằm trên bề mặt của protein fliC
hoặc OmpN3 của E ictaluri (kiểm tra với
chương trình Swiss‐Model)
Mô phỏng cấu trúc protein tái tổ hợp hag
mang các kháng nguyên khảm
Các trình tự mang tính kháng nguyên của
fliC và OmpN3 sau khi lựa chọn thành công
được tiến hành tái tổ hợp giả định bởi chương
trình SnapGene để thu nhận protein hag.NFC
và hag.NOC Các protein tái tổ hợp được kiểm tra lại tính kháng nguyên và sự biểu hiện lên
bề mặt tiêm mao của đoạn kháng nguyên chèn
bằng chương trình Imed và Swiss‐Model Tối ưu hóa các gen cho sự biểu hiện bởi
Bacillus subtilis
Quá trình tối ưu hóa được thực hiện bằng cách thay thế các codon hiếm và rất hiếm của trình tự mang tính kháng nguyên thành các
codon tối ưu cho B subtilis (dựa trên bảng mã tần suất sử dụng codon của B subtilis subsp subtilis str 168), tuy nhiên, nếu codon hiếm hoặc rất hiếm đó có xuất hiện trong gen hag
nguyên thủy thì không thay thế Mục tiêu đạt được chỉ số CAI tương đương với CAI của
vùng biến động gen hag là 0,812 Sau khi đạt được trình tự tối ưu cho B subtilis, tiến hành kiểm tra sự tối ưu của trình tự này trên E coli
B ( giúp biểu hiện các protein có tính kháng nguyên ở dạng vaccin tiểu đơn vị để so sánh
với các vaccin tái tổ hợp trên Bacillus subtilis
trong các nghiên cứu tiếp theo) và thay đổi codon rất hiếm hoặc không sử dụng (nếu có), chỉ số CAI cần đạt được khoảng 0,5‐0,6 Trình tự sau tối ưu hóa được tổng hợp tại công ty Genscript® dưới dạng plasmid
pUC57.FNG
KẾT QUẢ Định danh các chủng vi khuẩn
Trên môi trường EIM, E ictaluri là những
khuẩn lạc tròn, trơn, lồi, có màu xanh lá, đường kính từ 1‐2 mm sau 48 giờ ở 28 oC (Hình 1A) Thử nghiệm trên kit API 20E (Hình 1B) cho kết quả mã của tất cả 30 chủng
4004000, là E ictaluri
Trang 5(A) (B)
Hình 1: Hình thái khóm và các phản ứng sinh hóa trên kit API 20E.
Gen 16S rDNA được khuếch đại thành
công với cặp mồi 27F/1492R (giếng 1‐30, Hình
2) Kết quả giải trình tự cho thấy độ tương
đồng 100% với trình tự tham chiếu
(CPCP028813.1) từ GenBank Từ các kết quả
về hình thái, sinh hóa và trình tự 16S rDNA, có
thể kết luận các chủng vi khuẩn phân lập từ cá
bệnh là các chủng E ictaluri MS‐17‐156
1500 bp
M 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
1500 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Hình 2: Sản phẩm PCR trình tự 16S rDNA của 30 chủng vi khuẩn
Xác định và tối ưu hóa trình tự mang tính
kháng nguyên của fliC
Gen fliC4 (1.227 bp) được thu nhận thành
công từ DNA nhiễm sắc thể của E ictaluri
bằng phản ứng PCR Kết quả giải trình tự fliC4
so sánh với dữ liệu DNA trong GenBank
thông qua BLASTx nhận thấy sự tương đồng 99‐100% với trình tự quy định flagellin C của
chủng E ictaluri MS‐17‐156, Accession ID AVZ83424.1 30 trình tự fliC4 này cũng giống
nhau khi so sánh bằng công cụ Clustal W của
phần mềm MegAlign
(C)
Hình 3: Kết quả dự đoán vùng mang tính kháng nguyên trên trình tự fliC AVZ83424.1 (A) Vùng mang
tính kháng nguyên xác định bằng Imed; (B) Vùng mang tính kháng nguyên xác định bằng EpiC; (C) Mô
phỏng tương đồng fliC bằng Swiss-Model Trình tự mang tính kháng nguyên của fliC
được xác định dựa trên trình tự acid amin
flagellin C, GenBank Accession ID
AVZ83424.1 bằng chương trình Imed và EpiC,
thu nhận được trình tự nằm từ acid amin 201 đến 259 (Hình 3A và 3B) Khi tiến hành mô
phỏng tương đồng cấu trúc protein fliC của E ictaluri dựa trên khuôn mẫu protein 3K8V
Trang 6bằng chương trình Swiss‐Model nhận thấy
vùng acid amin 201 đến 259 biểu hiện trên bề
mặt của protein fliC (vùng màu đỏ, Hình 3C)
Xác định trình tự mang tính kháng nguyên
của OmpN3
Gen OmpN3 (1.269 bp) được thu nhận
thành công từ DNA NST của E ictaluri Kết
quả so sánh các trình tự này với nhau nhờ
công cụ Clustal W của phần mềm MegAlign
cho thấy trình tự nucleotide của đoạn gen mã
