Ứng dụng các tiến bộ sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh lý di truyền hồng cầu

Thalassemia là bệnh lý di truyền hồng cầu do bất thường về số lượng hoặc chất lượng của α hay β globin. Tuy nhiên, ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong tầm soát, chẩn đoán các đột biến thalassemia chưa được phổ biến rộng rãi ở Việt Nam.

ỨNG DỤNG CÁC TIẾN BỘ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH LÝ DI TRUYỀN HỒNG CẦU

Huỳnh Minh Tuấn*, Trần Công Toại*

TÓM TẮT

Đặt vấn đề: Thalassemia là bệnh lý di truyền hồng cầu do bất thường về số lượng hoặc chất lượng của

α hay β globin Tuy nhiên, ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong tầm soát, chẩn đoán các đột biến

thalassemia chưa được phổ biến rộng rãi ở Việt Nam

Phương pháp: Chẩn đoán các bệnh lý thalassemia trên bệnh nhân thiếu máu nhược sắc hồng cầu nhỏ sau

khi loại trừ các nguyên nhân gây thiếu máu thường gặp khác bằng nhiều loại kỹ thuật sinh học phân tử như Gap-PCR, Reverse-Dot Blot Assay, QMPSF, MLPA, Array-CGH, giải trình tự, PCR với enzyme giới hạn để xác định nhiều loại đột biến khác nhau của hemoglobin

Kết quả: 80% bệnh nhân mang đột biến thalassemia được chẩn đoán do áp dụng các bước sàng lọc sinh học

phân tử kết hợp với điện di hemoglobin như HbH, HbE/HbE, β-thalassemia/α-triplication, αCs/αCs Dựa trên kết quả điện di hemoglobin, tỷ lệ HbA 2 hay HbF cao là một thông số giúp hướng chẩn đoán α/β thalassemia

Kết luận: Chẩn đoán sinh học phân tử có vai trò thiết yếu trong việc tầm soát nhiều loại đột biến khác nhau

của các gen globin, giúp nâng cao hiệu quả sàng lọc các bệnh lý phức tạp về di truyền hồng cầu

Từ khóa: Thalassemia, α và β globin, sinh học phân tử, tương quan kiểu hình-kiểu gen

ABSTRACT

ADVANCES IN MOLECULAR BIOLOGY IN DIAGNOSIS AND MANAGEMENT OF INHERITED

HEMOGLOBIN DISORDERS

Huynh Minh Tuan, Tran Cong Toai

* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No 2 - 2016: 425 - 435

Introduction: Thalassemia is a heterogeneous group of genetic disorders of hemoglobin characterized by

quantitative and/or qualitative defects of α and/or β globin chain synthesis However, the use of molecular diagnostic tools for screening, diagnosis and clinical management of thalassemic hemoglobin variants has not been widely introduced in Viet Nam

Methods: Diagnosis of hemoglobin disorders by molecular approaches in patients with hypochromic

microcytic anemia after excluding other common causes of chronic anemia All patients were screened by various molecular techniques including Gap-PCR, Reverse-Dot Blot Assay, QMPSF, MLPA, Array-CGH, Sequencing techniques, Digestion-PCR in order to characterize hemoglobin variants at different molecular levels

Results: Approximately 80% patients carrying various common hemoglobinopathies were diagnosed by

applying the molecular diagnostic procedure in combination with hemoglobin electrophoresis such as HbH, HbE/HbE, β-thalassemia/α-triplication, αCs/αCs High HbA 2 or HbF level is a good indicator of β thalassemia

on hemoglobin electrophoresis but a normal level can not exclude the disease while α-thalassemia has frequently

a variable level of HbA 2 depending on the number of intact α-globin gene

Conclusion: Molecular diagnostic approaches play a key role in diagnosis and screening of different types

of hemoglobin variants, improving the diagnostic yield of complex hemoglobin disorders

