Haem đóng vai trò một thành phần cấu tạo của nhiều protein tham gia vào quá trình vận chuyển oxy, chuỗi hô hấp và chuyển hoá thuốc. Tuy vậy, quá trình dị hoá của haem ở tế bào động vật vẫn còn nhiều điều chưa sáng tỏ. Haem giáng hoá thành sắt, carbon monoxit (CO) và biliverdin, chất sau đó được chuyển hoá thành bilirubin.
Trang 1SINH TỔNG HỢP MỚI (DE NOVO) LIÊN TỤC
VÀ CHUYỂN HOÁ NHANH THÀNH BILIRUBIN CỦA HAEM
LÀ CẦN THIẾT ĐỐI VỚI CƠ CHẾ BẢO VỆ TẾ BÀO
Trần Tiến Tài*
TÓM TẮT
Mở đầu: Haem đóng vai trò một thành phần cấu tạo của nhiều protein tham gia vào quá trình vận chuyển
oxy, chuỗi hô hấp và chuyển hoá thuốc Tuy vậy, quá trình dị hoá của haem ở tế bào động vật vẫn còn nhiều điều chưa sáng tỏ Haem giáng hoá thành sắt, carbon monoxit (CO) và biliverdin, chất sau đó được chuyển hoá thành bilirubin Do việc định lượng bilirubin tương đối phức tạp, dù có quan trọng về mặt lâm sàng lâm sàng,quá trình sản xuất và vận chuyển sản phẩm này còn nhiều điều chưa được làm rõ
Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu:Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng UnaG, một loại protein
huỳnh quang gắn bilirubin được tìm thấy gần đây, vào việc khảo sát bilirubin trên nhiều dòng tế bào người
Kết quả:Chúng tôi tìm thấy một lượng bilirubin đáng kể được tạo ra ở nhiều dòng tế bào không phải huyết
cầu Những kết quả thu được cho thấy có sự tổng hợp haem ở mức cơ sở và sự chuyển hoá tiếp tục thành bilirubin Đáng chú ý, nhiều biến đổi quan trọng được ghi nhận với bilirubin khi tế bào ở trạng thái tress
Kết luận: Do tổn thương tế bào khi stress bị thúc đẩy bởi sự phong toả chuyển hoá haem nhưng lại được cải
thiện bởi việc bổ sung biliverdin và bilirubin, có khả năng sự tổng hợp mới haem và chuyển hoá thành bilirubin theo sau đó đóng vai trò không thể thiếu trong bảo vệ tế bào khỏi sự tổn thương
Từ khoá: bilirubin, haem, bảo vệ tế bào
ABSTRACT
CONTINUOUS DE NOVO BIOSYNTHESIS OF HAEM AND ITS RAPID TURNOVER TO BILIRUBIN ARE NECESSARY FOR CYTOPROTECTION AGAINST CELL DAMAGE
Tran Tien Tai * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No 5 - 2016: 42 - 51
Background: It is well known that haem serves as the prosthetic group of various haemoproteins that
function in oxygen transport, respiratory chain, and drug metabolism However, much less is known about the functions of the catabolites of haem in mammalian cells Haem is enzymatically degraded to iron, carbon monoxide (CO), and biliverdin, which is then converted to bilirubin Owing to difficulties in measuring bilirubin, however, the generation and transport of this product remain unclear despite its clinical importance
Objectives-Method: We used UnaG, the recently identified bilirubin-binding fluorescent protein, to
analyses bilirubin production in a variety of human cell lines
Results:We detected a significant amount of bilirubin with many non-blood cell types, which was sensitive
to inhibitors of haem metabolism These results suggest that there is a basal level of haem synthesis and its conversion into bilirubin Remarkably, substantial changes were observed in the bilirubin generation when cells were exposed to stress insults
Conclusion: Since the stress-induced cell damage was exacerbated by the pharmacological blockade of haem
metabolism but was ameliorated by the addition of biliverdin and bilirubin, it is likely that the de novo synthesis of haem and subsequent conversion to bilirubin play indispensable cytoprotective roles against cell damage
* Bộ môn Sinh lý – Sinh lý bệnh – Miễn dịch học, ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch
Trang 2Key worlds: bilirubin, haem, against cell damage
MỞ ĐẦU
Haem cần 8 men trong quá trình sinh tổng
hợp và 3 men cho sự giáng hoá nó Ba bước khởi
