Bài viết xây dựng và thẩm định kỹ thuật định lượng trực tiếp chì máu bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò điện (GFAAS).
Trang 1THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CHÌ MÁU
BẰNG QUANG PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ
Trần Thị Chi Mai*, Vũ Thị Tú Uyên**, Nguyễn Thị Huệ**, Vi Mai Lan***
TÓM TẮT
Mở đầu: Định lượng chì trong máu toàn phần được chấp nhận rộng rãi như một công cụ hữu ích trong
sàng lọc và chẩn đoán và theo dõi điều trị ngộ độc chì
Mục tiêu: Xây dựng và thẩm định kỹ thuật định lượng trực tiếp chì máu bằng phương pháp quang phổ hấp
thụ nguyên tử sử dụng lò điện (GFAAS)
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, khoảng tuyến tính, độ
chụm, độ chính xác của phương pháp được đánh giá
Kết quả: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp tương ứng là 0,0217 µmol/L và
0,0724 µmol/L Khoảng tuyến tính của phương pháp là 0,1- 4 mol/L Độ lặp lại ở 3 mức nồng độ 0,223; 0,876 và 1,77 (mol/L) lần lượt là 1,93, 1,31 và 1,88 (%) Độ tái lặp ở ba mức nồng độ trên lần lượt là 11,1, 4,18 và 4,96 (%) Độ thu hồi của mẫu QC nằm trong giới hạn cho phép Độ thu hồi mẫu thật thêm chuẩn là 93,6% và 97,4%, nằm trong khoảng 80- 110%; đạt tiêu chuẩn AOAC 2012
Kết luận: Phương pháp định lượng chì máu xây dựng tại phòng xét nghiệm bằng quang phổ hấp thụ
nguyên tử là chính xác và tin cậy, có thể sử dụng trong chẩn đoán và theo dõi ngộ độc chì
Từ khoá: Ngộ độc chì, định lượng chì máu, quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò điện
ABSTRACT
VALIDATION OF BLOOD LEAD MEASUREMENT
BY GRAPHITE FURNACE ATOMIC ABSORPTION SPECTROPHOTOMETRY
Tran Thi Chi Mai, Vu Thi Tu Uyen, Nguyen Thi Hue, Vi Mai Lan
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 22 - No 3- 2018: 190 - 195
Background: Whole blood lead measurement has gained wide acceptance as the most useful tool for
screening, diagnostic testing and treatment monitoring of lead poisoning
Objectives: The aim of this study was to develop and validate the blood lead quantitation method by graphite
furnace atomic absorption spectrophotometry
Method: The limit of detection, limit of quantitation, linear range, precision and accuracy of the blood lead
quantitation by GFAAS were evaluated
Results: The LOD and LOQ of this method were 0.0217 µmol/L and 0.0724 µmol/L respectively The
method linearity was from 0.1 to 4 (mol/L) The repeatability at the concentrations of 0,223; 0,876 và 1,77 (mol/L) were 1.93, 1.31 và 1.88 (%) respectively The reproducibility at the three concentrations above were 11.1, 4.18 và 4.96 (%) respectively The recovery of three QC levels fell into the acceptable ranges The recovery of spiked samples were 93.6% and 97.4%, fell in range of 80- 110%; acceptable following the AOAC 2012 criteria
Conclusion: The developed direct method for blood lead quantitation by GFAAS was accurate and precise,
can be used for diagnosis and treatment monitoring of lead poisoning
