Đa polyp tuyến gia đình là bệnh di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường, nguyên nhân gây bệnh được xác định chủ yếu do đột biến gen APC nằm trên nhiễm sắc thể số 5. Gen gồm 15 exon mã hóa ra mRNA dài 8972 bp. Đột biến chủ yếu của gen APC là đột biến điểm.
Trang 1XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN APC Ở MỨC ĐỘ mRNA TRÊN BỆNH NHÂN
MẮC BỆNH ĐA POLYP TUYẾN GIA ĐÌNH
Đoàn Nam Khánh*, Lê Minh Khôi**, Nguyễn Thị Băng Sương**
TÓM TẮT
Mở đầu: Đa polyp tuyến gia đình là bệnh di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường, nguyên nhân gây bệnh
được xác định chủ yếu do đột biến gen APC nằm trên nhiễm sắc thể số 5 Gen gồm 15 exon mã hóa ra mRNA dài
8972 bp Đột biến chủ yếu của gen APC là đột biến điểm Nếu không được phát hiện và điều trị sớm, 100% bệnh nhân sẽ tiến triển thành ung thư đại trực tràng
Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự để xác định đột biến điểm của gen APC trên mRNA ở bệnh nhân
mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 33 bệnh nhân bị đa polyp đại trực tràng đồng ý tham gia nghiên
cứu Những bệnh nhân này được chẩn đoán mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình dựa vào các triệu chứng lâm sàng
và nội soi phát hiện có polyp đại trực tràng với số lượng polyp trên 20 polyp Các bệnh nhân được ly trích DNA
và giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa của APC
Kết quả: Phát hiện được 15 bệnh nhân bị đột biến điểm trên gen APC, trong đó có 8 đột biến sai nghĩa
(chiếm 53,3%), những đột biến này chỉ sai khác một nucleotide Ngoài ra có 7 đột biến làm xuất hiện mã kết thúc (chiếm 46,7%); bao gồm 01 đột biến thêm 1 nucleotide (chiếm 6,7%), 2 đột biến đổi 1 nucleotide (13,3%) và 4 đột biến mất từ 1 đến 5 nucleotide (26,7%)
Kết luận: Chúng tôi đã ứng dụng thành công quy trình giải trình tự phát hiện đột biến trên mRNA của gen
APC ở các bệnh nhân mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình
Từ khóa: Ung thư đại trực tràng, gen APC, mRNA, đa polyp tuyến gia đình, đột biến điểm, giải trình tự…
ABSTRACT
IDENTIFYING MUTATIONS IN APC mRNA IN PATIENTS WITH HEREDITARY FAMILIAL
ADENOMATOUS POLYPOSIS
Đoan Nam Khanh, Le Minh Khoi, Nguyen Thi Bang Suong
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 19 - No 5 - 2015: 200 - 205
Background: Hereditary familial adenomatous polyposis (FAP) is a dominant somatic inherited disorder
caused most frequently by mutations in APC gene on chromosome 5 The gene consists of 15 exons encoding for mRNA of 8972 bp Majority of mutations on APC gene are point mutations Without early detection and prompt management, 100% patients will progress to colorectal cancer
Objectives: Applying the genetic sequencing technique to detect point mutations in APC gene in patients
who had been diagnosed to have FAP and in mutation carriers
Patients and method: We successfully recruited 33 patients Diagnosis of AFP was based on clinical
manifestations and polyps detected on colorectal endoscopy and at least 20 polyps must be present Samples were collected and DNA was extracted and sequencing of the whole APC gene was carried out
Results: We detected point mutations in APC gene in 15 patients including 8 missense mutations (53.3%)
* Khoa Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh
** Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh
Trang 2and 7 nonsense mutations (46.7%): including 1 mutation of adding 1 nucleotide (6.7%), 2 replacement of one nucleotide (13.3%) and 4 patients with deletion from 1 to 5 nucleotides (26.7%)
Conclusions: We have successfully established the procedure for sequencing to detect mutations on
APC-encoded mRNA in patients with FAP
Keywords: Colorectal cancer, APC gene, mRNA, hereditary familial adenomatous polyposis, point
mutation, sequencing
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh đa polyp tuyến gia đình (hereditary
familial adenomatous polyposis: FAP) là một
bệnh rối loạn di truyền trội(5) Đa polyp tuyến gia
đình được đặc trưng bởi sự phát sinh hàng trăm
đến hàng ngàn polyp trong đại trực tràng, hầu
hết là ở tuổi vị thành niên(1,5) Triệu chứng đầu
tiên của FAP là tiêu chảy và có máu trong
phân(1) Bệnh xảy ra với tần suất là 1/8300 trẻ sinh
ra và sống(6) và có nguy cơ cao dẫn đến ung thư
đại trực tràng, gần 100% bệnh nhân bị K hóa
trước 40 tuổi nếu không được điều trị sớm(7)
Bệnh có liên quan mật thiết đến những đột
biến dòng mầm của gen ức chế khối u APC
(tumor - supressor adenomatous polyposis
coligen: APC) nằm tại vị trí 5q21-q22(5,10) Gen
APC là một gen ức chế khối u cổ điển dài 14000
nucleotid, có cấu trúc gồm 15 exon, gen mã hóa
ra phân tử mRNA dài 8972 bp, sản phẩm dịch
mã dài 2843 acid amin Các nghiên cứu trên thế
giới đã tìm thấy khoảng 300 đột biến khác nhau
trên gen APC gây bệnh FAP(6) Có khoảng
60-70% đột biến điểm được tìm thấy trong các gia
đình bệnh FAP, trong khi đó đột biến mất đoạn
lớn chiếm từ 10-15%(1) Đa số các đột biến nằm
rải rác trên toàn bộ chiều dài gen APC(1,5,8) Do đó,
một trở ngại lớn khi muốn xác định đột biến trên
gen APC ở mức độ DNA, chúng ta cần thiết kế
37 cặp mồi khuếch đại từng exon(11), điều này
gây tốn kém cả về tài chính lẫn thời gian Trong
khi đó, nếu chẩn đoán ở mức độ mRNA thì chỉ
cần 10 cặp mồi đã có thể khuếch đại được toàn
bộ chiều dài đoạn gen APC
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu đột biến gen
APC ở bệnh nhân FAP vẫn còn rất hạn chế Năm
2012 tác giả Nguyễn Phương Anh đã phân tích
gen APC cho một số gia đình bệnh nhân FAP,
tuy nhiên tác giả chỉ phân tích exon 15 của gen dựa trên phân tử DNA, trong khi đó đột biến rải rác khắp chiều dài đoạn gen(6,11) Để tránh bỏ sót tổn thương, cần xây dựng quy trình phân tích
toàn bộ đoạn gen APC để xác định đột biến Xuất
phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài
này với mục tiêu: “Xác đình đột biến điểm trên
mRNA của gen APC ở bệnh nhân mắc bệnh đa
polyp tuyến gia đình”
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu
Chọn lựa 33 bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình dựa vào các triệu chứng lâm sàng và nội soi phát hiện có polyp đại trực tràng với số lượng polyp đại trực tràng >20 polyp
Phương pháp nghiên cứu
Tách chiết RNA tổng số từ mẫu máu
Máu ngoại vi khi thu nhận được giữ trong ống chống đông bằng EDTA và được ly trích trong vòng 24 giờ Sử dụng quy trình tách chiết RNA tổng số bằng chloroform, isopropanol có
bổ sung isogen nhằm tách chiết được mRNA có chất lượng tốt Tiến hành kiểm tra sản phẩm thu được bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%, đo nồng độ và độ tinh sạch bằng máy NanoDrop 2000
Kỹ thuật tổng hợp cDNA từ RNA tổng số