đầu và kết thúc của tổng hợp hợp haem diễn ra
trong ty thể Trongphản ứng đầu tiên,
5-aminolevulenic acid (ALA) synthase xúc tác sự
ngưng kết glycine và succinyl-CoA tạo thành
ALA(36,30) Ferrochelatase là men tổng hợp cuối
cùng, xúc tác cho việc gắn sắt vào
protoporphyrin IX (PPIX) để tạo thành haem(29,5)
Haem tạo thành được
vận chuyển ra khỏi ty thể và sử dụng để tạo
nên các protein hoàn chỉnh Chuỗi chuyển hoá
haem được điều hoà tại một vài bước và còn
chịu sự điều khiển của nhịp sinh học, các
hormones và stress oxi hoá(8,15,14) Tuy vậy, sự liên
kết giữa haem và các con đường chuyển hoá
khác vẫn còn ít được biết đến
Bilirubin là sản phẩm cuối cùng của sự giáng
hoá haem Nó được tạo ra từ phản ứng với haem
oxygenase (HO), có tác dụng giáng hoá haem
thành biliverdin, sắt và carbon monoxide
(CO)(3,1) Cuối cùng, biliverdin reductase trong tế
bào chất tạo ra bilirubin, chất được đào thải sau
khi liên hợp với glucoronate trong gan HO (gồm
HO-1 và HO-1) đóng vai trò là một chất điều hoà
có tác dụng duy trì nồng độ haem nội bào Sắt
tạo bởi HO được tái sử dụng vào các protein có
chứa sắt(26,10,25) Bilirubin có đặc tính chống oxy
hoá(24,35) Dạng liên hợp của nó không tan trong
nước, gắn vào albumin và được chuyển vào tế
bào gan thông qua nhiều hệ thống vận
chuyển(24,35) Sau khi glucuronin hoá bởi các men
gan, bilirubin liên hợp được tiết vào mật Sự gián
đoạn trong vận chuyển gan mật sẽ dẫn đến triệu
chứng vàng da trong nhiều bệnh lý của gan(35,7)
Mặc dù bilirubin trong mật bắt nguồn chủ yếu từ
hemoglobin của tế bào hồng cầu lão hoá qua con
đường chuyển hoá gan(7), sự sản xuất và vận
chuyển bilirubin ở mô ngoại vi chưa được nhắc
đến.Bên cạnh đó, CO có thể liên quan đến sự bảo
vệ tế bào khỏi những tổn thương oxy hoá thông
qua chất cảm ứng với stress HO-1(34,13) Vì vậy, sự cảm ứng HO-1 sinh lý có khả năngbảo toàn mô trước các stress oxy hoá, góp phần vào sự điều
hoà các đáp ứng viêm in vivo, và hoạt động như
một cơ chế tự vệ của mô(34,13,19) Tuy nhiên, cơ chế chính xác của phản ứng HO-1 đối với chức năng bảo vệ này vẫn còn chưa rõ
Gần đây,protein huỳnh quang tìm thấy trong lươn UnaG được phát hiện gắn với bilirubin tự
do với ái lực cao(18) Việc định lượng bilirubin trong mô và huyết thanh trở thành một ứng dụng hữu ích của UnaG Chúng tôi khảo sát sự tạo thành bilirubin ở tế bào người bằng UnaG và tìm thấy tất cả các dòng tế bào được khảo sát liên tục sản xuất và phóng thích bilirubin, thông qua sinh tổng hợp haem Thêm vào đó, tế bào duy trì dòng chuyển hoá haem, sản xuất và phóng thích sản phẩm đầu cuối bilirubin Hoạt động trao đổi chất liên tục này của haem cần thiết cho sự bảo
vệ tế bào khỏi tress và duy trì cân bằng nội môi của chúng
PHƯƠNG PHÁP Xây dựng plasmid biểu hiện UnaG
Để xây dựng vector vi khuẩn biểu hiện mang UnaG, pcDNA3-flag-UnaG(18) được cắt với các men BamHI và EcoRI, và đoạn chèn được phân lập gắn vào các điểm BamHI và EcoRI của pET32a(+) Tiếp theo, pET-UnaG được chuyển vào BL21 UnaG được cảm ứng với 0.3mM isopropyl thiogalactopyranoside (IPTG) và tinh sạch bằng hạt ion nickel
Nuôi cấy tế bào
Tế bào ung thư biểu mô cổ tử cung HeLa, ung thư gan HepG2, ung thư biểu mô da A431, ung thư vú MCF7, ung thư gan Alexander (PLC/PRF/5) và phôi thận HEK293T được nuôi trong môi trường Eagle’s điều chỉnh theo Dulbecco (DMEM) bổ sung 7% FCS, penicillin (100 đơn vị/ml) và streptomycin (100 ug/ml) Tế bào ung thư ruột DLD-1 và ung thư máu K562 được nuôi bằng RPMI1640 chứa 7% FCS và kháng sinh HEK293T được chuyển
Trang 3pcDNA3-flag UnaG bằng Lipofectamine 2000 (Invitrogen)
và ủ 16 giờ Để tạo ra tế bào chuyển gen ổn định
HepG2 và HeLa, pcDNA3-flag UnaG(18) (10ug)
được chuyển với calcium phosphate(31) G148 ở
nồng độ đích 300 ug/ml được cho vào môi
