Bài viết trình bày đánh giá hiệu quả điều trị ung thư đại tràng người (tế bào HT-29) trên mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude) của phối hợp virus vaccine sởi và quai bị (MeV và MuV).
Trang 1ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI TRÀNG
NGƯỜI CỦA PHỐI HỢP VIRUS VACCINE SỞI
VÀ QUAI BỊ TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT THIẾU HỤT MIỄN DỊCH
Lê Duy Cương1, Nguyễn Văn Ba2, Hồ Anh Sơn2
TÓM TẮT
Mục tiêu: Đánh giá hiệu quả điều trị ung thư đại tràng người (tế bào HT-29) trên mô hình chuột thiếu hụt
miễn dịch (chuột nude) của phối hợp virus vaccine sởi và quai bị (MeV và MuV)
Đối tượng và phương pháp: MeV và Muv được tăng sinh và chuẩn độ bằng phương pháp TCID 50 Có
49 chuột nude mang khối u tế bào HT-29 được chia thành 2 nhóm: nhóm đánh giá hiệu quả điều trị u (40 con), nhóm đánh giá tỉ lệ tế bào miễn dịch trong lách chuột (9 con) Tiêm virus vào u với liều 10 7 PFU/con, 2 lần/tuần trong 3 tuần, nhóm chứng tiêm dung dịch PBS Đánh giá tỉ lệ tế bào miễn dịch bằng phương pháp phân tích tế bào dòng chảy
Kết quả và kết luận: Kích thước u ở nhóm điều trị virus tăng chậm và thời gian sống của chuột dài hơn
(p<0,05) so với nhóm chứng; nhóm điều trị phối hợp virus có kích thước u tăng chậm và thời gian sống của chuột dài hơn (p<0,05) so với nhóm điều trị đơn virus MeV và MuV kích thích miễn dịch đặc hiệu kháng u
tế bào HT-29 trên chuột nude.
Từ khóa: chuột nude, virus vaccine sởi và quai bị, ung thư đại trực tràng.
ABSTRACT
ASSESSMENT OF CANCER TREATMEN TEFFICACY OF MEASLES AND MUMPS VIRUS VACCINE COMBINATION ON NUDE MICE XENOGRAFT MODELS
Le Duy Cuong 1 , Nguyen Van Ba 2 , Ho Anh Son 2
Objectives: Evaluation of the cancer treatment effect of measles and mumps virus vaccine (MeV and
MuV) combination against human colorectal cancer (HT-29 Cell) in nude micexenograft models
Materials and methods: MeV and MuV were proliferated and titrated by TCID 50 assay 49 nude micewere divided into 2 groups: the group for assessment of tumor treatment efficacy (40 mice), the other for assessment of immune cell rates in nude mouse spleen (9 mice) Nude mice were directely injected by virus into thetumor with a dose of 10 7 PFU/mice, twice a week for 3 weeks, the control group wasinjected by PBS Immune cell rates in nude mice speen were assessed by flow cytometry analysis
Results and conclusions: virus-treated groups hadthe tumor sizeand survival time that grewmore slowly
and was longer (p<0.05) those of the control group The viral combination-treated group had the tumor size and survival time that grew more slowly and was longer(p <0.05) than those of single virus-treated groups MeV and MuV were able to stimulate specific anti-tumor immune response in nude mice xenograft models
Keywords: Nude mice, measles and mumps virus vaccine, colorectal cancer.
1 TT Nhiệt Đới Việt Nga
2 Học viện Quân Y - Ngày nhận bài (Received): 10/7/2019; Ngày phản biện (Revised): 30/7/2019; - Ngày đăng bài (Accepted): 26/8/2019
- Người phản hồi (Corresponding author): Hồ Anh Sơn
- Email: hoanhsonhp@gmail.comSđt:
Trang 2tế bào khối u bộc lộ TAA, kích hoạt các tế bào giết tự nhiên (NK) và giải phóng của IFN-γ [2]
Đến nay vẫn chưa có nghiên cứu đánh giá hiệu quả phối hợp MeV và MuV điều trị ung thư đại trực tràng in vivo Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài này
nhằm: đánh giá hiệu quả phối hợp virus vaccin sởi
và quai bị điều trị ung thư đại trực tràng dòng tế bào HT29 trên mô hình chuột nude.
