Bài viết xây dựng và thẩm định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng nifedipin trong mẫu đánh giá tương tác dược chất - tá dược.
Trang 1NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG NIFEDIPIN TRONG MẪU ĐÁNH GIÁ TƯƠNG TÁC
DƯỢC CHẤT - TÁ DƯỢC BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Trần Quang Trung 1 ; Nguyễn Thanh Hải 2 ; Trịnh Văn Lẩu 3 ; Trương Ngọc Hiển 1
TÓM TẮT
Mục tiêu: xây dựng và thẩm định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng
nifedipin trong mẫu đánh giá tương tác dược chất - tá dược Phương pháp: khảo sát các điều
kiện sắc ký: detector PDA, bước sóng phân tích, cột sắc ký và thành phần pha động, tỷ lệ pha
động Thẩm định tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ chính
xác trung gian, độ đúng, khoảng xác định, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Kết quả:
xác định được các điều kiện sắc ký như: bước sóng, cột, pha động Phương pháp được thẩm
định và đạt các tiêu chí theo quy định Kết luận: đã xây dựng được phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao để định lượng nifedipin trong mẫu đánh giá tương tác dược chất - tá dược,
làm cơ sở cho các nghiên cứu tiền công thức của dạng thuốc chứa nifedipin
* Từ khóa: Nifedipin; Sắc ký lỏng hiệu năng cao; Tương tác thuốc - tá dược
ĐẶT VẤN ĐỀ
Nifedipin là thuốc chẹn kênh canxi thuộc
nhóm dihydropyridin, được sử dụng rộng
rãi trong điều trị chứng đau thắt ngực,
tăng huyết áp và các rối loạn về mạch
máu khác [2, 3] Tuy nhiên, hoạt chất
nifedipin tương đối kém ổn định [4] và có
thể tương tác làm giảm hàm lượng khi
phối hợp với các tá dược trong bào chế
viên nén Vì vậy, để góp phần nghiên cứu
xác định tương tác giữa dược chất nifedipin
và các tá dược nhằm lựa chọn ra tá dược phù hợp cho quá trình khảo sát xây dựng công thức viên nén nifedipin giải phóng kéo dài theo cơ chế bơm thẩm thấu kéo-đẩy, chúng tôi tiến hành xây dựng
và thẩm định phương pháp định lượng nifedipin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trong các mẫu đánh giá tương tác dược chất - tá dược được tạo ra bằng cách phối hợp nifedipin với các tá dược dự kiến sử dụng
1 Học viện Quân y
2 Đại học Quốc Gia Hà Nội
3 Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương
Người phản hồi (Corresponding): Trần Quang Trung (tqt201316@gmail.com)
Ngày nhận bài: 05/10/2019; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 11/11/2019
Ngày bài báo được đăng: 21/11/2019
Trang 2NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1 Nguyên liệu và thiết bị
* Nguyên liệu, hóa chất:
- Nifedipin chuẩn: hàm lượng 99,82%
(Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương
cung cấp)
- Nifedipin được Công ty Baoji Guokang
Bio-Technology Co., Ltd (Trung Quốc)
cung cấp (đạt tiêu chuẩn USP 38)
- Các loại PEO: N10, N80, N750, 301,
303, Coagulant được Công ty Colorcon
Asia Pacific Pte., Ltd cung cấp
- Lactose monohydrat, natri clorid,
magnesi stearat, PVP K30, oxýt sắt đỏ có
nguồn gốc từ Trung Quốc và đều đạt tiêu
chuẩn USP 38
- Acetonitril, methanol đạt tiêu chuẩn
HPLC
- Các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn cho
HPLC hoặc tinh khiết phân tích
* Thiết bị:
Hệ thống HPLC Alliance Waters 2695D;
detector 2998 dual α Absorbance (Mỹ);
cột Phenomenex LUNA, Xbridge (RP-C18,
5 µm, 250 x 4,6 mm); máy quang phổ
