U nguyên bào võng mạc (UNBVM), một trong những loại ung thư thường gặp nhất ở trẻ nhỏ trong khoảng độ tuổi từ 1-5 tuổi. Tỷ lệ mắc phải trong khoảng từ 1/14000 đến 1/20000 trẻ em sinh ra trên toàn thế giới. Đột biến trên gen RB1 được cho là nguyên nhân quan trọng nhất dẫn đến UNBVM.
Trang 1XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHẢO SÁT GEN RB1
TRONG UNG THƯ NGUYÊN BÀO VÕNG MẠC (RETINOBLASTOMA)
Nguyễn Thế Vinh * , Hoàng Anh Vũ *
TÓM TẮT
Mở đầu: U nguyên bào võng mạc (UNBVM), một trong những loại ung thư thường gặp nhất ở trẻ nhỏ
trong khoảng độ tuổi từ 1-5 tuổi Tỷ lệ mắc phải trong khoảng từ 1/14000 đến 1/20000 trẻ em sinh ra trên toàn thế giới Đột biến trên gen RB1 được cho là nguyên nhân quan trọng nhất dẫn đến UNBVM.Việc phát hiện sớm đột biến trên gen RB1 giúp phòng ngừa, chẩn đoán sớm và hạn chế hậu quả không chỉ UNBVM mà còn một số ung thư khác (có liên quan đến đột biến trên gen RB1)cho bệnh nhân cũng như thân nhân người bệnh
Mục tiêu: Xây dựng được quy trình ứng dụng kỹ thuật giải trình tự khảo sát đột biến trên gen RB1
Đối tượng và phương pháp: Sử dụng phương pháp khuếch đại chuỗi DNA (PCR) và giải trình tự Sanger
toàn bộ các exon trong vùng mã hóa protein gen RB1 trên genomic DNA từ mẫu khối u và máu ngoại vi được lấy
từ bệnh nhân UNBVM
Kết quả: Thiết kế thành công 19 cặp mồi và quy trình PCR khuếch đại 27 exon gen RB1 Phát hiện đột biến
dòng mầm g.69681C>T (NG_009009) gen RB1
Kết luận: Nghiên cứu đã hoàn thiện quy trình và ứng dụng thành công kỹ thuật giải trình tự trong chẩn
đoán đột biến gen RB1
Từ khóa: u nguyên bào võng mạc, genRB1, kỹ thuật giải trình tự.
ABSTRACT
DEVELOP A PROTOCOL FOR SCREENING RB1 MUTATIONS IN RETINOBLASTOMA PATIENTS
Nguyen The Vinh, Hoang Anh Vu
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 20 - Supplement of No 1 - 2016: 94 - 100
Background: Retinoblastoma is one of the most frequent cancer in children age 1-5 The incidence is
between 1/14000 -1/20000 live births all over the world The RB1 mutations aremajor cause lead to retinoblastoma Early identifying mutations on RB1 gene is important for prevention, diagnosis and controlling the outcomes of retinoblastoma and several other cancers (related to mutations on RB1 gene) as well for patients and their family
Objective: Develop a sequencing protocol for RB1mutations screening
Method: Use PCR method and Sanger sequencing to all of exons of RB1 coding site of genomic DNA
extracted from tumor tissue and blood of retinoblastoma patients
Results: Successfully designed 19 pairs of primer and PCR protocol that amplifies 27 exons of RB1
Identified a nonsense mutation g.69681C>T (NG_009009) of exon 12 of RB1
Conclusion: Our research has developed and applied successfully a sequencing protocol to identify
mutations of RB1
Keywords: Retinoblastoma, RB1, sequencing