Sản phẩm RNA toàn phần sau khi tách chiết được tiến hành phản ứng RT-PCR tạo cDNA bằng phương pháp MMLV-RT Sản phẩm cDNA sau đó được kiểm tra bằng cách thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi của gen GADPH
Phản ứng PCR khuếch đại các amplicon
Các thành phần phản ứng bao gồm: mồi xuôi
Trang 310pmol, mồi ngược 10pmol (xem bảng 1), đệm
PCR 10X, dNTP 2,5 mM, TakaraTaq 0,5U, cDNA
genome bản mẫu 5μl trong tổng thể tích 20 μl
Chu trình nhiệt: Biến tính ở 94oC trong 5 phút, sau đó là 35 - 40 chu kỳ gồm 94oC trong 10 giây; 61oC trong 30 giây; 72oC trong 1 phút, và giai đoạn kết thúc gồm 72oC trong 5 phút
Bảng 1 Trình tự mồi thực hiện khuếch đại amplicon
Amp 1 R CTGGAGACAGAATGGAGGTG 20 60,7 55,0 992 bp
F CCTTGGTTCCCAGATGACTT 20 60,8 50,0 Amp 2 R AGCCAGTGTTTTGAGTTCTAGT 22 60,9 40,9 973 bp
F TGCACCATCTACAGCACATATA 22 60,0 40,9 Amp 3 R AAAGCGTATTGAGTGCCTTATG 22 60,7 40,9 958 bp
F CTTCTGTCTTCCTGAGAGGTATG 23 60,4 47,8 Amp 4 R AGGTTTGCAGATCTCCACCA 20 61,0 50,0 989 bp
F TGCTTTGTCCAGATGAACTCT 21 60,1 42,9 Amp 5 R CCTTCATCACAGAAACAGTCA 21 60,5 42,9 961 bp
F CACTCAGGCTGGATGAACAA 20 60,1 50,0 Amp 6 R ACATTTTGCCACGGAAAGTAC 21 61,2 42,9 974 bp
F GTTTCTTTGAATCTTTGTTGTCTGAG 26 60,4 34,6 Amp 7 R CCACAAAATACTGAATATAGGACACG 26 60,7 38,5 985 bp
F CACCTTCCTGAATAGCTTTCCA 22 60,6 45,5 Amp 8 R AGATTCAGAACATGGTCTATCCC 22 60,9 40,9 962 bp
F TCTGATTTAGTCCTTTGGAGGCA 23 60,2 43,5 Amp 9 R TCTCCAGGTAGACAGATGAGC 21 60,3 52,4 974 bp
F GGATTTGCCTTTTCTGAAACAC 22 60,2 40,9 Amp 10 R CTCAGGTGCTACAAATGGTG 20 60,1 50,0 958 bp
F CTGTAGTGTTCATTATTTTAAGACAAGC 28 60,8 32,1
Kỹ thuật giải trình tự gen và phân tích kết quả
Tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR, thực
hiện phản ứng cycle sequence và tinh sạch sản
phẩm khuếch đại Sau đó điện di trên máy ABI
3500 Sử dụng phần mềm chuyên dụng để phân
tích kết quả giải trình tự và so sánh với trình tự cDNA được phiên mã ngược từ mRNA chuẩn có
mã trình tự tham chiếu trên NCBI là NM_000038.5 để xác định đột biến
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả giải trình tự nhóm bệnh nhân nghiên cứu
Hình 1 Đột biến p.Lys1456Thr tại c.4367 (FAP11) và p.Gln1517ArgfsX6 tại c.4550 (FAP 18)
Trang 4Nhận xét: Đột biến c.4367A>C làm đổi acid
amine Lysine thành acid amine Threonine (FAP
11) Đột biến c.4550 delA làm xuất hiện codon
kết thúc (TAA) tại codon 1522 (FAP 18) Đột biến mới chưa được công bố
Hình 2 Đột biến p.Leu639TyrfsX7 tại c.1916 (FAP 25) và p.Gln1922His tại c.5766 (FAP33)
Nhận xét: đột biến c.1916delT làm xuất hiện
codon kết thúc (TGA) tại codon 645 (FAP25) Đột
biến c.5766G>C làm đổi acid amine Glutamine
thành acid amine Histidine (FAP33) Đột biến
mới chưa được công bố
Kết quả về tỷ lệ đột biến trên gen APC
Bảng 2 Tỷ lệ bệnh nhân bị đốt biến trên gen APC
Kết quả Số lượng BN Tỷ lệ (%)
Có đột biến trên gen 15 45,5
Không tìm thấy đột biến 18 54,5
Nhận xét: trong số 33 bệnh nhân mắc bệnh
đa polyp đại trực tràng được phân tích, chúng tôi phát hiện được 15 bệnh nhân bị đột biến gen APC, chiếm 45,5% Có 18 bệnh nhân không có đột biến gen APC ở vùng phân tích,
chiếm 54,5%
Phân loại đột biến trên gen APC
Bảng 3 Bảng phân loại đột biến trên gen APC
STT BN Exon Nucleotide thay đổi Acid amine thay đổi Kết luận về đột biến Tác giả
và năm công bố
1 FAP 1 15 (Amp8) c.6691 A>T p.Ile2231Phe Dị hợp tử Đột biến sai nghĩa Đột biến mới
2 FAP 6 15 (Amp6) c.4661-4666insA p.Ser1556PhefsX2 Dị hợp tử Đột biếnvô nghĩa Gismodi, 1997
3 FAP 9 9 (Amp2) c.1165A>T p.Asn1165Tyr Dị hợp tử Đột biến sai nghĩa Chen, 2009