II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Vaccine sống, giảm độc lực MeV và MuV: Phân
lập, tăng sinh MeV và MuV nguồn gốc từ vaccine Priorix (GlaxosmithKline, Anh), thực hiện tại bộ
môn Sinh lý bệnh, Học viện Quân y Chuẩn độ virus
bằng phương pháp TCID50
Chuột thiếu hụt miễn dịch(nude mice):Chuột
nude 6-8 tuần tuổi mang khối u tế bào HT-29 dưới
da đùi (Charles river, Mỹ) được nuôi trong môi trường vô trùng
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Điều trị chuột nude mang khối u tế bào HT-29
Có 40 con chuột nude mang khối u tế bào
HT-29 (kích thước khối u20-30 mm3) được chia ngẫu nhiên thành 4 nhóm (10 con/1 nhóm), 3 nhóm được điều trị bằng tiêm virus nội u lần lượt là phối hợp MeV+MuV, MuV và MeV, nhóm chứng điều trị bằng dung dịch PBS Liều điều trị là 107PFU/con, 2 lần /1 tuần, trong 3 tuần
2.2.2 Đo kích thước khối u sau điều trị
Dùng thước kẹp đo khối u (hình1.1) Công thức tính Thể tích khối u: thể tích khối u (mm3)=chiều rộng2 (mm) x chiều dài(mm)/2
Hình 1.1: Đo kích thước u trên đùi chuột nude
I ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư đại trực tràng (CRC) là loại ung thư
phổ biến thứ ba ở nam giới và thứ hai ở nữ giới
Năm 2016, trên toàn thế giới có khoảng 1,4 triệu
ca mới mắc và 700.000 bệnh nhân CRC đã chết Ở
Việt Nam, năm 2014, tỉ lệ mắc CRC chiếm 5,2% ở
nam giới và 8% ở nữ giới trên tổng số các ca bệnh
ung thư Hiện nay, có rất nhiều phương pháp điều
trị ung thư đại trực tràng, bao gồm cả các phương
pháp điều trị đích và các sản phẩm thuốc có hoạt
tính sinh học… Oncolytic virus (OV) là một phương
thức điều trị ung thư mới, biến sự nhân lên của virus
thành vũ khí tiêu diệt các tế bào ung thư và hầu như
không ảnh hưởng đến các tế bào lành Có nhiều loại
virus bao gồm cả MeV và MuV đang được nghiên
cứu và thử nghiệm lâm sàng điều trị nhiều loại ung
thư khác nhau Hiện nay, virus herpec simplex biến
đổi gen (IMLYGIC™), đã được phê chuẩn điều trị
các bệnh nhân bị ung thư ở Mỹ và các nước liên
minh châu Âu [1]
MeV và MuV thuộc họ Paramyxoviridae có
nhiều đặc điểm tự nhiên phát triển thành liệu pháp
điều trị ung thư như: có các thụ cảm thể đặc hiệu
trên bề mặt tế bào ung thư, tính ổn định gen cao,
có tiềm năng biến đổi gen tạo ra các virus tái tổ
hợp có các thuộc tính trị liệu ung thư tốt hơn MeV
và MuV có khả năng tiêu hủy tế bào u qua hình
thành hợp bào, đó là sự hợp nhất các tế bào bị nhiễm
virus với các tế bào lân cận không nhiễm virus.Quá
trình này làm cho virus nhân lên rất nhanh và tránh
tiếp xúc với kháng thể trung hòa trong máu vật chủ
MeV và MuV sau khi xâm nhập vào cơ thể chúng
tạo ra các phân tử tín hiệu nguy hiểm (DAMP và
PAMP), cùng với hợp bào tiết ra một lượng lớn
“syncytiosome” giống như exosome biểu hiện
kháng nguyên khối u (TAA) cao kích thích tạo ra
đáp ứng miễn dịch tự nhiên và thích ứng kháng u
Ngoài ra, các glycoprotein hợp màng của MeV và
MuV làm tăng khả năng các tế bào đuôi gai (DC)
trình diện chéo TAA hoạt hóa hệ miễn dịch đặc hiệu