EMC-61PC-UV Spectrophotometer,
Emclab (Đức); máy đo pH Mettler Toledo
(Thụy Sỹ); cân phân tích Mettler Toledo
có độ chính xác 0,1 mg (Thụy Sỹ) và các
dụng cụ thí nghiệm khác đạt tiêu chuẩn
phân tích
2 Phương pháp nghiên cứu
* Xây dựng phương pháp:
- Pha các dung dịch chuẩn:
+ Dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác
50,0 mg nifedipin chuẩn cho vào bình
định mức 100 ml Thêm khoảng 70 ml
pha động methanol/nước (65/35), lắc siêu
âm cho tan hoàn toàn trong 30 phút, để nguội ở nhiệt độ phòng, sau đó thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều thu được dung dịch chuẩn gốc 500 µg/ml
+ Dung dịch chuẩn: lấy chính xác 3 ml dung dịch chuẩn gốc 500 µg/ml cho vào bình định mức 10 ml, thêm pha động vừa
đủ đến vạch, lắc đều để được dung dịch chuẩn có nồng độ nifedipin khoảng 150 µg/ml Lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký
- Pha mẫu thử: cân chính xác một lượng hỗn hợp bột của nifedipin và tá dược (theo tỷ lệ 1/1) tương đương với khoảng 50,0 mg nifedipin cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 70 ml pha động methanol/nước (65/35), lắc siêu âm trong 30 phút, để nguội ở nhiệt độ phòng, sau đó thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều Lấy một thể tích khoảng 10 ml dung dịch trong bình định mức, đem ly tâm 4.000 vòng/phút trong 20 phút Lấy chính xác 3 ml dung dịch đã ly tâm, cho vào bình định mức 10 ml và thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký
- Điều kiện sắc ký:
Sử dụng dung dịch chuẩn nifedipin nồng độ 150 µg/ml để khảo sát Quét phổ hấp thụ của dung dịch trên trong khoảng
200 - 500 nm để tìm bước sóng hấp thụ cực đại Khảo sát các điều kiện sắc ký khác nhau như: pha tĩnh: cột silica gel pha đảo C18 Phenomenex LUNA, Xbridge; pha động: hỗn hợp các dung môi MeOH, ACN, H2O với tỷ lệ khác nhau Duy trì tốc độ
Trang 3dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 25 µl
Xác định điều kiện sắc ký cho píc đạt độ
đối xứng tốt, tỷ lệ diện tích píc trên nồng độ
và chiều cao píc trên nồng độ lớn nhất
* Thẩm định phương pháp định lượng
nifedipin trong mẫu đánh giá tương tác
dược chất - tá dược:
Phương pháp được đánh giá theo hướng dẫn của ICH và thông tư 32/2018 của Bộ Y tế [1, 5], dựa trên khảo sát các chỉ tiêu sau: độ đặc hiệu, độ tương thích
hệ thống, tuyến tính, độ lặp lại, độ chính xác trung gian, độ đúng, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1 Xây dựng phương pháp định lượng nifedipin trong mẫu đánh giá tương tác dược chất - tá dược
* Bước sóng phân tích:
Để xác định bước sóng thích hợp phân tích nifedipin, tiến hành ghi phổ UV của mẫu nifedipin chuẩn 150 µg/ml trên máy quang phổ EMC-61PC-UV Spectrophotometer, Emclab
Quét phổ tử ngoại của dung dịch này với bước sóng 200 - 500 nm, cuvet thạch anh dày 1 cm Mẫu trắng là hỗn hợp dung môi pha động methanol/nước (65/35)
Phổ đồ UV-Vis cho thấy cực đại hấp thụ của nifedipin là 237,2 nm và 370 nm Từ đó,
chọn bước sóng 237 nm để khảo sát phương pháp định lượng nifedipin bằng HPLC
* Khảo sát hiệu lực cột phân tích:
Tiến hành phân tích mẫu trên 2 loại cột silica gel pha đảo, phenomenex LUNA
và Xbridge
Trang 4Bảng 1: Kết quả khảo sát hiệu lực cột
Kết quả
Hệ số bất đối xứng (AF) Số đĩa lý thuyết (N) Thời gian lưu (phút)