4 FAP 11 15 (Amp5) c.4367A>C p.Lys1456Thr Dị hợp tử Đột biến sai nghĩa Đột biến mới
5 FAP 13 15 (Amp3) c.2097G>A p.Tyr699Term Dị hợp tử Đột biếnvô nghĩa Christie, 2012
6 FAP 18 15 (Amp6) c.4550delA p.Gln1517ArgfsX6 Dị hợp tử Đột biếnvô nghĩa Đột biến mới
7 FAP 20 15 (Amp4) c.3146G>A p.Trp1049Term Dị hợp tử Đột biếnvô nghĩa Christie, 2012
8 FAP 25 14 (Amp3) c.1916delT p.Leu639TyrfsX7 Dị hợp tử Đột biếnvô nghĩa Đột biến mới
9 FAP 27 15 (Amp7) c.5908A>C p.Ser1970Arp Dị hợp tử Đột biến sai nghĩa Đột biến mới
10 FAP 28 3 (Amp1) c.317G>A p.Arg106His Dị hợp tử Đột biến sai nghĩa Azzopardi, 2008
11 FAP 29 15 (Amp5) c.3921_3925 delAAAAG p.Glu1309AspfsX4 Dị hợp tử Đột biếnvô nghĩa Miyaki, 1994
Trang 5STT BN Exon Nucleotide thay đổi Acid amine thay đổi Kết luận về đột biến Tác giả
và năm công bố
12 FAP 30 15 (Amp5) c.4345A>T p.Cys1449Term Dị hợp tử Đột biến sai nghĩa Wallis, 1990
13 FAP 31 15 (Amp4) c.3202-3205delTCAA p.Ser1068GlyfsX57 Dị hợp tử Đột biếnvô nghĩa Miyhoshi, 1992
14 FAP 32 15 (Amp3) c.2055G>A p.Trp685Term Dị hợp tử Đột biến sai nghĩa Miyaki, 1994
15 FAP 33 15 (Amp7) c.5766G>C p.Gln1922His Dị hợp tử Đột biến sai nghĩa Đột biến mới
Nhận xét: kết quả nghiên cứu ở nhóm bệnh
nhân cho thấy, tổng cộng có 8 đột biến sai nghĩa
(53,3%), những đột biến này chỉ sai khác một
nucleotide và 7 đột biến làm xuất hiện mã kết
thúc (46,7%), bao gồm 1 đột biến thêm 1
nucleotide (6,7%), 2 đột biến thay đổi 1
nucleotide (13,3%) và 4 đột biến mất từ 1 đến 5
nucleotide (26,7%) Trong số 15 đột biến được
tìm thấy có 6 đột biến là mới hoàn toàn và chưa
được công bố trên thế giới, chiếm tỷ lệ 40%
BÀN LUẬN
APC là một gen ức chế khối u, gồm 15 exon,
sản phẩm dịch mã dài 2843 acid amin(1,6,7) Đột
biến dòng mầm trong gen sẽ làm mất chức năng
protein APC, dẫn đến các bệnh liên quan trong
cơ thể, phổ biến là các bệnh ung thư đường tiêu
tìm ra trên 1000 đột biến được công bố trên cơ
sở dữ liệu Leiden Open Variations Database
(http://www.LOVD.nl) Hầu hết các đột biến
này là đột biến điểm nên giải trình tự là phương
pháp hiệu quả nhất để phát hiệu đột biến trên
gen APC(5)
Khi tiến hành giải trình tự để xác định đột
biến gen APC, chúng tôi đã phát hiện được 15
bệnh nhân có đột biến điểm trên tổng số 33
bệnh nhân (chiếm tỷ lệ 45,5%) Kết quả nghiên
cứu ở nhóm bệnh nhân cho thấy, tổng cộng có 8
đột biến sai nghĩa (53,3%), những đột biến này
chỉ sai khác một nucleotide và 7 đột biến làm
xuất hiện mã kết thúc (46,7%); bao gồm 1 đột
biến thêm 1 nucleotide (6,7%), 2 đột biến đổi 1
nucleotide (13,3%) và 4 đột biến mất từ 1 đến 5
nucleotide (26,7%) Trong số 15 đột biến được
tìm thấy có 6 đột biến là mới hoàn toàn và chưa
được công bố trên thế giới, chiếm tỷ lệ 40%
Khi so sánh với nghiên cứu trước ở Việt
Nam của tác giả Nguyễn Phương Anh (2011)(11),
tác giả Nguyễn Phương Anh đã phát hiện 19 bệnh nhân có đột biến trên 22 bệnh nhân (chiếm
tỷ lệ 86%) Tỷ lệ đột biến của nghiên cứu này thấp hơn so với nghiên cứu trước bởi vỉ tác giả Phương Anh chỉ lựa chọn đối tượng nghiên cứu
là các bệnh nhân đa polyp thể điển hình đã tiến triển thành ung thư, trong khi nghiên cứu chúng tôi còn lựa chọn thêm các đối tượng bệnh nhân thể nhẹ, số lượng polyp ít Mặt khác tác giả Nguyễn Phương Anh chỉ phân tích exon 15,
là exon lớn nhất của gen APC, chiếm 75% trình