trường nuôi để chọn lọc Sau 5 ngày, những
dòng tế bào kháng G418 được chuyển nuôi vào
đĩa 24 giếng với môi trường chứa G418 300
ug/ml Từng dòng được phân lập và đánh giá
biểu hiện UnaG bằng kính hiển vi huỳnh quang
4 dòng biểu hiện UnaG được thu nhận, trộn lẫn
để tránh biến thể dòng và duy trì với DMEM
chứa 7% FCS và kháng sinh Với tế bào chứng,
HepG2 được chuyển vector pcDNA3.1 và phân
lập tế bào kháng G418 Haem trong tế bào được
đánh giá bằng chỉ thị màu sử dụng bộ khảo sát
haem
Khảo sát huỳnh quang của bilirubin
Tế bào được nuôi với môi trường tổng hợp
không bilirubin VP-SFM chứa BSA 2 mg/ml
Biểu hiện của UnaG trong tế bào sống được
quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang Tiếp
theo tế bào bị phá màng bằng siêu âm, lượng
bilirubin gắn vào UnaG được đánh giá bằng
huỳnh quang và đo với quang phổ kế, sử dụng
bước sóng kích thích 480 nm và bước sóng phát
xạ được dò trong khoảng 500 đến 550 nm(18) Để
đo lượng bilirubin trong môi trường, môi trường
được ủ với UnaG tái tổ hợp mang his-tag (2ug)
trong 1 giờ ở 25oC Sau đó UnaG sẽ bị bắt giữ bởi
hạt Ni2+ Sau khi rửa với TBS, UnaG được hoà
với TBS chứa 300 uM imidazole và đo huỳnh
quang
Vết miễn dịch
Dịch tế bào HEK293T được làm mẫu chạy
SDS-PAGE và điện di trên màng poly(vinylidene
difluoride) (PVDF)(25,31)
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay Tế
bào được xử lý với các chất tác động trong 24h
và trộn với MTT (500 ug/ml) trong 1 giờ MTT
formazan tạo thành được hoà với isopropanol
Đo hấp thu tại bước sóng 590 nm được đo với
máy đọc quang 96 giếng Thí nghiệm được tiến hành với 4-6 lần lặp
Thống kê
Các kết quả được thể hiện ở dạng trung bình±SD và phân tích bằng Student’s t-test không ghép cặp Các phân tích thống kê được ghi nhận khác biệt tại mức p<0.05 sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2010(25,31)
KẾT QUẢ Bilirubin được tổng hợp trong tế bào và phóng thích ra môi trường
UnaG được phát hiện gắn vào bilirubin tự
do và phát huỳnh quang(18) Nhằm đánh giá sự sản xuất bilirubin ở tế bào người, đầu tiên chúng tôi đo nồng độ bilirubin trong tế bào được nuôi cấy bằng UnaG tái tổ hợp Do huyết thanh nhau
bê (FCS) có chứa bilirubin (7-10 pmol/ml), chúng tôi sử dụng môi trường tổng hợp không bilirubin VP-SFM thay cho DMEM có chứa FCS
để đánh giá lượng bilirubin Nồng dộ bilirubin trong môi trường nuôi tế bào HEK 293T, HeLa
và HepG2 tăng tuyến tính đến 5 giờ (Hình 1a) Bilirubin sản xuất bởi tế bào DLD-1, Alexander, A431 và MCF7 tương tự với HeLa Một lượng nhỏ bilirubin được phóng thích theo thời gian từ
tế bào ung thư máu K562 Xử lý tế bào K562 với haeminđưa đến sự gia tăng bilirubin được sản xuất (Hình 1b) Vết miễn dịch cho thấy một số men, bao hồm HO-1, HO-2, biliverdin reductase
A (BVRA) và B (BVRB), là những chất có liên quan đến sự tạo thành bilirubin từ haem, hiện diện phổ biến trong những dòng tế bào này, ngoại trừ HO-1 ở K562 (Hình 1c) Những kết quả trên cho thấy tất cả các dòng tế bào được khảo sát sản xuất bilirubin một cách liên tục Khi
tế bào HEK293T được xử lý với ALA, haemin hoặc biliverdin, bilirubin môi trường gia tăng rõ rệt (Hình 2a) Ngược lại, bilirubin không được tìm thấy trong môi trường nuôi tế bào được xử
lý với succinyl acetone (SA), chất ức chế đặc hiệu của ALA dehydratase Khi tế bào tiếp xúc với protoporphrin thiếc (Sn-PP), chất ức chế HO, hoặc protoporphyrin N-methyl (N-MePP), chất
Trang 4ức chế ferrochelatase, bilirubin môi trường giảm
(Hình 2b) Protoporphyrin kẽm (Zn-PP) triệt
tiêu hoàn toàn sự tạo thành bilirubin Chúng tôi
cũng khảo sát lượng haem nội bào ở tế bào HEK
Như trong hình 2c, haem tăng nhẹ bởi ALA hoặc
sắt citrate trong khi giảm với SA Tiếp theo,
chúng tôi đánh giá sự tạo thành bilirubin với tế
bào HepG2 và HeLa biểu hiển ổn định UnaG