Dựa vào kết quả về hệ số bất đối xứng, số đĩa lý thuyết, thời gian lưu và sắc ký đồ nhận thấy cả 2 cột đều cho píc không bị kéo đuôi, AF nằm trong giới hạn cho phép (0,8 ≤ AF ≤ 1,5), tuy nhiên cột Phenomenex LUNA cho số đĩa lý thuyết nhỏ hơn, nhưng thời gian lưu ngắn hơn nhiều so với cột Xbridge (13,108 phút), nên lựa chọn cột Phenomenex LUNA cho phân tích định lượng nifedipin
* Khảo sát thành phần pha động:
Dựa trên tài liệu tham khảo và các hóa chất dung môi sẵn có trong phòng thí nghiệm, tiến hành khảo sát 3 hệ pha động khác nhau gồm:
- Hệ 1: MeOH:nước (65/35, v/v)
- Hệ 2: ACN:nước (65/35, v/v)
- Hệ 3: ACN:methanol:nước (25/25/50, v/v)
Trang 5Bảng 2: Kết quả khảo sát thành phần pha động
Trang 6Hệ dung môi ACN:nước (65/35, v/v) cho píc không cân đối bằng 2 hệ dung môi còn lại với AF = 1,261, đường nền không ổn định bằng hệ MeOH:nước (65/35, v/v) Hệ dung môi ACN:MeOH:nước (25/25/50, v/v) cho píc gọn, nhưng thời gian lưu quá ngắn (1,050 phút), không đảm bảo cho quá trình tách Trong khi đó, hệ dung môi MeOH: nước (65/35, v/v) cho đường nền ổn định, píc cân xứng, sắc nét với AF = 1,126, khả năng tách tốt
* Khảo sát tỷ lệ pha động:
Tiến hành khảo sát tỷ lệ thành phần pha động MeOH:nước ở các tỷ lệ: 50/50, 65/35, 60/40, 70/30, 80/20
MeOH:nước (v/v) Thời gian lưu (phút) Diện tích píc (µV.s) Hệ số bất đối xứng (AF)
Trang 7Hình 9: Sắc ký đồ mẫu chuẩn nifedipin với tỷ lệ dung môi MeOH:nước (60:40, v/v)
Từ kết quả khảo sát nhận thấy tỷ lệ dung môi MeOH:nước (v/v) là 65:35 cho thời gian
lưu phù hợp, píc gọn, cân đối
Kết quả: lựa chọn hệ dung môi MeOH:nước với tỷ lệ 65:35 (v/v) để phân tích định lượng nifedipin
Trang 82 Thẩm định phương pháp định lượng nifedipin trong mẫu đánh giá tương tác dược chất - tá dược
* Tính tương thích hệ thống:
Tiêm 6 lần mẫu nifedipin chuẩn 150 µg/ml vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn
(phút)
Diện tích píc (µV.s)
Hệ số bất đối xứng (AF)
Số đĩa lý thuyết (N)
Hệ thống HPLC hoạt động ổn định, có độ lặp lại tốt Giá trị RSD (%) của thời gian lưu, diện tích píc, hệ số bất đối xứng píc và số đĩa lý thuyết của nifedipin đều < 2,0%
* Tính đặc hiệu:
Nguyên tắc: chuẩn bị 3 mẫu: mẫu trắng (hỗn hợp bột tá dược), mẫu chuẩn, mẫu thử
Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký với các điều kiện đã lựa chọn
Trang 9Hình 13: Sắc ký đồ mẫu nifedipin chuẩn nồng độ 150 µg/ml
Píc mẫu chuẩn cân đối, sắc nét, có thời gian lưu 8,874 phút Trên sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện píc trong khoảng thời gian 8 - 10 phút Sắc ký đồ của mẫu thử
và mẫu chuẩn đều có một píc ở thời gian lưu xấp xỉ 8,8 phút Từ đó đưa ra kết luận phương pháp có tính đặc hiệu cao
* Khoảng tuyến tính:
Pha các mẫu nifedipin chuẩn, nồng độ từ 30 - 240 µg/ml, mỗi nồng độ phân tích 3 lần,
từ diện tích píc thu được, xây dựng sự phụ thuộc của diện tích píc với nồng độ nifedipin
Mẫu Nồng độ (µ
Nồng độ (µµg/ml) Diện tích píc (µV.s)
Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 83930x - 284700
Trang 10Kết quả khảo sát cho thấy giá trị r = 1 chứng tỏ trong khoảng nồng độ đã khảo sát
có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ nifedipin với diện tích píc thu được Khoảng tuyến tính này phù hợp để định lượng nifedipin trong mẫu đánh giá tương tác dược chất - tá dược
* Độ chính xác:
- Độ lặp lại:
Tiêm 6 mẫu thử được chuẩn bị theo quy trình và tiêm vào hệ thống HPLC (do kiểm nghiệm viên một làm) Tính hàm lượng bằng phương pháp so sánh với chuẩn và xác định độ lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa các giá trị của những lần định lượng
Với các điều kiện sắc ký đã chọn, độ lặp lại kết quả định lượng trong ngày phân tích cho RSD đạt 0,53% nhỏ hơn 2% Như vậy, phương pháp đã chọn đảm bảo độ chính xác
- Độ chính xác trung gian:
Tiêm 6 mẫu thử được chuẩn bị (do một kiểm nghiệm viên khác thực hiện) (kiểm nghiệm viên hai) theo quy trình và tiêm vào hệ thống HPLC Xác định độ chính xác bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa các giá trị của những lần định lượng
Với các điều kiện sắc ký đã chọn, độ lặp lại kết quả định lượng do từng kiểm nghiệm viên phân tích cho RSD đạt 0,24% và 0,53% nhỏ hơn 2% và do cả hai kiểm nghiệm viên là 0,3% nhỏ hơn 3% Như vậy, phương pháp đã chọn đảm bảo độ chính xác
Trang 11* Độ đúng:
Xác định tỷ lệ thu hồi (%) bằng cách tính toán lượng chất chuẩn của chất cần phân phân tích thêm vào mẫu giả dược Lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với 3 mức nồng độ (80%, 100%, 120%) Tại mỗi mức nồng độ, tiến hành 3 mẫu độc lập trong cùng điều kiện khảo sát
Mức
nồng độ thêm vào (mg) Lượng chuẩn S píc thêm chuẩn (µV.s) Lượng tìm lại được (mg) thu hồi (%) Tỷ lệ Kết quả
80%
Trung bình = 99,2 RSD = 0,36%
100%
Trung bình = 98,84 RSD = 0,38%
120%
Trung bình = 99,68 RSD = 0,59%
Lượng chất chuẩn thu hồi ở mỗi mức nồng độ khác nhau đều nằm trong khoảng
98 - 102% so với lượng chất chuẩn thêm vào, với RSD của tỷ lệ thu hồi ở mỗi mức nồng độ < 2%, chứng tỏ phương pháp sử dụng có độ đúng cao
* Khoảng xác định:
Kết quả độ đúng cho thấy tại nồng độ
nifedipin bằng 80 - 120% so với nồng độ
định lượng có độ đúng và độ lặp lại tốt
Như vậy, khoảng xác định của phương
pháp trong giới hạn 120 - 180 µg/ml
* Giới hạn phát hiện và giới hạn định
lượng:
Bằng phương pháp dựa vào tỷ số giữa
tín hiệu (S) và nhiễu (N) đã xác định được
giới hạn phát hiện của phương pháp
LOD = 0,0375 µg/ml và giới hạn định lượng
của phương pháp LOQ = 0,105 µg/ml
KẾT LUẬN
Đã xây dựng được phương pháp định lượng nifedipin trong mẫu đánh giá tương tác dược chất - tá dược bằng phương pháp HPLC ở những điều kiện sau: hệ thống HPLC Alliance Waters 2695D, cột Phenomenex LUNA (RP-C18,
5 µm, 100A0, 250 x 4,6 mm); detector: PDA 237 nm; pha động: MeOH:nước,
tỷ lệ 65/35, v/v; thể tích tiêm 25 µl; tốc độ dòng 1 ml/phút; nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng
Trang 12Phương pháp đã được thẩm định trên
các chỉ tiêu và đáp ứng yêu cầu của một
phương pháp phân tích theo quy định của
ICH và thông tư 32/2018 của Bộ Y tế
Phương pháp này có thể áp dụng để định
lượng nifedipin trong mẫu đánh giá tương
tác dược chất - tá dược
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Thông tư 32/2018/TT-BYT Quy định việc
đăng ký lưu hành thuốc, nguyên liệu làm thuốc
2 Uday Y.A et al. Estimation of nifedipine
by reverse phase high performance liquid chromatography tablet dosage form IJPLS
2011, pp.610-612
3 Sweetman S.C et al. Martindale Pharmaceutical Press 2014, pp.1447-1455
4 Klaus Florey et al Analytical profiles of drug substances Academic Press InC 1989, Vol 18, pp.245-253
5 ICH Harmonised Tripartite Guideline Guidelines for validation of analytical procedures: Q2 (R1) Text and Methodology 2005