* Trung tâm Y sinh học Phân tử, Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh
Trang 2ĐẶT VẤN ĐỀ
U nguyên bào võng mạc xuất phát từ tế bào
tiền thân của nhóm tế bào thụ quan ánh sáng
trong võng mạc mắt, thường xảy ra với tần suất
1/14000 đến 1/20000 trẻ trong độ tuổi dưới 5 tuổi,
sau độ tuổi này bệnh hiếm khi được phát hiện(4)
Bệnh xảy ra ở hai dạng: dạng ngẫu nhiên (không
có tính di truyền từ gia đình) và dạng gia đình
(có tính di truyền)(3) Dạng gia đình của UNBVM
xuất hiện ở những trẻ có cha mẹ đã từng mắc
bệnh này, bệnh nhân thường có nhiều ổ khối u ở
cả hai mắt, tần suất của dạng này khoảng 20%(10)
Hơn thế nữa việc chữa trị khối u ở mắt với
phương pháp xạ trị hoặc phẫu thuật, cũng
không làm giảm được nguy cơ cao mắc ung thư
xương – osteosarcoma (gấp 500 lần so với bình
thường) trong suốt tuổi thanh niên của bệnh
nhân và tính nhạy cảm với nhiều loại ung thư
khác trong suốt cuộc đời(15)
Hầu hết các bệnh nhân đều được phát hiện ở
giai đoạn bệnh tiến xa, có thể gây chết nên phải
sử dụng phương pháp múc bỏ nhãn cầu để điều
trị, ở bệnh nhân chỉ biểu hiện bệnh ở một bên
mắt tỷ lệ chữa khỏi hơn 95%(1) Những bệnh
nhân có khối u ở cả hai mắt thường phải điều trị
bằng nhiều phương pháp kết hợp (hóa trị, trị
liệu tại chỗ…) Với việc phát hiện sớm bệnh, tỷ lệ
bệnh UNBVM ở các nước phát triển chữa trị
thành công và bảo tồn được thị lực bệnh nhân
trên 95%(8)
Đột biến trên gen RB1 là yếu tố được cho
rằng quan trọng nhất gây ra UNBVM Gen RB1
gồm 27 exon, nằm trên nhiễm sắc thể (NST) 13
mã hóa cho chuỗi protein dài 928 acid amin Sản
phẩm gen RB1 tham gia vào hệ thống điều hòa
chu kỳ tế bào thông qua sự phosphoryl hóa và
khử phosphoryl hóa trong suốt quá trình tăng
sinh và biệt hóa tế bào(7) Phổ đột biến của gen
RB1 trải dài trên các exon và vùng tiếp nối
intron-exon chứ không tập trung vào vùng nào
cụ thể, đa số là các đột biến điểm, chèn hoặc mất
vài nucleotide và một số ít là các đột biến mất
đoạn lớn(5, 11) RB1 thuộc nhóm gen ức chế khối u,
RB1 đột biến mang tính trạng lặn do đó UNBVM
thường phát sinh khi có đột biến gây bất hoạt cả
2 alen của gen RB1 ( 3 , 6 ) Đột biến ở alen đầu tiên thường là các đột biến sinh dưỡng, đột biến de-novo trong trường hợp dạng ngẫu nhiên, hoặc đột biến dòng mầm trong trường hợp dạng gia đình Đột biến trên alen còn lại thường xảy ra ở
tế bào trên võng mạc(12) Việc sử dụng phương pháp giải trình tự Sanger rất thích hợp cho nghiên cứu này vì phổ
đột biến rộng của gen RB1 và các đột biến đa
phần là những đột biến nhỏ Phát hiện đột biến
gen RB1 có ý nghĩa quan trọng đối với bệnh
nhân đang được điều trị về khả năng tái phát cũng như nguy cơ mắc các loại ung thư khác đồng thời xây dựng quy trình tầm soát nguy cơ UNBVM cho người lành mang gen bệnh Điều trị sớm cho bệnh nhân mắc hoặc có nguy cơ UNBVM làm tăng khả năng chữa trị và bảo toàn thị lực(13)