Các tế bàonày phát huỳnh quang trong môi
trường không bilirubin (Hình 2d) Độ mạnh
huỳnh quang trong tế bào và môi trường tăng
khi xử lý với ALA, haemin và bilirubin (Hình
2e) trong khi SA làm giảm cường độ Mức UnaG
trong tế bào HepG2 biểu hiện UnaG không đổi
trong các điều kiện trên (Hình 2f) Tiếp đó
chúng tôi so sánh sự tạo thành bilirubin trong
môi trường khi có hoặc không có sự hiện hiện
của SA Thí nghiệm này giảm lượng bilirubin nội
bào trong môi trường, ngay cả khi có đưa
haemin hoặc bilirubin (Hình 3a,b), cho thấy
bilirubin được tổng hợpmới có khuynh hướng
gắn với UnaG
HO-1 cảm ứng bởi sodium arsenite, cadmium
chloride và diethyl malate (DEM) không làm tăng sự
hình thành bilirubin Mặc dù sự cảm ứng HO-1
bởi các chất kích ứng haem làm tăng sắt nội
bào(36,37), chất kích ứng khác haem vẫn chưa được
biết rõ có ảnh hưởng thế nào đến sự hình thành
Khi cho HEK293T tiếp xúc với sodium arsenite,
cadmium chloride, và DEM, lượng HO-1 tăng
(Hình 4a) Việc xử lý tế bào HEK với những chất
tác động này làm giảm lẫn tăng nhẹ sự hình
thành bilirubin, cho thấy sự tạo thành bilirubin
không tăng rõ rệt điều kiện stress(Hình 4b).Tế
bào HepG2 biểu hiện UnaG trong tất cả các thử
ngiệm cũng không biểu hiện một sự thay đổi rõ
ràng nào trong sự hình thành bilirubin nội và
ngoại bào, ngoại trừ sự tăng nhẹ trong trường
hợp cadmium (Hình 4c) Hơn nữa, xử lý tế bào
HepG2 với SA làm giảm bilirubin môi trường kể
cả với sự hiện diện của chất kích ứng (Hình 4d) Những kết quả trên cho thấy sự chuyển hoá hoặc giáng hoá của haem ở những protein chứa haem không thể được đẩy nhanh trong điều kiện stress
Vai trò bảo vệ tế bào của biliverdin và bilirubin trong phản ứng HO
Nhằm đánh giá vai trò sinh lý của sự sản xuất liên tục haem và chuyển hoá nhanh thành bilirubin tiếp đó, tế bào được cho tiếp xúc với những tác nhân gây tổn thương như menadion, DEM(39,38) Phép đo MTT được thực hiện để lượng giá tổn thương tế bào Khi tế bào HEK 293T được xử lý kết hợp với DEM và SA, tế bào chết tăng khi so sánh với nhóm chỉ với DEM (Hình 5a) Việc ngăn chặn tổng hợp haem đưa đến sự nhạy cảm với tổn thương oxy hoá Thêm haemin 10 uM vào tế bào xử lý với DEM và SA dẫn tới sự hồi phục của tế bào Nống độ cao hơn của haemin (20-50 uM) lại kích ứng độc tế bào Tiếp đó, chúng tôi ủ tế bào xử lý DEM và SA với sản phẩm phản ứng của HO Sự chết tế bào giảm trong so sánh với nhóm được xử lý không có
tricorbonyldichlororuthenium (II) dimer (CORM2) hình thành từ CO không giảm thiểu tổn thương tế bào Bilirubin thêm vào ở nồng độ thấp (0,1 uM) chống lại sự chết tế bào do cảm ứng DEM và SA Tổn thương tế bào do menadione và SA cũng giảm nhờ biliverdin và bilirubin nhung không do CORM Xử lý tế bào với DEM với sự hiện diện của Zn-PP làm tế bào chết, và sự bổ sung haemin làm tăng nhẹ số lượng tế bào sống Sự tổn thương tế bào bởi DEM và Zn-PP không hồi phục bởi CORM2, nhưng sự hồi phục lại được ghi nhận với với biliverdin Những kết quả trên gợi ý rằng sự sản xuất biliverdin và bilirubin do phản ứng HO trong tế bào có vai trò bảo vệ
Trang 5Hình 1 Sự tạo thành và phóng thích bilirubin ở tế bào người (a) Sự phóng thích bilirubin từ tế bào ra môi trường theo thời gian (b) Sự tạo thành bilirubin ở tế bào K562 (c) Phân tích vết miễn dịch các protein liên quan
đến sự tạo thành bilirubin
Hình 2.Những thay đổi trong sản xuất bilirubin và lượng haem nội bào khi xử lý với chất ức chế sinh
*p<0,005, **p<0,01 so với nhóm chứng (b) Hiệu ứng của các chất ức chế (c) Thành phần haem (n=4 cho từng nhóm), *p<0,01 (d) Hình ảnh hiển vi Thanh chuẩn: 20uM (e) Bilirubin nội và ngoại bào (n=4 cho từng nhóm)
*p<0,01, **p<0,05 so với nhóm chứng (f) Phân tích vết miễn dịch của UnaG