hóa protein OMPN3 được bảo tồn ở các chủng
và không ghi nhận vùng biến động trên các
trình tự Kết quả BLASTx cho thấy trình tự
OmpN3 quy định cho porin của E ictaluri MS‐
17‐156, Accession ID WP_081167023.1
Vùng mang tính kháng nguyên trên
OmpN3 được xác định bằng chương trình
Imed và EpiC dựa trên trình tự WP_081167023.1, kết quả cho thấy đoạn acid amin có giá trị dự đoán cao nhất trong toàn bộ phân tử protein là đoạn 50 acid amin từ vị trí
258 đến 308 (Hình 4A và 4B) Kết quả mô
phỏng tương đồng OMPN3 của E ictaluri
bằng chương trình Swiss‐Model cho thấy cấu trúc vùng acid amin 258‐308 khá rộng, dễ tương tác không gian với các phân từ khác (Hình 4C)
(C)
Hình 4: Kết quả dự đoán vùng mang tính kháng nguyên của OMPN3 (A) Vùng mang tính kháng nguyên
xác định bằng Imed; (B) Vùng mang tính kháng nguyên xác định bằng EpiC; (C) Mô phỏng tương đồng
OMPN3 bằng Swiss-Model
Mô phỏng cấu trúc protein tái tổ hợp mang
kháng nguyên khảm
Trình tự DNA quy định cho vùng mang
tính kháng nguyên dự đoán của fliC và
OMPN3 được sử dụng để tái tổ hợp giả định với fragment N‐terminal và C‐terminal của
gen hag để thu nhận protein hag.NFC và
hag.NOC
Hình 5: Kết quả kiểm tra tính kháng nguyên trên protein hag.NFC và hag.NOC (A) Kiểm tra vùng mang
tính kháng nguyên của protein hag.NFC bằng Imed; (B) Kiểm tra vùng mang tính kháng nguyên của protein hag.NOC bằng Imed; (C) Bề mặt protein hag.NFC và hag.NOC mô phỏng tương đồng bằng Swiss-Model
Trang 7Trình tự acid amin của các protein khảm
này được kiểm tra với phần mềm Imed, nhận
thấy tính kháng nguyên của đoạn chèn vào
vùng biến động của gen hag vẫn được bảo tồn
(Hình 5A và 5B), vùng mang tính kháng
nguyên này cũng biểu hiện lên bề mặt protein
hag.NFC và hag.NOC khi mô phỏng tương
đồng bằng Swiss‐Model dựa trên khuôn mẫu
subunit flagella filament 5WJT và 5WJZ của B
subtilis (vùng màu đỏ, Hình 5C)
Tối ưu hóa các trình tự mang tính kháng
nguyên của OmpN3 và fliC
Các codon hiếm và rất hiếm xuất hiện
trong trình tự mã hóa vùng mang tính kháng
nguyên fliC và ompN3 được xác định bằng
chương trình ATGme như ACT, TCC, GTC,
ACC, GCT, TAC và các codon có mức độ biểu
hiện trung bình GAG, GGT, CAG, GCA, GAT,
AAG, AGC được thay thế bằng các codon có
mức độ biểu hiện cao nhằm đạt được chỉ số
CAI tương dương với gen hag trong B subtilis
Trình tự DNA mã hóa vùng mang tính kháng
nguyên của fliC và ompN3 sau khi tối ưu hóa
được trình bày dưới đây với các codon tối ưu
được in đậm
Trình tự mang tính kháng nguyên của fliC
sau khi tối ưu hóa có CDS 180 bp:
GCT ACA GGC TCT TTG GAA CTG ACA
AAA GGA CAA ACA CTG GTT TCA GGA
ACA GAT GCT ACA GGA GCT GCG ACA
TAT TAT CTG AAG GGT GTT GAC GCA
GCA ACA GGT AAA GTA ACA TAT TCA
TCT GTT AAA TTT ACT GTT GAT GCA
AAA GAT GCA ACA AAA GTT ACT GTT
GCG GCA GAT AAA
Trình tự mang tính kháng nguyên của
OmpN3 sau khi tối ưu hóa có CDS 174 bp:
CTT GCA CGC TAT GAT AAC CAC AAT
GTA TAT CTT GCA GCA ATC TAT GGT
GAA GTA AAG AAT ATG CAC TAT ATT
GGT AAA CAG GAT GGA TTC GCA CCT
AAG GCA CGT GGA TAT GAG CTT CTT
GCA CAG TAT CAG TTC GAC TGC GGT
CTT AAA CCT TCA CTT GCA TAT CTT AAC GGA
Các giá trị tham số của quá trình tối ưu hóa được trình bày trong Bảng 2
Bảng 2: Các giá trị tham số của quá trình tối ưu hóa
Trình tự
Bacillus subtilis Escherichia
coli B
CAI ENc CAI
Vùng biến động gen hag 0,812 41
fliC sau tối ưu hóa 0,825 34 0,569
OmpN3 sau tối ưu hóa 0,811 32 0,583
Giá trị CAI của trình tự mã hóa kháng
nguyên fliC và OmpN3 đã đạt mục tiêu đề ra, xấp xỉ 0,812 của vùng biến động gen hag, dựa trên tần suất sử dụng codon của B subtilis Hệ
số CAI của cả 2 trình tự mã hóa vùng mang
tính kháng nguyên trên E coli là khoảng 0,55
BÀN LUẬN
Trong số các kháng nguyên, fliC và OMPN3 là các ứng viên tiềm năng cho vai trò tác nhân trị liệu FliC là một protein tiêm mao