kháng tế bào u Một lợi thế nữa của MuV và MeV
là protein HN và N hoạt động như một sialidase, có
khả năng loại bỏ dư lượng acid sialic từ bề mặt các
Trang 3Biểu đồ 2.1:Kết quả kích thước u sau thời gian điều trị bằng virus
Ở ngày thứ 29 (có chuột chết, dừng theo dõi), kích thước u ở các nhóm điều trị virus tăng chậm hơn so với nhóm chứng (p<0,05) Kích thước khối u của nhóm điều trị MeV+MuV tăng chậm hơn nhóm điều trị đơn virus (p<0,05) (biểu đồ 2.1) Kích thước khối u của 2 nhóm điều trị đơn virus không khác biệt nhiều (p>0,05) (biểu đồ 2.1)
3.1.2 Thời gian sống và tỉ lệ chuột chết sau điều trị bằng MeV và MuV
Biểu đồ 2.2: Kết quả thời gian sống và tỉ lệ chết của chuột sau điều trị
2.2.3 Đánh giá tỉ lệ tế bào miễn dịch trong lách
chuột nude bằng phân tích tế bào dòng chảy
- Có 9 con chuột nude mang khối u tế bào HT-29
chia làm 4 nhóm: nhóm chứng (3 con), nhóm điều
trị MeV (2 con), nhóm điều trị MuV, nhóm điều trị
phối hợp MeV+MuV (2 con) Kết thúc quá trình
điều trị, chuột ở các nhóm nghiên cứu trên sẽ được
phẫu tích lấy lách đánh tỉ lệ tế bào miễn dịch
- Nhuộm tế bào lách chuột bằng kháng thể đặc
hiệu gồm: Kháng thể kháng CD11b gắn huỳnh
nhận biết tế bào bạch cầu dòng tủy [3] Kháng thể
kháng CD49b gắn huỳnh quang nhận biết tế bào
NK chuột [4] Kháng thể kháng CD11c gắn huỳnh
quang nhận biết tế bào DC chuột [5].Kháng thể kháng CD11c gắn huỳnh quang kết hợp với kháng thể kháng CD197 (CCR7) gắn huỳnh quang nhận biết tế bào DC trưởng thành chuột [5].Hỗn hợp tế bào sau khi ủ với các loại kháng thể sẽ phân tích tế bào qua dòng chảy bằng máy FACS Canto II (BD)
III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả
3.1.1 Kích thước u sau điều trị
Ngày đầu tiên điều trị không có khác biệt nhiều
về kích thước u trung bình giữa các nhóm (p>0,05) (biểu đồ 2.1)
(A): So sánh kích thước u ở ngày điều trị thứ nhất
(B): So sánh kích thước u ở ngày điều trị thứ 29
Trang 4Sau thời gian điều trị (53 ngày theo dõi), thời
gian sống trung bình của chuột ở các nhóm điều
trị bằng OV dài hơn (p<0,05) so với nhóm chứng
(biểu đồ 2.2a) Tỉ lệ chuột còn sống ở nhóm điều trị
OV cao hơn (p<0,05) so với nhóm chứng (biểu đồ
2.2b) Đặc biệt ở nhóm điều trị phối hợp virus có
thời gian sống trung bình dài hơn và tỉ lệ chuột còn
sống nhiều hơn (p<0.05) so với nhóm điều trị đơn
virus (biểu đồ 2.2) So sánh 2 nhóm điều trị MeV và
MuV khác biệt không nhiều (p>0,05)
3.1.3 Tỉ lệ tế bào miễn dịch ở lách chuột sau
điều trị bằng MeV và MuV
Biểu đồ 2.3 Tỉ lệ các tế bào miễn dịch trong lách
chuột sau điều trị bằng virus
Kết quả cho thấy tỉ lệ tế bào bạch cầu dòng tủy,
tế bào NK, DC và DC trưởng thành ở nhóm điều
trị phối hợp MeV+MuV, nhóm điều trị MuV, nhóm
điều trị MeV cao hơn đáng kể so với nhóm chứng
(biểu đồ 2.3) Đặc biệt là kết quả tỉ lệ các tế bào
miễn dịch ở nhóm điều trị phối hợp MeV+MuV cao
hơn đáng kể so với các nhóm điều trị đơn virus(biểu
đồ 2.3) Không có sự khác biệt nhiều ở 2 nhóm điều
trị đơn OV
3.2 Bàn luận
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy MeV và