Trang 6Hình 3 Hiệu ứng của SA, haemin, hoặc bilirubin trên sự sản xuất bilirubin ở tế bào HepG2 biểu hiện UnaG (a) Hình ảnh hiển vi.(b) Lượng bilirubin nội và ngoại bào (n=3 cho từng nhóm), *p<0.05
Hình 4 Sự tạo thành bilirubin ở tế bào HEK293T và HepG2 được xử lý arsenite, cadminium và DEM
(a) Phân tích vết miễn dịch (b) Bilirubin trong môi trường (n=4 cho từng nhóm), *p<0,01 (c) Bilirunbin trong tế bào HepG2 biểu hiện UnaG và tiếp xúc với các chất gây stress *p<0,01 (d) Bilirubin trong tế bào HepG2 xử lý với
SA (n=4 cho từng nhóm)
Trang 7Hình 5.Sự gia tăng các tổn thương oxy hóa bằng sự ức chế chuyển hóa haem và sự hòi phục nhờ biliverin và
bilirubin (a) Sự gia tăng tổn thương tế bào với SA và sự hồi phục nhờ biliverdin và bilirubin (n=6 cho từng nhóm) *p<0.01,
**p<0.05 so với xử lý với DEM và SA (b) Hiệu ứng của ZN-PP, biliversin và bilirubin đối với tổn thương oxy hóa (n=5 cho từng nhóm) *p<0.01
BÀN LUẬN
Trong nghiên cứu này, đầu tiên chúng tôi
cho thấy nhiều dòng tế bào liên tục sản xuất và
giáng hoá haem Bilirubin cuối cùng được tạo ra
và phóng thích từ tế bào vào môi trường Để loại
bỏ các dòng bilirubin khác vào môi trường,
chúng tôi sử dụng môi trường không bilirubin,
và phát hiện ra tất cả các tế bào được khảo sát
liên tục sản xuất bilirubin Tất cả các tế bào
nghiên cứu biểu hiện các men tham gia dị hoá
haem (Hình 1c) Tế bào ung thư máu K563 chỉ
tạo ra khoảng 1/10 lượng bilirubin sản xuất bởi tế
bào HEK293T và HepG2 K563 không biểu hiện
HO-1, nhưng HO-2 giáng hoá haem tạo thành
biliverdin, chất được biến đổi thành bilirubin bởi
BVR Vì vậy, ngay cả hồng cầu, những tế bào sử
dụng haem với số lượng lớn để tổng hợp
hemoglobin, sản suất bilirubin qua con đường
giáng hoá haem Kumagai và cộng sự(18) đã báo
cáo rằng bilirubin hiện diện rộng rãi trong não
của phôi chuột (E16.5) và tế bào HeLa xác định
bằng huỳnh quang UnaG Một nghiên cứu trước đây(20) sử dụng thí nghiệm đánh dấu xung với ALA hoặc sắt đồng vị phóng xạ, cho thấy có sự giáng hoá nhanh của haem mới tổng hợp trong gan chuột và tế bào gan được phân tách Từ những phát hiện này, chúng tôi kết luận rằng tế bào động vật liên tục tổng hợp bilirubin từ bước khởi đầu là tổng hợp haem thông qua con đường chuyển hoá haem
Cho tế bào tiếp xúc với nhứng chất kích ứng stress khác haem, bao gồm asenite, cadminium
và DEM, đưa đến sự cảm ứng HO-1, nhưng chỉ những thay đổi nhỏ trong sản xuất bilirubin (Hình 4 b,c) Hơn nữa, thử nghiệm với SA dẫn tới việc dừng hoàn toàn sự sản xuất bilirubin trong điều kiện tress bởi arsenite, cadminium và DEM Quan sát này cho thấy rằng sự cảm ứng của HO-1 không phải luôn đi đôi với sự giáng hoá của các cấu thành haem nhằm bảo vệ tế bào khỏi các stress oxy hoá Quan sát tương tự được ghi nhận bởi Shetefel và cộng sự(33), cụ thể, chất
Trang 8cảm ứng khác haem là arsenite kích ứng sự biểu
hiện của HO-1 ở đại thực bào chuột RAW264.7
nhưng không làm thay đổi sự chuyển hoá sắt
của tế bào Những tác giả này cũng phát hiện
rằng tế bào biểu hiện ổn định HO-1 được bảo vệ
khỏi stress oxy hoá, nhưng sự tổng hợp ferritin
không tăng Một nghiên cứu in vivo(2) cho thấy
mức bilirubin nước tiểu ở chuột được tiêm
arsenite từ vừa đến mạnh theo sau sự cảm ứng
của HO-1 gan Bilirubin nước tiểu nhanh chóng
trở về mức cơ bản, mặc dù HO-1 gan tiếp túc
biểu hiện ở mức cao Vì vậy, cảm ứng của HO-1
không liênquan đến sự giáng hoá của haem
trong điều kiên stress, nhưng những quá trình
khác có thể xảy ra để đáp ứng lại stress tế bào
Trái lại, HO-1 tăng được cho rằng dẫn đến sự gia
tăng giáng hoá của haem nội bào và thay đổi
tình trạng sắt nội bào theo sau(17) Những sự kiện
này có thể liên quan đến sự bảo vệ tế bào chống
lại stress oxy hoá Thực tế, việc biểu hiện HO-1
được ghi nhận làm thay đổi sự phân phối sắt nội
bào, đưa đến hiệu ứng bảo vệ tế bào chống lại