của vi khuẩn Gram âm đã được chứng minh
có liên quan đến độc lực của nhiều tác nhân
gây bệnh ở cá như Vibrio anguillarum, V fischeri, Aeromonas hydrophila, E tarda Các
nghiên cứu trước đây chủ yếu sử dụng flagellin C như một tá dược miễn dịch(3)
nhưng chưa có nghiên cứu ứng dụng fliC làm
tác nhân gây miễn dịch đặc hiệu như trong nghiên cứu này Việc nhóm nghiên cứu lựa
chọn vùng biến động của gen fliC4 của E ictaluri thể hiện nhiều đặc tính của một kháng
nguyên hiệu quả: thân nước, đặc hiệu đối với
E ictaluri và có khả năng kích thích miễn dịch
mạnh Protein màng ngoài đã được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu sản xuất vaccin chống lại các bệnh nhiễm ở cá(4) Nghiên cứu đã thực hiện mô phỏng cấu trúc 3D của protein
OMPN3 và dự đoán vùng mang tính kháng
nguyên mạnh trên phân tử Từ đó, lựa chọn
vùng 51 acid amin (258‐308) của OMPN3,
nhằm mục đích tăng đáp ứng miễn dịch vì vùng này dễ dàng được nhận diện bởi hệ
thống miễn dịch của cá
Trang 8KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã định danh được 30 chủng
vi khuẩn phân lập từ cá bệnh ở vùng đồng
bằng sông Cửu Long là E ictaluri bằng giải
trình tự 16S rDNA và phản ứng sinh hóa
Trình tự của vùng mang tính kháng nguyên
của các ứng viên tiềm năng fliC và OmpN3
được xác định và tối ưu hóa in silico cho sự
biểu hiện bởi B subtilis
Lời cảm ơn: Nghiên cứu này sử dụng kinh phí của đề tài số
240/2017/HĐ-SKHCN do Sở Khoa học và Công nghệ TP.Hồ
Chí Minh cấp cho Vũ Thanh Thảo
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Crumlish M, Dung TT, Turnbull JF, et al (2002),
"Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased
freshwater catfish, Pangasius hypophthalmus (Sauvage),
cultured in the Mekong Delta, Vietnam", Journal of Fish
Diseases 25(12), pp.733‐736
2 Hopp TP, Woods KR (1981), "Prediction of protein
antigenic determinants from amino acid sequences", Proc
Natl Acad Sci U S A 78(6), pp.3824‐3828
3 Jiao XD, Zhang M, Hu YH, et al (2009), "Construction and
evaluation of DNA vaccines encoding Edwardsiella tarda
antigens", Vaccine 27(38), pp.5195‐5202
4 Luo Z, Fu J, Li N, et al (2016), "Immunogenic proteins and
their vaccine development potential evaluation in outer
membrane proteins (OMPs) of Flavobacterium columnare",
Aquaculture and Fisheries 1, pp.1‐8
5 Neema NM, Karunasagar I, et al (2011), Structural and functional characterization of outer membrane protein N in
Edwardsiella ictaluri: A bioinformatic approach Vol 2
6 Panangala VS, Russo R, Santen VLV, et al (2009),
"Organization and sequence of four flagellin‐encoding genes of
Edwardsiella ictaluri", Aquaculture Research 40(10), pp.1135‐1147
7 Park SB, Jang HB, Nho SW, et al (2011), "Outer Membrane Vesicles as a Candidate Vaccine against Edwardsiellosis",
Plos One 6(3), e17629
8 Shoemaker CA, Klesius P H (1997), "Protective immunity against enteric septicaemia in channel
catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque), following controlled exposure to Edwardsiella ictaluri", Journal of
Fish Diseases 20(5), pp.361‐368
9 Soria‐Guerra RE, Nieto‐Gomez R, Govea‐Alonso DO, et al (2015), "An overview of bioinformatics tools for epitope
prediction: Implications on vaccine development", Journal
of Biomedical Informatics 53, pp.405‐414
10 Villalobos A, Ness JE, Gustafsson C, et al (2006), "Gene Designer: a synthetic biology tool for constructing artificial
DNA segments", BMC Bioinformatics 7, pp.285
11 Yang Q, Pan YL, Wang KY, et al (2016), "OmpN, outer
membrane proteins of Edwardsiella ictaluri are potential
vaccine candidates for channel catfish (Ictalurus
punctatus)", Molecular Immunology 78, pp.1‐8
Ngày nhận bài báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019