Ứng dụng các phương pháp xét nghiệm gen trong y sinh học phân tử trong việc chẩn đoán bệnh UNBVM, cũng như các bệnh di truyền khác sẽ cho kết quả chính xác, nhanh chóng Đồng thời giúp chẩn đoán sớm bệnh ở các bệnh nhân có biểu hiện triệu chứng bệnh chưa rõ ràng, cũng như tiềm năng trong các ứng dụng chẩn đoán tiền sinh
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu
Mẫu genomic DNA được thu nhận từ khối u (đã được chọn lọc vùng ung thư bởi các bác sĩ bệnh viện Mắt Thành phố Hồ Chí Minh) và máu bệnh nhân mắc UNBVM ở cả 2 bên mắt (mẫu khối u được thu nhận từ vùng mắt phải của bệnh nhân)
Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm Y Sinh Học Phân Tử - Đại học Y Dược TP.HCM Mẫu xét nghiệm là mẫu mô khối u và máu được
ly trích DNA và giải trình tự DNA toàn bộ 27
exon gen RB1
Trang 3Tách chiết genomic DNA từ mẫu máu: tiến
hành lấy 2 ml máu tĩnh mạch, cho vào ống chống
đông có EDTA, lắc đều nhẹ nhàng Genomic
DNA được tách chiết trong vòng 24 giờ bằng bộ
kit illustra blood genomicPrep Mini Spin Kit (GE
Healthcare, Anh) theo hướng dẫn sử dụng của
nhà sản xuất
Tách chiết genomic DNA từ mẫu khối u:
mẫu mô tươi được chuyển từ bệnh viện đến
trung tâm Y Sinh Học Phân Tử trong vòng 4 giờ
ở nhiệt độ phòng DNA từ khối u được tách
bằng phương pháp Trizol/Chloroform, DNA
tách chiết được trữ ở 4oC cho đến khi sử dụng
cho các thí nghiệm sau
Thiết kế mồi cho 27 exon của gene RB1: sử
dụng phần mềm CLC main workbench tải trình
tự gene RB1 của người từ NCBI(NG_009009.1),
sau đó sử dụng công cụ thiết kế mồi sẵn có của
phần mềm để thiết kế mồi PCR cho các exon của
gene RB1
Thiết lập điều kiện cho PCR khuếch đại toàn
bộ chiều dài gen RB1: Mỗi tube PCR có thể tích
15 l chứa các thành phần: 1,5μl PCR buffer 10X;
1,5μl dNTP 2,5mM; 0,75μl mỗi mồi xuôi và
ngược (10nM/μl); 0,1μl TaKaRa TaqTM HotStart
25mM; 2μl genomic DNA (20-50ng/μl) và 8,4μl
nước cất 2 lần khử ion Các phản ứng luôn kèm
theo một chứng âm không chứa DNA để kiểm
soát ngoại nhiễm Chu trình luân nhiệt cho PCR
được thực hiện trên máy Mastercycler@Pro S
(eppendorf, Đức) Chu kỳ nhiệt: khởi đầu tại
98oC trong 3 phút, tiếp theo với 40 chu kỳ lặp lại
các bước 98oC : 10 giây, 58oC : 20 giây, 72oC : 1 phút 30 giây; kế tiếp với bước 72oC : 2 phút Trữ sản phẩm PCR tại 4oC
Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên thạch agarose: trên thạch agarose 2% có nhuộm ethium bromide và quan sát với hệ thống chụp ảnh điện di Geldoc-ItTM (UVP, Mỹ)
Tinh sạch sản phẩm: trường hợp có băng phụ xuất hiện, sản phẩm PCR mong muốn được cắt từ gel và tinh sạch Sản phẩm PCR trực tiếp hoặc cắt từ gel sau đó được tinh sạch bằng
Purification Kit (GE Healthcare) theo hướng dẫn
sử dụng của nhà sản xuất
Giải trình tự bằng phương pháp Sanger: sản phẩm PCR đã được tinh sạchsẽ được thực hiện phản ứng cycle sequencing với BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, Mỹ) theo hai chiều xuôi và ngược Sản phẩm sau đó được kết tủa bằng ethanol tuyệt đối, lạnh, với sự hỗ trợ tủa bằng muối