* Bộ Môn Mô, Phôi, Di Truyền.Trường Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch

Keywords: Thalassemia, α/β globin, molecular diagnostic approaches, genotype-phenotype correlation

GIỚI THIỆU TỔNG QUAN

Bệnh lý di truyền hồng cầu bao gồm

những bệnh lý liên quan đến sự hình thành,

phát triển và duy trì chức năng của dòng tế

bào hồng cầu Bệnh lý di truyền hồng cầu

được phân loại thành 3 nhóm bệnh lý chính

thường gặp nhất bao gồm: bất thường sinh

tổng hợp hemoglobin, bệnh lý men của hồng

cầu và bệnh lý màng hồng cầu Bệnh lý di

truyền hồng cầu do bất thường trong quá

trình sản xuất hemoglobin hay bệnh thiếu

máu vùng biển (thalassemia), phổ biến ở

vùng Đông Nam Á, Ấn Độ và Địa Trung

Hải(12) Việt Nam là một nước nằm trong vùng

dịch tễ sốt rét và có tần suất cao tỷ lệ bệnh

nhân mang bệnh lý thiếu máu vùng biển

Bệnh thiếu máu vùng biển do sự mất cân

bằng trong sự tổng hợp các chuỗi α và β

globin, do đột biến trên các gen α và β globin

Đột biến gen alpha gây bệnh lý alpha

thalassemia (α-thalassemia) và đột biến gen

bêta gây bệnh lý bêta thalassemia

(β-thalassemia)

Alpha thalassemia do đột biến gen HBA1 và

HBA2 mã hóa cho sự tổng hợp α-globin HBA1

và HBA2 nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số

16, trong vùng 16p13.3 Gen HBA1 và HBA2 đều

mang 3 exon và mã hóa cho protein chứa 142

acid amin, HBA1 và HBA2 có kích thước lần

lượt là 872, 864 pb và có chung nguồn gốc trong

quá trình tiến hóa HBA2 được xem là bản sao

của HBA1 vì 97% trình tự chuỗi nucleotide của

gen HBA2 tương đồng với gen HBA1 Các đột

biến thường gặp trong bệnh lý α-thalassemia

bao gồm α-3.7, α-4.2 và α-SEA (Southeast Asian type)

được tạo rado quá trình trao đổi đoạn chéo

không cân bằng hay NAHR (Non Allelic

Homologous Recombination) Các đột biến này

thường gặp tại khu vực Đông Nam Á trong đó

đột biến α-SEA là một dạng đột biến vi mất đoạn

tại vùng 16p13.3 và gây mất cả 2 gen HBA1 và

HBA2 Đa số các đột biến xảy ra tại locus alpha

là các đột biến vi mất đoạn và nhân đoạn tuy nhiên đột biến điểm vẫn xảy ra tại locus alpha

và thường gặp nhất là Hemoglobin Constant Spring (HbCs hay αCs)(24,34)

Bệnh lý β-thalassemia do đột biến gen β

(HBB) trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể 11, phân

vùng 11p15.4, HBB bao gồm 3 exon, nằm trải

dài trên 1,6 kb nhiễm sắc thể 11 và mã hóa cho chuỗi β-globin 147 acid amine với trọng lượng

phân tử 16 KDa Các đột biến ở gen HBB gây

nhiều dạng kiểu hình khác nhau, từ thiếu máu nhược sắc hồng cầu nhỏ đến bệnh lý tán huyết mạn tính ảnh hưởng đến sự phát triển, ứ đọng sắt, gan lách to, bất thường hình thái học như bệnh lý Cooley Các đột biến thường gặp nhất trong bệnh lý β -thalassemia là βS, βC, βE trong