Trang 2Key words: Lead poisoning, lead blood measurement, graphite furnace atomic absorption spectrophotometry
ĐẶT VẤN ĐỀ
Chì và các hợp chất của chì được sử dụng
trong rất nhiều lĩnh vực như công nghiệp, y học,
quân sự, năng lượng nguyên tử, kĩ thuật hạt
nhân Song song với những lợi ích mà chì mang
lại thì nó luôn là một mối đe dọa môi trường
nghiêm trọng đến sức khỏe con người, đặc biệt ở
các đô thị lớn Ảnh hưởng đáng lo ngại nhất là
sự tác động của chì đến sự phát triển trí tuệ và
sự phát triển của thế hệ trẻ – tương lai của xã hội
Tổ chức Y tế thế giới ước tính ngộ độc chì là
nguyên nhân bệnh tật cho 13,9 triệu người năm
2012 và gây chậm phát triển tinh thần mức nhẹ
đến trung bình cho 0,6 triệu trẻ em hàng năm(6,13)
Tại các nước đang phát triển, phơi nhiễm chì chủ
yếu liên quan đến các hoạt động nghề nghiệp
như luyện kim, khai thác mỏ hoặc tái chế Một
nghiên cứu gần đây về nồng độ chì máu và các
yếu tố nguy cơ phơi nhiễm chì ở trẻ em tại thành
phố Hồ Chí Minh cho thấy tỷ lệ trẻ có nồng độ
chì máu cao là 7,1%; tương đương với các nước
khu vực Đông Nam Á(5) Tuy nhiên, mức độ chì
máu cao ở trẻ em không đồng đều ở các vùng
trong cả nước Đáng lưu ý là hầu hết trẻ em sống
ở vùng tái chế chì có nồng độ chì máu cao vượt
ngưỡng cho phép và có tới 28% trẻ nồng độ chì
máu ≥ 45 g/dL(3) Kết quả sàng lọc ngộ độc chì ở
trẻ em đến khám và điều trị tại Bệnh viện Nhi
trung ương trong 6 năm cho thấy ngộ độc chì
không hiếm gặp (kết quả chưa công bố)
Triệu chứng lâm sàng của ngộ độc chì có thể
khó phát hiện khi không có bệnh sử rõ ràng phơi
nhiễm chì; ngộ độc chì có thể không có triệu
chứng; triệu chứng nếu có thường không đặc
hiệu Vì vậy xét nghiệm là thăm dò tin cậy để
chẩn đoán ngộ độc chì và đóng vai trò cốt lõi
trong xác định và quản lý ngộ độc chì, trong
đánh giá phơi nhiễm nghề nghiệp hay phơi
nhiễm môi trường với chì(12) Hiện nay, đánh giá
ngộ độc chì chủ yếu là định lượng chì trong máu
toàn phần Mặc dù định lượng chì trong các mô
và dịch cơ thể như tóc, răng, xương, nước tiểu
cũng phản ánh phơi nhiễm chì, nhưng nồng độ chì trong máu toàn phần được chấp nhận rộng rãi như một công cụ hữu ích trong sàng lọc và chẩn đoán ngộ độc chì(2,8)
Có nhiều phương pháp định lượng chì trong máu như quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS),
đo điện thế (AVS) và phổ khối (ICP-MS) Hiện nay phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử
sử dụng lò điện (Graphite furnace atomic absorption spectrometry) là phương pháp hay dùng nhất để định lượng chì trong máu(12) Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là xây dựng và thẩm định kỹ thuật định lượng trực tiếp chì máu bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò điện (GFAAS)
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu được tiến hành tại Khoa Hóa sinh- Bệnh viện Nhi trung ương, từ tháng 11- 02/2018
Trang thiết bị và hóa chất
- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử
AA-7000 với lò điện GFA-AA-7000 và bộ hút mẫu tự động ASC-7000 của Shimadzu
- Dung dịch chuẩn Pb 1g/L, axit nitric đặc 65% của Merck, Triton X-100 và Ammoni dihydro phosphate của Sigma-Aldrich Khí Argon 99,999%, nước khử ion
- Mẫu đối chứng Whole blood control- ClinCheck 3 mức của Recipe Mẫu máu toàn phần của bệnh nhân có nồng độ chì thấp
Nguyên lý kỹ thuật phương pháp định lượng chì bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử
sử dụng lò điện: Một lượng nhỏ mẫu được hóa
hơi và nguyên tử hóa ở nhiệt độ cao trong ống graphit Các nguyên tử chì tự do sinh ra trong ống graphit hấp thụ tia sáng đơn sắc từ đèn catot rỗng tạo thành phổ hấp thụ nguyên tử và được xác định bởi detector nhân quang điện Việc định lượng chì trong mẫu được thực hiện với một đường chuẩn xây dựng từ một dãy dung dịch chuẩn được chuẩn bị song song với
Trang 3mỗi mẻ mẫu
Mẫu bệnh phẩm
Máu toàn phần tĩnh mạch của bệnh nhân
nghi ngờ ngộ độc chì được thu thập trong ống
chống đông EDTA
Quy trình kỹ thuật
Điều kiện phân tích trên thiết bị AA-7000
được trình bày trong Bảng 1 và Bảng 2
Bảng 1 Điều kiện phân tích trên AA-7000
Điều kiện
Cường độ dòng đèn catot rỗng Pb 10 mA
Độ rộng khe đo 0,7 nm
Chế độ bổ chính nền BGC-D2
Ống graphit Pyrolysis graphite tube
Thể tích tiêm mẫu 10 µL
Bảng 2 Chương trình lò điện
Giai
đoạn
Nhiệt
độ
Thời gian
(giây)
Phương pháp gia nhiệt
Tốc độ dòng khí (ml/phút)
1 60 3 RAMP 0,1
2 120 20 RAMP 0,1
3 250 10 RAMP 0,1
4 700 10 RAMP 1
5 700 10 STEP 1
6 700 3 STEP 0
7 2000 3 STEP 0
8 2500 2 STEP 1
Chuẩn bị dung dịch chuẩn và mẫu đo
Mẫu chuẩn, mẫu chứng và máu toàn phần
được pha loãng 10 lần trong dung dịch 0,5%
Triton X-100; 0,2% NH4H2PO4 và 0,2% HNO3
(v/v) trong nước khử ion (dung dịch cải biến nền
mẫu) Các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ
Pb 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 3 µmol/L pha trong axit
HNO3 1% Các dung dịch chuẩn dựng đường
chuẩn và mẫu đo được chuẩn bị bằng cách trộn
50 µL dung dịch chuẩn làm việc hoặc mẫu với
450 µL dung dịch pha loãng (pha loãng 10 lần)
Thẩm định phương pháp
Các thông số thẩm định được áp dụng theo
hướng dẫn của AOAC 2012(4)
Giới hạn phát hiện (Limit of detection - LOD)
và giới hạn định lượng (LOQ) của phương
pháp
Sử dụng mẫu bệnh nhân có nồng độ chì rất
thấp (nhỏ hơn LOD dự kiến), thêm dung dịch chuẩn chì với nồng độ 0,1 µmol/L (nồng độ thấp nhất của dãy dung dịch chuẩn ) Chuẩn bị 10 lần mẫu độc lập theo qui trình pha loãng trên Tính giá trị trung bình, SD Xác định LOD và LOQ: LOD = 3SD và LOQ= 10SD (SD = độ lệch chuẩn của mẫu thêm chuẩn)
Khoảng tuyến tính của phương pháp
Chuẩn bị dung dịch làm việc có nồng độ Pb 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 3; 4, 5 mol/L, sau đó pha loãng theo tỉ lệ 1:10 trong dung dịch pha loãng Tiến hành đo lặp lại mỗi dung dịch 3 lần Tính giá trị trung bình của mỗi nồng độ Sử dụng phương pháp phân tích hồi quy đa thức bằng phần mền Lincheker của Phillipe Marquis để đánh giá xem khoảng giá trị đánh giá có tuyến tính hay không Phân tích hồi quy đa biến bằng phần mềm sẽ cho biết phương trình tương quan giữa nồng độ