NH4OAC, hòa tan trong Hi-Di formaldehyde, biến tính ở 96C trước khi làm lạnh đột ngột Trình tự DNA được đọc bằng máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP-7 polymer và capillary 50 cm (Applied Biosystems, Mỹ)
Phân tích kết quả giải trình tự: Kết quả giải trình tự sẽ được phân tích bằng phần mềm CLC Main Workbench, so sánh với trình tự chuẩn của
RB1 tham khảo từ ngân hàng trình tự gene trên
website NCBI
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả thiết kế mồi
Bảng 1: Trình tự 19 cặp mồi sử dụng khuếch đại 27 exon gen RB1 và thông số
phẩm (bp)
Vùng exon khuếch đại
Trang 4STT Mồi xuôi (5’-3’) Mồi ngược (5’-3’) Độ dài sản
phẩm (bp)
Vùng exon khuếch đại
16,17
23
Bảng 2: Các phản ứng khuếch đại exon gen RB
nhân
Chứng âm (nước cất 2 lần khử ion)
Kích thước vùng khuếch đại
(bp)
Trang 5Hình 1: Kết quả điện di sản phẩm PCR Giếng 1 (mồi RB1-1F/1R, 418bp), giếng 3 (mồi RB1-2F/2R, 480bp),
giếng 5 (mồi RB1-3F/3R, 417bp), giếng 7 (mồi RB1-4F/4R, 424bp),giếng 9 (mồi RB1-5F/6R, 1591bp), giếng 11 (mồi 7F/7R, 288bp), giếng 13 (mồi 8F/8R, 415bp), giếng 15(mồi 9F/9R, 222bp), giếng 17 ( mồi
RB1-10F/11R, 1850bp), giếng 19(mồi RB1-12F/12R, 434bp), các giếng số chẵn là các giếng chứng âm (nước cất 2 lần khử ion)
Nhận xét: các giếng sử dụng genomic DNA đều cho sản phẩm khuếch đại có kích thước mong muốn Các giếng chứng âm không có sản phẩm khuếch đại
Hình 2: Kết quả điện di sản phẩm PCR Giếng 21 (mồi RB1-13F/13R, 394bp), giếng 23 (mồi RB1-cF4/17R,
1372bp), giếng 25 (mồi 18F/18R, 437bp), giếng 27 (mồi 19F/19R, 282bp), giếng 29 (mồi
RB1-20F/20R, 349bp), giếng 31 (mồi RB1-21F/23R, 1962bp), giếng 33 (mồi RB1-24F/24R, 279bp), giếng 35 (mồi RB1-25F/26R, 1017bp), giếng 37 (mồi RB1-27F/27R, 241bp), các giếng số chẵn là chứng âm (nước cất 2 lần khử ion)
32
24
Thang chuẩn (bp)
38
21
1500 _ 2000 _
1000 _
700 _
500 _
2000 _
1500 _
1000 _
700 _
500 _
200 _
300 _
12
4
Thang chuẩn (bp)
18
Trang 6Nhận xét: các giếng sử dụng genomic DNA
đều cho sản phẩm khuếch đại có kích thước
mong muốn Các giếng chứng âm không có sản phẩm khuếch đại
Kết quả giải trình tự
Hình 2: Kết quả giải trình tự exon 12 gen RB1 trên DNA được lấy từ mẫu khối u ở bệnh nhân
Hình 3: Kết quả giải trình tự exon 12 gen RB1 trên DNA được lấy từ mẫu máu ở bệnh nhân
Nhận xét: trên 27 exon được khảo sát của gen
RB1 ở bệnh nhân, ở mẫu khối u chỉ phát hiện
được một đột biến điểm ở vị trí g.69681C>T
(NG_009009) ở dạng đồng hợp tử, ở mẫu máu
chỉ phát hiện được một đột biến điểm ở vị trí
g.69681C>T (NG_009009) ở dạng dị hợp tử
BÀN LUẬN
Kết quả điện di cho thấy các mồi hoạt động
tốt, tạo sản phẩm đặc hiệu, không tạo băng phụ,
primer dimer Các băng có độ sáng khá đồng
đều chứng tỏ dung dịch phản ứng PCR hoạt
động tốt, chu trình nhiệt phù hợp với nhiệt độ
