Bài viết trình bày việc xây dựng quy trình mulitplex real-time RT-PCR định lượng đồng thời mRNA PCA3 và PSA trong nước tiểu. Quy trình có thể được sử dụng để định lượng mRNA PCA3 và PSA. Cần tiến hành thử nghiệm trên nhiều mẫu bệnh để xác định giá trị ngưỡng của chỉ số PCA3 nhằm ứng dụng trong tầm soát UTTLT.
Trang 1XÂY DỰNG QUY TRÌNH MULTIPLEX REAL-TIME PCR
ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI mRNA PCA3 VÀ PSA TRONG NƯỚC TIỂU
Huỳnh Nhã Vân*, Lê Phúc Liên**, Trần Lê Linh Phương**, Hồ Huỳnh Thùy Dương***
TÓM TẮT
Tổng quan: PCA3 (Prostate Cancer Antigen 3) là gene mã hóa mRNA đặc hiệu cho tiền liệt tuyến và được
biểu hiện cao trong ung thư tiền liệt tuyến (UTTLT) Tỉ lệ giữa nồng độ mRNA PCA3 và PSA (Prostate-Specific Antigen) trong nước tiểu, chỉ số PCA3, đã được chứng minh là có độ đặc hiệu với UTTLT cao hơn so với xét nghiệm PSA trong huyết thanh
Mục tiêu: Xây dựng quy trình mulitplex real-time RT-PCR định lượng đồng thời mRNA PCA3 và PSA
trong nước tiểu
Phương pháp: Quy trình multiplex được xây dựng dựa trên monoplex PCA3 và PSA đã tối ưu hóa các
thông số nhiệt độ lai và nồng độ mồi Sau đó, quy trình multiplex được thử nghiệm trên 6 mẫu nước tiểu bệnh nhân và chỉ số PCA3 được tính dựa theo công thức đã công bố
Kết quả: Quy trình multiplex real-time RT-PCR có hiệu quả nhân bản đạt 90-105% với hệ số xác định
(R 2 ) của đường chuẩn đạt > 0,980 PCA3 và PSA được phát hiện và định lượng trên 100% các mẫu bệnh nhân
Kết luận: Quy trình có thể được sử dụng để định lượng mRNA PCA3 và PSA Cần tiến hành thử nghiệm
trên nhiều mẫu bệnh để xác định giá trị ngưỡng của chỉ số PCA3 nhằm ứng dụng trong tầm soát UTTLT
Từ khóa: PCA3, PSA, mRNA, chỉ số PCA3, ung thư tiền liệt tuyến
ABSTRACT
ESTABLISHMENT OF A MULTIPLEX REAL-TIME PCR FOR SIMULTANEOUS QUANTITATION
OF URINE PCA3 AND PSA mRNA
Huynh Nha Van, Le Phuc Lien, Tran Le Linh Phuong, Ho Huynh Thuy Duong
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No 2 - 2016: 83 - 87
Introduction: PCA3 (Prostate Cancer Antigen 3) encodes a prostate-specific mRNA that has been shown
to be up-regulated in prostate cancer (PCa) PCA3 score, the ratio of PCA3 mRNA copies to PSA (Prostate-Specific Antigen) mRNA copies in urine, has been shown to have higher PCa specificity compared to serum PSA test
Objectives: The present study aimed to establish a multiplex real-time RT-PCR for quantification of PCA3
and PSA mRNA
Methods: Multiplex real-time RT-PCR was constructed based on PCA3 and PSA singleplex with
optimized annealing temperature and primer concentrations The multiplex assay was then tested on patients’ urine samples and PCA3 score was calculated
Results: Multiplex amplification efficiencies were between 90-105% with coefficient of determination (R 2 )
of more than 0.980 PCA3 and PSA mRNA were detected and quantified in 100% urine samples
Conclusions: Further study on larger population is necessary to determine PCA3 score cut-off value for
Công ty TNHH Công nghệ sinh học Khoa Thương
Bệnh viện Đại học Y Dược TP.HCM Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TPHCM
Trang 2PCa screening
Key words: PCA3, PSA, mRNA, PCA3 score, prostate cancer
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư tiền liệt tuyến (UTTLT) là dạng
ung thư phổ biến thứ hai và là nguyên nhân
tử vong do ung thư đứng hàng thứ sáu ở nam
giới trên thế giới Tuy nhiên, tỷ lệ mắc UTTLT
thay đổi theo khu vực địa lý, với tỉ lệ rất cao ở