đo được Y với giá trị mong đợi x Nếu phương trình tương quan là phương trình hồi quy bậc 1 thì phương pháp là tuyến tính(11)
Đánh giá độ chụm (Precision)
Tiến hành đánh giá độ lặp lại (repeatability)
và độ tái lặp (intermediate repeatability) Sử dụng mẫu QC 3 mức nồng độ QC1, QC2, QC3
Độ lặp lại: Mỗi mức nồng độ chuẩn bị 10 lọ mẫu Tiến hành phân tích trong cùng một mẻ Độ tái lặp: Mỗi mức nồng độ chuẩn bị 10 lọ mẫu Tiến hành phân tích trong 10 ngày khác nhau (10 mẻ) Tính TB, SD, độ lệch chuẩn tương đối (RSD hay CV) tại mỗi nồng độ Độ lệch chuẩn tương đối được so sánh với tiêu chuẩn cho phép của AOAC 2012
Đánh giá độ chính xác (Accuracy)
Độ chính xác của phương pháp được xác định bằng độ thu hồi của mẫu QC mức 1, 2, 3 và
độ thu hồi của mẫu bệnh nhân thêm chuẩn Mỗi nồng độ chuẩn bị 10 mẫu đo Độ thu hồi thêm chuẩn được tính theo công thức sau:
% thu hồi = (Cs – C) x 100/Ca ;
Trong đó: C s là nồng độ đo được trong mẫu thêm chuẩn, C
là nồng độ đo được trong mẫu không thêm chuẩn, C a là
Trang 4nồng độ chuẩn thêm vào Độ thu hồi được so sánh với tiêu
chuẩn của AOAC 2011
KẾT QUẢ
Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của
phương pháp
Bảng 3 Kết quả xác định LOD và LOQ của phương
pháp
Nồng độ chì Pb (µmol/L)
Trung bình (n = 10) 0,0904
SD 0,0072
LOD 0,0217
LOQ 0,0724
R = Trung bình/LOD 4,2
Giá trị R đánh giá LOD tính được là 4,2 nằm
trong khoảng 4 – 10(9), như vậy nồng độ Pb được
lựa chọn để đánh giá (0,1 µmol/L) là phù hợp
Phương pháp phân tích chì trong máu theo qui
trình đưa ra trên có giới hạn phát hiện LOD và
giới hạn định lượng tương ứng là 0,0217 µmol/L
và 0,0724 µmol/L
Khoảng tuyến tính của phương pháp
Bảng 4 Đánh giá khoảng tuyến tính của phương
pháp
Mẫu Lần
chạy 1
Lần
chạy 2
Lần chạy 3
Trung bình (y)
Giá trị mong đợi (x)
1 0,093 0,093 0,093 0,09475 0,1
2 0,219 0,193 0,198 0,2025 0,2
3 0,513 0,498 0,51 0,50525 0,5
4 1,015 1,012 0,992 1,00475 1
5 1,927 2,042 1,999 1,992 2
6 2,991 2,982 3,009 2,9955 3
7 3,994 3,9 3,919 3,95325 4
Độ dốc a 0,9874
Giao điêm b 0,009543
Phương trình tương quan Y=0,9874x
+0,009543
Nhận xét: Khoảng tuyến tính của phương
pháp là 0,1- 4 mol/L, phương trình tương quan
là y= 0,9874 x + 0,009543
Độ chụm của phương pháp
Theo tiêu chuẩn đánh giá của AOAC, đối với
nồng độ chất phân tích trong khoảng 100 – 1000
µg/L thì CV cho phép là 11 – 15% Ba mẫu phân
tích trong thí nghiệm này có nồng độ chì trong
khoảng 54 – 425 µg/L, như vậy độ lặp và độ tái lặp thu được trong bảng trên là chấp nhận được
Bảng 5 Đánh giá độ chụm của phương pháp
Độ lặp lại (n=10)
Trung bình (µmol/L) 0,223 0,876 1,77
SD 0,0043 0,0115 0,033
CV (%) 1,93 1,31 1,88
Độ tái lặp (n=10)
Trung bình (µmol/L) 0,251 0,981 1,87
SD 0,028 0,041 0,092
CV (%) 11,1 4,18 4,96
Độ chính xác của phương pháp