hydrogen peroxide(19) Trên cơ sở những quan sát
này, sự cảm ứng HO-1 không phải lúc nào cũng
có sự tương quan với sự giáng hoá của haem và
chuyển hoá sắt Tuy nhiên, sự điều hoà haem và
chuyển hoá sắt là chuyên biệt theo tế bào Xem
xét sự biểu hiện ở khía cạnh xúc tác, HO-1 và
HO-2 bất hoạt vẫn dẫn đến hiệu ứng bảo vệ tế
bào chống lại stress oxy hoá(16,12), HO thuần có
thể bảo vệ tế bào hiệu quả; nói cách khác, chức
năng bảo vệ tế bào của HO có thể tách biệt với
mức độ giáng hoá của haem bằng phản ứng HO
Nhiều nghiên cứu(3,26,6) cho thấy hiệu ứng bảo
vệ tế bào của phản ứng HO hoặc sản phẩm của
nó CO, biliverdin và bilirubin Chúng tôi tìm
thấy haem được tổng hợp liên tục, giáng hoá và
cuối cùng chuyển hoá thành bilirubin Thêm vào
đó, tế bào liên tục sản xuất CO, biliverdin và
bilirubin ở một mức cơ bản (Hình 2,3) Vì vậy,
để đánh giá đặc tính sinh lý của sự chuyển hoá
liên tục heam, tế vào được cho tiếp xúc với
những tác nhân oxi hoá DEM và menadione Sự
tổn thương tế bào tăng với xử lý bằng SA, chỉ ra
rằng tổng hợp haem là cần thiết cho sự bảo vệ chống lại những tổn thương oxy hoá Việc bổ sung 10uM haemin phần nào hồi phục tế bào, cho thấy rằng dòng heam là cần thiết cho việc bảo vệ chống lại tổn thương oxy hoá Ngược lai, haemin đưa từ ngoài vào với lượng dư lại gây ra
sự tổn thương Vì vậy, haem là một phân tử 2 mặt; ở nồng độ sinh lý, nó thực hiện những vai trò cần thiết, trong khi lượng dư thừa của hem dẫn đến stress oxy hoá hoặc tổn thương tế vào Với sự hiện diện của Zn-PP, một chất ức chế cạnh tranh của phản ứng HO, tế bào trở nên nhạy cảm với tổn thương, gợi ý rằng các sản phẩm của phản ứng HO có thể là những chất bảo vệ chống lại sự phá huỷ
Cuối cùng, biliverdin và bilirubin, nhưng không phải CO, làm giảm nhẹ các tổn thương tế bào Bilirubin ở nồng độ thấp (100 nM) có hiệu quả trong việc phòng ngừa phá huỷ tế bào nhưng không có tác dụng ở nồng độ cao hơn
(1-10 uM) Trong môi trường nuôi cấy chứa (1-10% FCS, nồng độ bilirubin tương đương 1nM, mức không đủ phòng ngừa stress oxy hoá Tuy nhiên, xem xét một nghiên cứu khác(28)cho thấy nồng đọ 1-20 uM bilirubin cảm ứng HO-1 thông qua hoạt hoá yếu tố phiên mã đáp ứng stress Nrf2, việc dùng bilirubin ở nồng độ cao hơn có thể gây stress tế bào Dựa trên những phát hiện của chúng tôi, bilirubin trong tế bào được xử lý với
SA không hoàn toàn bổ sung bởi bilirubin từ
ngoài, có khả năng bilirubin tạo mới(de novo)
trong tế bào hiệu quả hơn trong việc phòng ngừa các tổn thương tế bào Vì vậy, có thể sự chuyển hoá biliverdin thành bilirubin bởi BVR đóng vai trò quan trọng trong việc tự vệ tế bào Về mặt này, BVR điều hoà bởi biliverdin trở thành một yếu tố phiên mã là một chất đièu hoà quan trọng trong các đáp ứng miễn dịch bẩm sinh đo sự tác động hoặc chấn thương(22,40)
Khoảng 80% bilirubin hình thành mỗi ngày bắt nguồn từ sự giáng hoá của haemoglobin trong hồng cầu(21) 20% còn lại từ sự tạo hồng cầu không hiệu quả ở tuỷ xương và sự giáng hoá của các protein hem khác Các nghiên cứu trên
Trang 9chuyển hoá bilirubin chủ yếu được tiến hành với
gan người và động vật(35,7) Dữ liệu trong nghiên
cứu này cung cấp bằng chứng rằng bilirubin ở tế
bào ngoại vi được sản xuất trực tiếp thông qua
con đương haem và không phải luôn từ những
protein haem Những nghiên cứu trước đó(32,11)
cho thấy ALA đồng vị phóng xạ được tiêm vào
chuột, bilirubin đồng vị xuất hiện trong mật
trong vòng 15 phút Bilirubin này có thể bắt
nguồn từ sự chuyển hoá nhanh nguồn từ bào
tương tế bào gan giáng hoá mà không liên quan
đến các protein haem Những kết quả hiện tại
cho thấy haem mới tổng hợp liên tục được
chuyển hoá thành bilirubin Bilirubin được xuất
ra ngoại bào, gắn vào albumin, và được vận
chuyển đến gan thông qua hệ tuần hoàn Về mặt
này, bệnh nhân thiếu máu tán huyết chịu tình