MuV có tác dụng làm chậm phát triển khối u tế bào
HT-29 ghép trên đùi chuột nude bắt đầu vào ngày
thứ 3 cho đến ngày thứ 29 sau tiêm, thời gian sống
trung bình ở các nhóm điều trị bằng OV dài hơn và
số chuột còn sống nhiều hơn có ý nghĩa thống kê
so với nhóm chứng Khả năng virus lây lan tạo ra
hoạt động kháng u là do virus nhân lên “bắt kịp” với
quá trình tăng sinh tế bào u Kết quả của chúng tôi phù hợp với các kết quả nghiên cứu khác sử dụng vaccine virus sởi và quai bị sống giảm độc lực điều trị khối u trên chuột nude và cả trên các thử nghiệm lâm sàng [6], [7] Bên cạnh đó, việc phân chia liều lượng, với liều 107 PFU và liệu trình điều trị như vậy là cần thiết để tăng khả năng ly giải tế bào u của virus Tiêm virus nội u nhiều lần hiệu quả hơn so với tiêm tổng liều duy nhất [6], [7]
Điểm nổi bật ở nghiên cứu của chúng tôi là việc phối hợp MeV và MuV điều trị khối u tế bào HT-29 trên chuột nude rất có hiệu quả MeV và MuV đã cộng hưởng cơ chế hoạt động kháng ung thư đại tràng Cũng có nhiều đề tài nghiên cứu hiệu quả ly giải tế bào
u của phối hợp 2 virus vaccine sởi và quai bị đối với nhiều loại ung thư như: ung thư đại trực tràng, ung thư ruột, ung thư gan, ung thư vú, ung thư thực quản, ung thư thanh quản, ung thư tế bào máu [8] ung thư buồng trứng [6] Các nghiên cứu cũng đã chứng minh phối hợp MeV và MuV có hiệu quả điều trị khối u hơn hẳn so với đơn virus và chúng có một phổ rộng tiềm năng kháng tế bào ung thư người cấy ghép trên động vật thiếu hụt miễn dịch
Số lượng thụ cảm thể đã được chứng minh là yếu tố quan trọng quyết định đến tính lây nhiễm hay hiệu quả lan truyền của virus vào các tế bào u đích Chúng ta đã biết CD46, Nectin-4 là các thụ cảm thể đặc hiệu của MeV và MuV-JL là thụ cảm thể đặc hiệu của MuV, các thụ cảm thể này biểu hiện cao trên bề mặt nhiều loại tế bào ung thư bao gồm cả CRC Ngoài ra, acid sialic có nhiều ở bề mặt tế bào ung thư cũng làm cho các OV này lây nhiễm tế bào ung thư có tính chọn lọc cao hơn Mức độ phong phú của thụ cảm thể xác định tính đặc hiệu và hiệu quả lây nhiễm của virus vào tế bào ung thư Tính đặc hiệu của OV đối với tế bào ung thư còn xảy ra
ở mức nội bào sau khi virus xâm nhập vào tế bào, các virus có thể tận dụng được các yếu tố do khiếm khuyết gen như: giảm cảm ứng interferon, kích hoạt Ras, p53, Rb…, các yếu tố này chỉ có duy nhất ở các tế bào ung thư, làm cho OV tăng tính chọn lọc
Trang 5các tế bào khối u mà hầu như không xảy ra ở các tế
bào bình thường Trong khi đó, nhiều tài liệu cho
thấy virus ly giải tế bào ung thư còn có khả năng tận
dụng được những khiếm khuyết gen trong tế bào u
để khuếch đại bộ gen của chúng và tăng biểu hiện
bộ gen đó Phạm vi và mức độ mà MeV, MuV tận
dụng con đường khiếm khuyết gen để ly giải tế bào
ung thư vẫn chưa rõ ràng Tuy nhiên, đã có nhiều
nghiên cứu chứng minh MeV và MuV có hiệu quả
kháng ung thư in vivo và cả trên lâm sàng [6]
Nghiên cứu cũng đánh giá tỉ lệ các tế bào miễn
dịch của chuột sau điều trị bằng MeV và MuV gồm:
tế bào bạch cầu dòng tủy, tế bào NK, DC và DC
trưởng thành Đây là các tế bào có vai trò quan trọng
của hệ miễn dịch tham gia vào đáp ứng chống ung
thư Kết quả cho thấy tỉ lệ các tế bào miễn dịch này
ở các nhóm điều trị bằng OV tăng hơn hẳn so với
nhóm chứng Đặc biệt, tỉ lệ các tế bào miễn dịch ở
nhóm điều trị phối hợp OV cao hơn đáng kể so với
nhóm điều trị đơn OV Các nghiên cứu trước đây
đánh giá hiệu quả phối hợp MeV và MuV kháng
tế bào ung thư in vitro ở một số dòng tế bào ung
thư: U937, HuT-102, Jurkat,…[8], [6] đã cho thấy việc phối hợp MeV và MuV có khả năng giết chết
tế bào khối u cả con đường ly giải trực tiếp và qua trung gian kích thích miễn dịch chống ung thư Với sự liên quan chặt chẽ giữa hiệu quả điều trị u tế bào HT-29 và tăng tỉ lệ các tế bào miễn dịch ở lách chuột, chúng tôi có thể kết luận rằng tế bào miễn dịch ở lách chuột tăng cao có mối quan hệ chặt chẽ với tăng hiệu quả ly giải tế bào ung thư trong nhóm điều trị phối hợp 2 virus Tỉ lệ tế bào miễn dịch càng tăng thì đáp ứng miễn dịch kháng u trong điều trị phối hợp 2 virus càng tăng
IV KẾT LUẬN
Kết quả nghiên cứu đã cho thấy phối hợp MeV
và MuV có hiệu quả hiệp đồng điều trị khối utế bào HT-29 trên chuột nude tốt hơn một loại virus Khối
u phát triển chậm và thời gian sống của chuột mang khối uở nhóm điều trị phối hợp virus kéo dài hơn so với nhóm điều trị đơn virus (p<0,05) MeV và MuV
có khả năng kích thích tạo đáp ứng miễn dịch đặc hiệu kháng u trên mô hình chuột nude
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 FDA (2015)FDA approves first-of-its-kind
product for the treatment of melanoma
2 Cohen M., Elkabets M., Perlmutter M., et al
(2010) Sialylation of
3methylcholanthrene-induced fibrosarcoma determines antitumor
immune responses during immunoediting J
Immunol, 185:5869–5878
3 Ohtsuji M., Lin Q., Okazaki H., et al (2018)
Anti-CD11b antibody treatment suppresses
the osteoclast generation, inflammatory cell
infiltration, and autoantibody production in
arthritis-prone FcγRIIB-deficient mice.Arthritis
Research & Therapy, 20(25):1-11.
4 Stenström M., Sköld M., Ericsson A., et al
(2004) Surface receptors identify mouse NK1.1+
T cell subsets distinguished by function and T
cell receptor type Euro Journal Immunology,
34:56-65
5 Holst K., Guseva D., Schindler S., et al (2015) The serotonin receptor 5-HT7R regulates the morphology and migratory properties of dendritic
cells Journal of Cell Science, 128:2866-2880.
6 Myers R., Greiner S., Harvey M., et al (2005) Oncolytic activities of approved mumps and measles vaccines for therapy of ovarian cancer
Cancer Gene Therapy, 12:593-599.
7 Ammayappan A., Russell S.J., Federspiel M.J (2016) Recombinant mumps virus as a
cancer therapeutic agent Molecular Therapy-
Oncolytics, 3:1-10.
8 Zhang L.F., Tan D.Q.C., Jeyasekharan A.D.,
et al (2014) Combination of vaccine-strain measles and mumps virus synergistically kills
a wide range of human hematological cancer cells: Special focus on acute myeloid leukemia
Cancer Letters, 1-9.