0 0.1 0.2 0.3 0.4
QC 1
n
0 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5
QC 2
n
Trang 50
0.5
1
1.5
2
2.5
3
QC 3
n
Hình 1 Độ thu hồi mẫu QC
Giá trị đo được
Linear (Trung bình của mẫu QC)
Linear (Giới hạn trên mẫu QC)
Linear (Giới hạn dưới của mẫu QC)
Bảng 6 Độ thu hồi mẫu QC
Mẫu
QC
Nồng độ TB đo
được (µmol/L) CV
Nồng độ mẫu QC Trung bình
(µmol/L)
Khoảng cho phép (µmol/L)
QC 1 0,251 11,1 0,263 0,210 – 0,315
QC 2 0,981 4,18 1,06 0,847 – 1,27
QC 3 1,87 4,96 2,05 1,64 – 2,46
Kết quả phân tích cho thấy nồng độ chì trung
bình đo được khá sát với giá trị trung bình đưa
ra của mẫu QC (Bảng 6), các giá trị đo được đều
nằm trong khoảng giới han cho phép (Hình 1)
Độ chụm của các kết quả đo cũng đạt tiêu chuẩn
giới hạn chấp nhận theo AOAC
Bảng 7 Độ thu hồi mẫu thêm chuẩn
Nồng độ Pb thêm chuẩn (µmol/L) 0,600 2,00
Nồng độ Pb trung bình đo được
trong mẫu thêm chuẩn (n = 10)
(µmol/L)
0,561 1,95
CV (%) 1,42 0,74
Độ thu hồi trung bình (%) 93,6 97,4
Tiêu chuẩn AOAC (%) 80 – 110
Độ thu hồi mẫu thêm chuẩn đo được của cả
hai mức nồng độ đều nằm trong khoảng cho
phép theo tiêu chuẩn AOAC
BÀN LUẬN
Định lượng chì máu được khuyến cáo là xét nghiệm sàng lọc và chẩn đoán, theo dõi điều trị ngộ độc chì Hai phương pháp định lượng chì máu hay được sử dụng là quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò điện (GFAAS) và đo điện thế (ASV), trong đó GFAAS là phương pháp hay được sử dụng nhất Hiện tại Khoa Sinh hoá Bệnh viện Nhi trung ương có máy định lượng chì máu Leadcare II với nguyên lý kỹ thuật là ASV Tuy nhiên dải đo của máy là từ 0.159 - 3,14 mol/L (3,3 - 65 g/dL)(7) và máy chỉ sử dụng với mục đích sàng lọc nên cần thiết phải có một phương pháp định lượng chính xác nồng độ chì máu khi bệnh nhân có nồng độ chì máu cao Chính vì vậy phương pháp định lượng chì máu bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò điện đã được xây dựng Kết quả thẩm định cho thấy độ chụm của phương pháp đạt tiêu chuẩn của AOAC
2011(4) Khi so sánh với các nghiên cứu định lượng chì máu bằng GFAAS, độ chụm của nghiên cứu này là tương tự(1,7,9) Đặc biệt độ lặp lại và độ tái lặp trong phương pháp của chúng tôi còn cho thấy tốt hơn các nghiên cứu này ở mức nồng độ chì thấp (0,223 mol/L) Độ chụm của phương pháp này tốt hơn hẳn công bố của nhà sản xuất với phương pháp ASV trên máy Leadcare II(7)
Do không có các vật liệu tham chiếu, trong nghiên cứu này độ chính xác của phương pháp được đánh giá thông qua độ thu hồi Độ thu hồi cho thấy phương pháp có độ chính xác cao Ở cả
3 mức nồng độ thấp, trung gian và cao của đường chuẩn, độ thu hồi đều nằm trong giới hạn cho phép Kết quả này tương đồng với kết quả đánh giá độ thu hồi của phương pháp định lượng chì trong máu và trong huyết thanh của một số nghiên cứu đã công bố(1,3)
Giới hạn định lượng của phương pháp là 0,072 µmol/L Khoảng tuyến tính của đường chuẩn phương pháp là từ 0,1 đến 5 µmol/L Khoảng tuyến tính này rộng hơn khoảng tuyến tính của máy Leadcare II Hơn nữa, việc đo