bắt cặp mồi và thời gian kéo dài thích hợp Các
giếng chứng âm không có sản phẩm DNA ,
không bị ngoại nhiễm chứng tỏ thao tác và điều
kiện thực hiện phản ứng PCR tốt
Trong phương pháp PCR, 5 cặp mồi được sử dụng để khuếch đại nhiều vùng exon liền kề nhau (RB1-g5F/RB1-g6R, RB1-g10F/RB1-g11R, cF4/g17R2, g21F2/g23R, RB1-g25F/RB1-g26R).Việc sử dụng kết hợp này giúp tiết kiệm thời gian và hóa chất hơn so với khuếch đại riêng từng vùng exon mà không làm thay đổi tính trung thực của kết quả
Kết quả giải trình tự phát hiện được đột biến tại vị trí g.69681 C>T, đột biến điểm này làm thay đổi bộ ba codon CAA thành UAA, chuyển Glutamine thành Stop codon tại vị trí acid amin thứ 384 trên chuỗi protein RB1(p.Q384X) Đột biến đã từng được ghi nhận bởi Shimizu và cộng
sự (1994), bệnh nhân mang đột biến này trên dòng mầm và có biểu hiện bệnh ở cả hai mắt(14)
Genebank
Patient
Genebank
Patient
Trang 7Từ kết quả giải trình tự trên mẫu mô khối u
và mẫu máu của bệnh nhân có thể thấy được sự
khác biệt rõ ràng, trên mẫu mô là đột biến đồng
hợp tử, nhưng trên mẫu máu đột biến là dị hợp
tử Đột biến dị hợp trên mẫu máu thể hiện rõ
ràng tỷ lệ 50:50 giữa alen lành và alen bệnh của
gen RB1, như vậy có thể kết luận đây là đột biến
dòng mầm RB1 thuộc nhóm gen ức chế khối u,
tính trạng lặn, vì vậy để có thể biểu hiện ra kiểu
hình bệnh đòi hỏi đột biến gây hỏng phải xuất
hiện trên cả 2 alen của gen này Có thể thấy rõ
đột biến trên khối u là đột biến đồng hợp, như
vậy những tế bào ung thư trên bệnh nhân đã
thành công trong việc loại bỏ một alen bình
thường còn lại của gen RB1, làm tế bào mất khả
năng điều hòa chu kỳ tế bào của protein RB1
Việc chuyển từ trạng thái dị hợp tử sang đồng
hợp tử của gen RB1 này đã được nhiều nghiên
cứu ghi nhận và chứng minh do quá trình làm
mất tính dị hợp (loss of heterozygocity) xảy ra
trong kỳ nguyên phân của tế bào(16) Do vậy hiện
tượng làm mất tính dị hợp làm cho những bệnh
nhân có mang đột biến dòng mầm gen RB1 có
nguy cơ cao không chỉ với bệnh UNBVM mà còn
một số loại ung thư khác (ung thư xương(15), ung
thư bàng quang(9), ung thư phổi tế bào nhỏ…(2))
KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã thiết lập thành công quy trình
phát hiện đột biến trên 27 exon gen RB1 bằng
phương pháp giải trình tự chuỗi Sanger Điều này
có ý nghĩa quan trọng trong việc tư vấn di truyền
để đưa ra phương pháp tầm soát ung thư thích
hợp cho bệnh nhân và thân nhân người bệnh
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Chintagumpala M, Chevez-Barrios P, Paysse EA, Plon SE,
Hurwitz R(2007) Retinoblastoma: review of current
management The Oncologist, 12(10):1237-1246
2 Fletcher O, Easton D, Anderson K, Gilham C, Jay M, Peto
J(2004) Lifetime risks of common cancers among
retinoblastoma survivors Journal of the National Cancer
Institute, 96(5):357-363
3 Fletcher O, Houlston RS(2010) Architecture of inherited