các nước phát triển gồm Châu Úc, Bắc Mỹ,
Châu Âu; tỉ lệ thấp nhất thuộc về các nước
Bắc Phi, Đông và Nam Á Mặc dù vậy, tỉ lệ
mắc phải ở đang có khuynh hướng gia tăng ở
phần lớn các quốc gia(1) Tại Việt Nam, tỉ lệ
mắc phải tăng từ 2,47 lên 4,7/100.000 người từ
năm 2000 đến 2010(3)
Việc tầm soát UTTLT chủ yếu dựa vào kết
quả thăm khám trực tràng (DRE - Digital
Rectal Examination) và xét nghiệm đo nồng
độ PSA (Prostate-Specific Antigen) trong
máu Tuy nhiên, nhược điểm lớn của xét
nghiệm này là PSA chỉ đặc hiệu cho TLT,
không đặc hiệu cho UTTLT Một số chỉ thị
sinh học được đề xuất gần đây cho chẩn đoán
(Alpha-Methylacyl-CoA Racemase), EPCA (Early
Prostate Cancer Antigen), EPCA2 (Early
Prostate Cancer Antigen-2), GSTP1
(glutathione S-transferase pi 1), APC
(adenomatous polyposis coli), PCA3 (Prostate
cancer antigen 3), thể nối gene TMPRSS2:ERG
(Transmembrane protease, serine 2 và v-ets
avian erythroblastosis virus E26 oncogene
homolog) (4) được cho là có giá trị chẩn đoán
cao hơn PSA Trong đó, thử nghiệm đo chỉ số
PCA3 trong nước tiểu đã được đưa vào chẩn
đoán lâm sàng với giá trị chẩn đoán dương từ
59,4 – 97,4% và giá trị chẩn đoán âm từ 87,8 –
98%(6)
Do gene PCA3 không có protein tương ứng,
sự tăng biểu hiện PCA3 chỉ được xác định
thông qua hàm lượng mRNA PCA3 Hàm
lượng mRNA PCA3 được đồng quy hóa
(normalized) với hàm lượng mRNA PSA, một
gene được xem là có biểu hiện tương đối ổn định trong tế bào TLT(2) Các thử nghiệm đề xuất hiện nay để đo hàm lượng mRNA PCA3
và PSA sử dụng các phương pháp nhân bản mRNA luân nhiệt hay đẳng nhiệt như real-time RT-PCR, TMA (Transcription Mediated Amplification), NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) và tiến hành trên nước tiểu Kit PROGENSA® PCA3 (Gen-Probe) dựa trên nguyên lý phương pháp TMA
đã được FDA cấp phép dùng trong xét nghiệm UTTLT ở Mỹ
Nhằm ứng dụng trong sàng lọc UTTLT ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành xây dựng quy trình định lượng mRNA PCA3 và PSA bằng phương pháp real-time RT-PCR với mẫu dò Taqman
VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP Mồi và mẫu dò
Trình tự mồi và mẫu dò sử dụng cho phản
ngược 5’-GGGCGAGGCTCATCGAT-3’ và mẫu
dò 5’-(FAM)-AGAAATGCCCGGCCGCCATC-(3IABkFQ)-3’ [5] Trình tự mồi và mẫu dò sử dụng cho phản ứng PSA: mồi xuôi 5’-GCCCACTGCATCAGGAACAA-3’, mồi ngược 5’-GCTGTGGCTGACCTGAAATACC-3’, mẫu
5’-(Cy5)- AGGCTGTGCCGACCCAGCAAGATC-(3IAbRQSp)-3’ [8] Mồi và mẫu dò được tổng hợp và cung cấp bởi công ty IDT (Integrated DNA Technologies, Mỹ)
Khảo sát các điều kiện PCR
Phản ứng monoplex ban đầu gồm: 250 nM mồi các loại, 200 nM mẫu dò, 5 µl DNA chuẩn,
và 5 µl Apta Taq DNA Master (Roche) và nước cất cho đủ 25 µl phản ứng Chương trình nhiệt PCR gồm 40 chu kỳ với nhiệt độ 950C trong 30 giây và nhiệt độ bắt cặp trong 1 phút sử dụng
Trang 3máy Stratagene Mx3000P (Agilent
Technologies, Mỹ)
Mẫu chuẩn sử dụng cho thí nghiệm này là
oligonucleotide có trình tự là sản phẩm nhân
bản của mỗi phản ứng được tổng hợp nhân tạo
và cung cấp bởi IDT (Integrated DNA
Technologies, Mỹ)
Quy trình xử lý mẫu – tách chiết RNA –
phiên mã ngược RT
Mẫu được cung cấp từ Phòng khám Tiết
niệu - Bệnh viện Đại học Y dược Tp.HCM
Nước tiểu sau khi thu được bảo quản 40C và
được xử lý trong ngày
30 ml nước tiểu được ly tâm ở 5000
vòng/phút trong 10 phút ở 40C Cặn sau ly tâm
được rửa 2 lần với 10 ml PBS 1X pH 7 và ly tâm
5000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C Cặn sau đó