Trang 6lường chì bằng phương pháp GFAAS còn cho
phép pha loãng mẫu khi nồng độ vượt quá giới
hạn khoảng tuyến tính, do vậy khoảng báo cáo
kết quả rộng, thích hợp cho việc theo dõi kết quả
điều trị ngộ độc chì
KẾT LUẬN
Nghiên cứu cho thấy phương pháp định
lượng chì máu bằng quang phổ hấp thụ nguyên
tử xây dựng tại phòng xét nghiệm là chính xác
và tin cậy, có thể sử dụng trong chẩn đoán và
theo dõi ngộ độc chì
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Andrada D, Pinto FG, Magalhaes CG et al (2006) Direct
determination of lead in human urine and serum samples by
electrothermal atomic absorption spectrometry and
permanent modifiers J Braz Chem Soc, 17(2): 328-332
2 Barbosa F (2005) A critical review of biomarkers used for
monitoring human exposure to lead: advantages, limitations
and future needs Environmental Health Perspectives, 113:
1669-1674
3 Croteau GA, Beaudet NJ, Bao ND (2015) Childhood lead
exposure from battery recycling in Vietnam BioMed Res Int,
193715 doi: 10.1155/2015/193715
4 Guidelines for Collaborative Study Procedures to Validate
Characteristics of a Method of Analysis (2012) Official
Methods of Analysis, Appendix D AOAC INTERNATIONAL,
Gaithersburg, MD
5 Havens D, Pham MH, Karr CJ, Daniell WE (2018) Blood
Lead Levels and Risk Factors for Lead Exposure in a Pediatric
Population in Ho Chi Minh City, Vietnam Int J Environ Res
Public Health, 15(1): 93
6 Landrigan P, Fuller R, Acosta NJ, Adeyi O, Arnold R, Basu N, Baldé A, Bertollini R, Bose-O’Reilly S, Boufford J, et al (2017)
The lancet commission on pollution and health Lancet,
391(10119):462-512
7 Magellan Diagnostics, Inc (2016) Lead Care II Package
Insert Magellan Diagnostics, Inc North Billerica, MA,
USA:.[(accessed on 4 March 2018)] Available online:http://www.leadcare2.com/getmedia/21d1301e-efee-
480f-9586-128f1dbc568f/80-0-052-Package-Insert,-LeadCare-II-Test-Kit-v109-Rev02.pdf.aspx
8 Parson PJ (2001) C40-A: Analytical procedures for the determination of lead in blood and urine; approved guideline
Wayne, PA, National Committee for Clinical Laboratory Standards
9 Parson PJ, Slavin W (1993) A rapid Zeeman graphite furnace atomic absorption spectrometric method for the determination
of lead in blood Spectrochim Acta, 48B: 925-39
10 Viện KN VSANTPQG (2010) Thẩm định phương pháp phân tích hóa học và vi sinh vật
11 Westgard JO (2009) Basic method validation, 3rd edition
Westgard QC, Inc
12 World Health Organization (2011) Brief guide to analytical
methods for measuring lead in blood IOMC
13 World Health Organization International Programme on Chemical Safety The Public Health Impact of Chemical: Knowns and Unknowns [(accessed on 4 March 2018)], http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/206553/1/WHO_FWC _PHE_EPE_16.01_eng.pdf
Ngày nhận bài báo: 17/12/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 09/02/2018 Ngày bài được đăng: 10/05/2018