trạng tăng bilirubin máu do sự gia tăng bilirubin
tự do trong huyết thanh, có thể do sự sản xuất
quá mức bilirubin(24,7) Sự sụt giảm thanh thải
bilirubin bởi tế bào gan có thể gây ra sự tích tụ
bilirubin tự do, nhưng điều này rất hiếm(23,9)
Những khiếm khuyết của các protein vận
chuyển bilirubin cần được làm rõ để giải thích
các bệnh nghiêm trọng Gan bình thường biểu
hiện một số lượng lớn các protein vận chuyển,
bao gồm các ion dương hữu cơ, những chất có
thể loại bỏ một lượng lớn bilirubin trong hệ tuần
hoàn và liên hợp với glucuronate
KẾT LUẬN
Do tổn thương tế bào khi stress bị thúc đẩy
bởi sự phong toả chuyển hoá haem nhưng lại
được cải thiện bởi việc bổ sung biliverdin và
bilirubin, có khả năng sự tổng hợp mới haem và
chuyển hoá thành bilirubin theo sau đó đóng vai
trò không thể thiếu trong bảo vệ tế bào khỏi sự
tổn thương
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Alam J, et al (2004) Regulation of heme oxygenase-1 gene
transcription: recent advances and highlights from the
International Conference (Uppsala, 2003) on Heme
Oxygenase Antioxid Redox Signal 6(5): 924-33
2 Arthur DM, et al (2012) Urinary excretion of bilirubin
oxidative metabolites in arsenite-treated mice J Toxicol Sci
37(3): 655-61
3 Baranano DE and Snyder SH (2001) Neural roles for heme
oxygenase: contrasts to nitric oxide synthase Proc Natl Acad
Sci U S A 98(20): 10996-1002
4 Chiabrando D, et al (2012) The mitochondrial heme exporter
FLVCR1b mediates erythroid differentiation J Clin Invest
122(12): 4569-79
5 Crooks DR, et al (2010) Posttranslational stability of the heme biosynthetic enzyme ferrochelatase is dependent on iron availability and intact iron-sulfur cluster assembly machinery
Blood 115(4): 860-9
6 Dolinay T, Choi AM, and Ryter SW (2012) Heme Oxygenase-1/CO as protective mediators in cigarette smoke- induced lung
cell injury and chronic obstructive pulmonary disease Curr
Pharm Biotechnol 13(6): 769-76
7 Erlinger S, Arias IM, and Dhumeaux D (2014) Inherited disorders of bilirubin transport and conjugation: new insights
Gastroenterology 146(7): 1625-38
8 Feng D and Lazar MA (2012) Clocks, metabolism, and the
epigenome Mol Cell 47(2): 158-67
9 Gentile S, Persico M, and Tiribelli C (1990) Abnormal hepatic uptake of low doses of sulfobromophthalein in Gilbert's syndrome: the role of reduced affinity of the plasma
membrane carrier of organic anions Hepatology 12(2): 213-7
10 Gozzelino R, Jeney V, and Soares MP (2010) Mechanisms of
cell protection by heme oxygenase-1 Annu Rev Pharmacol
Toxicol 50: 323-54
11 Grandchamp B, et al (1981) Formation and disposition of newly synthesized heme in adult rat hepatocytes in primary
culture J Biol Chem 256(22): 11677-83
12 Hori R, et al (2002) Gene transfection of H25A mutant heme oxygenase-1 protects cells against hydroperoxide-induced
cytotoxicity J Biol Chem 277(12): 10712-8
13 Hull TD, Agarwal A, and George JF (2014) The mononuclear phagocyte system in homeostasis and disease: a role for heme
oxygenase-1 Antioxid Redox Signal 20(11): 1770-88
14 Igarashi K and Watanabe-Matsui M (2014) Wearing red for signaling: the heme-bach axis in heme metabolism, oxidative
stress response and iron immunology Tohoku J Exp Med
232(4): 229-53
15 Itoh R, et al (2013) Imaging of heme/hemeproteins in nucleus
of the living cells expressing heme-binding nuclear receptors
FEBS Lett 587(14): 2131-6
16 Kim YS and Dore S (2005) Catalytically inactive heme
oxygenase-2 mutant is cytoprotective Free Radic Biol Med
39(4): 558-64
17 Kovtunovych G, et al (2010) Dysfunction of the heme recycling system in heme oxygenase 1-deficient mice: effects
on macrophage viability and tissue iron distribution Blood
116(26): 6054-62