được tách chiết RNA sử dụng Kit tách chiết
RNA tủa (AccuRive pRNA Prep Kit,
EX-RNA01.1A, công ty TNHH CNSH Khoa
Thương) Mẫu RNA sau đó được phiên mã
ngược (RT – reverse transcription) thành cDNA
sử dụng AffinityScript QPCR cDNA Synthesis
Kit (Agilent Technologies, Mỹ) Quy trình tách
chiết RNA và phản ứng RT theo như quy trình
hướng dẫn của nhà sản xuất
KẾT QUẢ - BÀN LUẬN
Điều kiện PCR của phản ứng monoplex
Chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ bắt
cặp và nồng độ mồi tối ưu của từng phản ứng
(monoplex) để từ đó chọn điều kiện tốt nhất để
sử dụng trong phản ứng mulitplex Chỉ tiêu để
đánh giá là giá trị Ct được thể hiện bằng trị số
trung bình ± độ chênh lệch (standard deviation)
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần Mẫu sử dụng
cho thí nghiệm này là mẫu chuẩn được pha
loãng ở nồng độ 1000 bản sao/phản ứng Kết
quả giá trị Ct của phản ứng PSA ở các nhiệt độ
bắt cặp 55, 58, 60, 62 và 650C lần lượt là 27,69 ±
0,49; 26,98 ± 0,64; 31,00 ± 2,09; 29,69 ± 2,93; 31,76
± 2,53 Ở phản ứng PCA3, giá trị Ct ở các nhiệt
độ bắt cặp 55, 57, 59, 61, 630C lần lượt là 32,05 ±
0,85; 33,56 ± 0,47; 32,82 ± 0,90; 32,63 ± 0,70; 31,98
± 0,51 Kết quả trên cho thấy ở nhiệt độ 58-590C,
cả 2 phản ứng đều cho giá trị Ct thấp nhất nên chọn nhiệt độ tương đối là 580C cho các thí nghiệm tiếp theo
Phản ứng monoplex PSA có giá trị Ct thấp nhất ở nồng độ 150 nM Trong khi đó, ở phản ứng monoplex PCA3, giá trị Ct được cải thiện từ nồng độ 350-750 nM (Bảng 1) Để giảm thiểu sự tương tác giữa 2 phản ứng trong multiplex chúng tôi chọn nồng độ mồi thấp nhất có giá trị
Ct được cải thiện là 350 nM
Bảng 1 Giá trị Ct trung bình ở các nồng độ mồi
khảo sát
Xây dựng phản ứng multiplex
Sau khi đã chọn nhiệt độ bắt cặp và nồng độ mồi cho mulitplex, tiến hành so sánh giá trị Ct giữa phản ứng multiplex với monoplex Chúng tôi sử dụng 2 hỗn hợp mẫu chuẩn có nồng độ là
103 và 105 bản sao/phản ứng gồm mẫu chuẩn PSA và PCA3 theo tỉ lệ 1:1 làm mẫu khảo sát trong thí nghiệm này Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần Kết quả (bảng 2) cho thấy giá trị Ct của phản ứng monoplex real-time PCR và multiplex real-time PCR không có sự khác biệt đáng kể
Do đó, chúng tôi không tiến hành các thí nghiệm tối ưu hóa phản ứng multiplex real-time PCR PSA, PCA3 mà sử dụng các điều kiện của phản ứng monoplex
Bảng 2 Giá trị Ct của phản ứng monoplex và phản
ứng multiplex
3
Trang 4Monoplex Multiplex
3
Tiếp theo, chúng tôi khảo sát hiệu quả của
từng phản ứng trong multiplex với đường
chuẩn thiết lập từ 4 hỗn hợp mẫu chuẩn có
nồng độ từ 102 đến 105 bản sao/phản ứng Tiêu
chí đánh giá quy trình đạt là hiệu quả của phản
ứng PCA3 và PSA trong multiplex nằm trong khoảng 90-105% và hệ số xác định của đường chuẩn R2 > 0,980 Kết quả ở hình 1 cho thấy hiệu quả của cả 2 phản ứng PSA và PCA3 trong multiplex lần lượt là 102,0% và 96,3% với hệ số xác định của đường chuẩn là 0,999 và 0,998 Các giá trị này phù hợp với yêu cầu của đường chuẩn trong real-time RT-PCR
Hình 1 Đường chuẩn của phản ứng PCA3 (FAM) và PSA (Cy5) trong multiplex
Thử nghiệm quy trình trên mẫu bệnh
nhân
Quy trình multiplex được thử nghiệm trên 3
mẫu nước tiểu của bệnh nhân phì đại tiền liệt
tuyến và 3 mẫu ung thư tiền liệt tuyến thu nhận
ngay sau khi thăm khám trực tràng (DRE –
Digital rectal exam)
Hai marker PCA3 và PSA biểu hiện bên
trong tế bào TLT và chỉ xuất hiện ở nồng độ
thấp trong nước tiểu Khi có tác động lên TLT