tự có chức năng mã hóa protein, trong khi nghiên cứu của chúng tôi phân tích toàn bộ chiều dài gen APC Theo nghiên cứu của Andrzej Plawski (2009) tại Ba Lan, đã phát hiện
80 bệnh nhân có đột biến điểm trên 164 gia đình bệnh nhân (chiếm tỷ lệ 48,7%)(5) Theo nghiên cứu của Giovana Tardin Torrezan (2013) tại Brazil, đã phát hiện 14 bệnh nhân có đột biến điểm trên 23 bệnh nhân (chiếm tỷ lệ 60%)(8) Theo nghiên cứu của Jin P (2010) tại Trung quốc,
đã phát hiện 9 bệnh nhân có đột biến điểm trên
14 bệnh nhân (chiếm tỷ lệ 64%)(2) Khi so sánh với các nghiên cứu này, tỷ lệ đột biến trong nghiên cứu chúng tôi thấp hơn các nước Ba Lan, Brazil, Trung Quốc Theo chúng tôi, sự khác biệt này có thể là do cỡ mẫu chúng tôi còn hạn chế, ngoài ra có thể do lối sống(13) hoặc chế độ dinh dưỡng khác nhau(12) đã ảnh hưởng đến tỉ lệ đột biến Trong số 15 đột biến được phát hiện, có 6 đột biến chưa được công bố trên thế giới(Error! Reference source not found.), tuy nhiên khi phân tích khă năng gây bệnh của các đột biến bằng phần mềm Polyphene 2 chúng tôi thấy đây là những đột biến có nguy cơ gây bệnh nghiêm trọng Có lẽ
do yếu tố chủng tộc, sơ đồ đột biến gen APC ở người Việt Nam khác biệt so với các nước khác
Do vậy cần nghiên cứu trên cỡ mẫu lớn hơn để
Trang 6có thể xây dựng bản đồ đột biến gen APC ở
bệnh nhân FAP Việt Nam
Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam giải
trình tự toàn bộ 15 exon và sử dụng mRNA làm
khuôn mẫu để giải trình tự phát hiện đột biến,
điều này có ý nghĩa quan trọng vì sẽ không bỏ
sót các đột biến nằm ngoài exon 15 – vùng
hot-spot chứa nhiều đột biến của gen APC
KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã ứng dụng thành công quy
trình giải trình tự để xác định đột biến điểm
trên mRNA của gen APC trên bệnh nhân mắc
bệnh đa polyp tuyến gia đình Nghiên cứu là
tiền đề giúp lĩnh vực ung thư nói chung và
ung thư đại trực tràng do đa polyp nói riêng
ngày càng phát triển, giúp các bác sĩ lâm sàng
chẩn đoán chính xác, nhanh hơn và tiết kiệm
chi phí cho bệnh nhân
TÀI LIỆU THAM KHẢO
polyposis coli tumor suppressor and Wnt signaling in the
regulation of apoptosis", Adv Exp Med Biol 656, tr
75-84
epidemiology: incidence, mortality, survival, and risk
factors", Clinics in colon and rectal surgery 22(4), tr 191
adenomatous polyposis", Orphanet J Rare Dis 4(22)
mutation in Chinese familial adenomatous polyposis by direct sequencing in combination with multiplex ligation-dependent probe amplification", Zhonghua yi xue za zhi 90(8), tr 535-539
6 Leppert M et al (1987), "The gene for familial polyposis coli maps to the long arm of chromosome 5", Science 238(4832), tr 1411-3
Văn Khánh (2010), Nghiên cứu đột biến gene APC ở bệnh ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình, Luận án tiến sỹ y học, Trường đại học Y Hà Nội, Hà Nội
causing familial adenomatous polyposis in Polish patients", J Appl Genet 49(4), tr 407–414
Detection of APC Gene Mutation in a Family with Attenuated Familial Adenomatous Polyposis", Asian Pacific J Cancer Prev 13(10), tr 5101-5104
Cancer Causes & Control 7(1), tr 127-146
during colorectal tumorigenesis", Nature 359, tr 235-237
familial adenomatous polyposis patients", World J Gastroenterol 16(12), tr 1522–1526
APC and MUTYH genes and genotype-phenotype correlations in Brazilian FAP, AFAP, and MAP patients", Orphanet Journal of Rare Diseases 8, tr 54
Ngày phản biện nhận xét bài báo: 19/9/2015 Ngày bài báo được đăng: 20/10/2015