18 Kumagai A, et al (2013) A bilirubin-inducible fluorescent
protein from eel muscle Cell 153(7): 1602-11
19 Lanceta L, et al (2013) Haem oxygenase-1 overexpression
alters intracellular iron distribution Biochem J 449(1): 189-94
20 Lodola A and Jones OT (1978) Evidence for a rapidly turned
over pool of haem in isolated hepatocytes FEBS Lett 90(2):
250-4
21 London IM, et al (1950) On the origin of bile pigment in
normal man J Biol Chem 184(1): 351-8
Trang 1022 Maines MD (2007) Biliverdin reductase: PKC interaction at
the cross-talk of MAPK and PI3K signaling pathways
Antioxid Redox Signal 9(12): 2187-95
23 Martin JF, et al (1976) Abnormal hepatic transport of
indocyanine green in Gilbert's syndrome Gastroenterology
70(3): 385-91
24 McDonagh AF, Palma LA, and Lightner DA (1980) Blue light
and bilirubin excretion Science 208(4440): 145-51
25 Ohgari Y et al (2011) Roles of porphyrin and iron
metabolisms in the delta-aminolevulinic acid (ALA)-induced
accumulation of protoporphyrin and photodamage of tumor
cells Photochem Photobiol 87(5): 1138-45
26 Origassa CS and Camara NO (2013) Cytoprotective role of
heme oxygenase-1 and heme degradation derived end
products in liver injury World J Hepatol 5(10): 541-9
27 Paul S et al (1997) ATP-dependent uptake of natural product
cytotoxic drugs by membrane vesicles establishes MRP as a
broad specificity transporter Proc Natl Acad Sci U S A 94(26):
14976
28 Qaisiya M, et al (2014) Bilirubin mediated oxidative stress
involves antioxidant response activation via Nrf2 pathway
Cell Signal 26(3): 512-20
29 Sakaino M et al (2009) Dual mitochondrial localization and
different roles of the reversible reaction of mammalian
ferrochelatase FEBS J 276(19): 5559-70
30 Sassa S (1990) Regulation of the genes for heme pathway
enzymes in erythroid and in non-erythroid cells Int J Cell
Cloning 8(1): 10-26
31 Sawamoto M et al (2013) The p53-dependent expression of
frataxin controls 5-aminolevulinic acid-induced accumulation
of protoporphyrin IX and photo-damage in cancerous cells
Photochem Photobiol 89(1): 163-72
32 Schwartz S et al (1971) Erythropoietic defects in
protoporphyria: a study of factors involved in labelling of
porphyrins and bile pigments from ALA- 3 H and glycine- 14
C J Lab Clin Med 78(3): 411-34
33 Sheftel AD, Kim SF and Ponka P (2007) Non-heme induction
of heme oxygenase-1 does not alter cellular iron metabolism J
Biol Chem 282(14): 10480-6
34 Simon T, Anegon I and Blancou P (2011) Heme oxygenase and carbon monoxide as an immunotherapeutic approach in
transplantation and cancer Immunotherapy 3(4 Suppl): 15-8
35 Sticova E and Jirsa M (2013) New insights in bilirubin
metabolism and their clinical implications World J
Gastroenterol 19(38): 6398-407
36 Taketani S (2005) Aquisition, mobilization and utilization of cellular iron and heme: endless findings and growing
evidence of tight regulation Tohoku J Exp Med 205(4):
297-318
37 Taketani S et al (1989) The human 32-kDa stress protein induced by exposure to arsenite and cadmium ions is heme
oxygenase FEBS Lett 245(1-2): 173-6
38 Taketani S et al (1990) Induction in mouse peritoneal macrophages of 34 kDa stress protein and heme oxygenase by
sulfhydryl-reactive agents J Biochem 108(1): 28-32
39 Wang X et al (2008) Cytoprotection of human endothelial cells from menadione cytotoxicity by caffeic acid phenethyl
ester: the role of heme oxygenase-1 Eur J Pharmacol 591(1-3):
28-35
40 Wegiel B et al (2011) Biliverdin inhibits Toll-like receptor-4 (TLR4) expression through nitric oxide-dependent nuclear
translocation of biliverdin reductase Proc Natl Acad Sci U S A
108(46): 18849-54
Ngày nhận bài báo: 03/08/2016 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 10/08/2016 Ngày bài báo được đăng: 05/10/2016