(ví dụ như thao tác thăm khám DRE), các tế bào
TLT bong ra sẽ được vận chuyển vào trong niệu
đạo, nhờ vậy phần nước tiểu đầu tiên sau DRE
sẽ chứa các marker TLT ở nồng độ cao Tuy
nhiên, do lượng mRNA PCA3 trong nước tiểu
rất biến thiên nên việc định lượng PCA3 riêng
lẻ sẽ không có ý nghĩa về mặt chẩn đoán Do đó,
mRNA của “gene giữ nhà” PSA được sử dụng
để đồng quy hóa (normalize) quy trình về lượng tế bào TLT thu nhận được sau DRE(2)
Số lượng bản sao mRNA PCA3 và PSA trong phản ứng được xác định bằng phương pháp hồi quy tuyến tính dựa trên đường chuẩn được chạy song song với mẫu bệnh nhân Mỗi mẫu được lặp lại 2 lần Các giá trị được thể hiện bằng trị số trung bình ± độ chênh lệch Chỉ số PCA3 được tính theo công thức nồng độ PCA3×1000/nồng độ PSA(7)
Giá trị Ct và số lượng bản sao mRNA PCA3
và PSA trong phản ứng được thể hiện ở bảng 3 mRNA PCA3 và PSA được phát hiện trên 6/6 mẫu nước tiểu Chỉ số PCA3 trung bình ở nhóm không ung thư (phì đại tiền liệt tuyến) và nhóm UTTLT lần lượt là 68,2 và 158,0
Trang 5Bảng 3 Số lượng bản sao mRNA PCA3 và PSA trong phản ứng và chỉ số PCA3
STT
Chỉ số PCA3
Kết quả giải phẫu bệnh
Số bản sao mRNA/
phản ứng
BPH: Phì đại tiền liệt tuyến PCa: Ung thư tiền liệt tuyến
Như vậy, quy trình real-time RT-PCR trong
đề tài đã phát hiện và định lượng thành công
mRNA PCA3 và PSA Chỉ số PCA3 cũng cho
thấy có sự khác nhau tương đối giữa bệnh nhân
UTTLT và không ung thư Tuy nhiên, cần thử
nghiệm thêm trên quần thể mẫu lớn hơn để tìm
giá trị ngưỡng thích hợp cho quy trình real-time
RT-PCR này
KẾT LUẬN
Quy trình có thể được sử dụng để định
lượng mRNA PCA3 và PSA và từ đó tính toán
chỉ số PCA3 ứng dụng trong sàng lọc UTTLT
Quy trình cần được thử nghiệm thêm trên số
lượng mẫu lớn hơn
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Center MM., Jemal A., Lortet-Tieulent J., Ward E., Ferlay J.,
Brawley O., Bray F (2012) International Variation in Prostate
Cancer Incidence and Mortality Rates European Urology, 61:
1079-1092
2 Hessels D., Klein Gunnewiek JMT., van Oort I., Karthaus
HFM., van Leenders GJL., van Balken B., Kiemeney LA.,
Witjes JA., Schalken JA (2003) DD3PCA3-based Molecular
UrineAnalysis for the Diagnosis of Prostate Cancer
European Urology, 44: 8-16
3 Hoang VD, Lee AH., Nguyen HN., Nguyen Q., Vu LC., Binns CW (2014) Epidemiology and prevention of prostate cancer in Vietnam Asian Pac J Cancer Prev, 15(22):
9747-9751
4 Madu CO., Lu Y (2010) Novel diagnostic biomarkers for prostate cancer J Cancer, 1: 150–177
5 Mearini E., Antognelli C., Del Buono C., Cochetti G., Giannantoni A., Nardelli E., Talesa VN (2009) The combination of urine DD3 PCA3 mRNA and PSA mRNA as molecular markers of prostate cancer Biomarkers,14(4):
235-243
6 Ruiz-Aragon J., Marquez-Pelaez S (2010) Assessment of the PCA3 test for prostate cancer diagnosis: a systematic review and meta-analysis Actas urologicas espanolas, 34: 346-355
7 Shappell SB., Fulmer J., Arguello D., Wright BS., Oppenheimer JR., and Putzi MJ (2009) PCA3 Urine mRNA Testing for Prostate Carcinoma: Patterns of Use by Community Urologists and Assay Performance in Reference Laboratory Setting Urology, 73: 363-368
8 Shen M., Chen W., Yu K., Chen Z., Zhou W., Lin X., Weng Z.,
Li C., Wu X., Tao Z (2011) The diagnostic value of PCA3 gene-based analysis of urine sediments after digital rectal examination for prostate cancer in a Chinese population Experimental and Molecular Pathology, 90: 97-100