susceptibility to common cancer Nature Reviews Cancer,
10(5):353-361
4 Francois J, Matton MT, De Bie S, Tanaka Y, Vandenbulcke D(1975) Genesis and genetics of retinoblastoma
Ophthalmologica, 170(5):405-425
5 Houdayer C, Gauthier-Villars M, Lauge A, Pages-Berhouet S, Dehainault C, Caux-Moncoutier V, Karczynski P, Tosi M, Doz
F, Desjardins L(2004) Comprehensive screening for
constitutional RB1 mutations by DHPLC and QMPSF Human mutation, 23(2):193
6 Kufe DW, Pollock RE, Weichselbaum RR, Bast RC, Gansler
TS, Holland JF, Frei E, Park BH, Vogelstein B(2003) Retinoblastoma A Paradigm for Tumor-Suppressor Gene Function, 10(7): 399
7 Lapenna S, Giordano A(2009) Cell cycle kinases as
therapeutic targets for cancer Nature Reviews Drug Discovery,
8(7):547-566
8 8 MacCarthy A, Draper G, Steliarova-Foucher E, Kingston J(2006) Retinoblastoma incidence and survival in European children (1978–1997) Report from the Automated Childhood
Cancer Information System project European Journal of Cancer,
42(13):2092-2102
9 Miyamoto H, Shuin T, Torigoe S, Iwasaki Y, Kubota Y(1995) Retinoblastoma gene mutations in primary human bladder
cancer British journal of cancer, 71(4):831
10 Newsham I, Hadjistilianou T, Cavenee W(1998)
Retinoblastoma Scriver CH, Beaudet A, Sly W, Valle D The metabolic and molecular bases of inherited disease Cap, 11(7):42-613
11 Ottaviani D, Parma D, Giliberto F, Ferrer M, Fandino A, Davila MT, Chantada G, Szijan I(2013) Spectrum of RB1 Mutations in Argentine Patients: 20-years Experience in the
Molecular Diagnosis of retinoblastoma Ophthalmic genetics,
34(4):189-198
12 Pagon RA, Lohmann DR, Gallie BL (2000) Retinoblastoma In: Adam MP, Ardinger HH, Wallace SE, Amemiya A, Bean LJH, Bird TD, Fong CT, Mefford HC, Smith RJH, Stephens K, editors GeneReviews® [Internet] 259-263 University of Washington, Seattle
13 Richter S, Vandezande K, Chen N, Zhang K, Sutherland J, Anderson J, Han L, Panton R, Branco P, Gallie B(2003) Sensitive and efficient detection of RB1 gene mutations
enhances care for families with retinoblastoma The American Journal of Human Genetics, 72(2):253-269
14 Shimizu T, Toguchida J, Kato MV, Kaneko A, Ishizaki K, Sasaki MS(1994) Detection of mutations of the RB1 gene in retinoblastoma patients by using exon-by-exon PCR-SSCP
analysis American journal of human genetics, 54(5):793
15 Thomas DM, Carty SA, Piscopo DM, Lee J-S, Wang W-F, Forrester WC, Hinds PW(2001) The retinoblastoma protein acts as a transcriptional coactivator required for osteogenic
differentiation Molecular cell, 8(2):303-316
16 Zhu X, Dunn J, Goddard A, Squire J, Becker A, Phillips R, Gallie B(1992) Mechanisms of loss of heterozygosity in
retinoblastoma Cytogenetic and Genome Research, 59(4):248-252
Ngày nhận bài báo: 24/11/2015 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 27/11/2015 Ngày bài báo được đăng: 01/02/2016