đó βE phổ biến tại vùng Đông Nam Á bao gồm Việt Nam, Lào và Campuchia(26,9) Các đột biến thường gặp khác bao gồm β39, βTak, HBB:c.-79A>G, HBB:c.92G>A, HBB:c.92+1G>A, βD-Punjab,

gặp ở Việt Nam codon 41/42 (-TCTT), codon 17 (A→T), -28 (A→G), codon 71/72 (+A), IVSII-nt654 (C→T), IVSI-nt1 (G→T), codon 95 (+A)

(Saovaros Svasti et al., 2002) Sự đa dạng về kiểu

hình của bệnh lý β-thalassemia là do sự tác động của các yếu tố sau như: sự đa dạng của nhiều loại đột biến gen bêta khác nhau (β+, β0

hay MetHb ), sự tác động của các yếu tố biến đổi về di truyền (genetic modifying factors) và yếu tố môi trường Sự tương tác của các yếu tố trên gây nhiều trở ngại cho việc phân tích mối tương quan kiểu gen-kiểu hình và công tác tham vấn di truyền nhất là trong lĩnh vực chẩn đoán tiền sản Chính vì những lý do nêu trên,

sự phát triển của nhiều loại kỹ thuật chẩn đoán phân tử chuyên biệt kết hợp với dữ kiện lâm sàng, các xét nghiệm chuyên biệt về bệnh lý hồng cầu như các kỹ thuật điện di hemoglobin giúp đưa ra chẩn đoán xác định và thiết lập tương quan kiểu gen-kiểu hình khi mà một kỹ thuật phân tử đơn thuần không thể thực hiện được Hiện nay, nhiều phương pháp chẩn đoán

sinh học phân tử đang được ứng dụng trong các

phòng xét nghiệm di truyền bao gồm:

Gap-PCR, MLPA, PCR với enzyme giới hạn,

Array-CGH, giải trình tự và QMPSF giúp chẩn đoán

nhiều loại bệnh lý di truyền hồng cầu tuy nhiên

ứng dụng các kỹ thuật chẩn đoán này chưa

được phổ biến tại Việt Nam

Phương pháp và tiêu chuẩn sàng lọc

phân tử

Bệnh nhân thiếu máu nhược sắc hồng cầu

nhỏ được tiến hành sàng lọc đột biến bằng các

kỹ thuật phân tử khác nhau dựa trên các triệu

chứng lâm sàng, các xét nghiệm thường quy và

chuyên biệt bao gồm công thức máu và kết quả

điện di hemoglobin 95% bệnh nhân có dấu hiệu

thiếu máu nhược sắc hồng cầu nhỏ trên công

thức máu thường quy không rõ nguyên nhân

lâm sàng có chỉ định tiến hành xét nghiệm sàng

lọc sinh học phân tử Các xét nghiệm sàng lọc

phân tử được phân làm hai loại chính: xét

nghiệm sàng lọc đột biến α-thalassemia và các

xét nghiệm sàng lọc phân tử β-thalassemia

Các kỹ thuật chẩn đoán phân tử các bệnh

lý thalassemia

Kỹ thuật Gap-PCR

Đơn giản, dễ thực hiện, chi phí thấp và phù

hợp trong điều kiện thực tế hiện nay tại Việt

Nam Kỹ thuật này cho phép phát hiện các đột

biến α-thalassemia bao gồm: α-3.7, α-4.2, α-SEA và

αααanti-3.7 qua việc sử dụng 3 cặp mồi cần thiết

cho sự khuếch đại gen HBA1 và HBA2

Sản phẩm khuếch đại của gen HBA1 và

HBA2 lần lượt là 2.1 kb và 1.9 kb Đột biến α-3.7

cho kích thước gần giống α2 trong mix α1 là 1,9

kb, đột biến α-4.2 cho kích thước 1,6 kb, α-SEA cho

kích thước 1,3 kb và αααanti-3.7 có kích thước 2,1

kb trong mix α2 Nhược điểm của kỹ thuật

Gap-PCR là độ đặc hiệu thấp và dương tính giả, do

đó cần sự hỗ trợ của một kỹ thuật chẩn đoán

phân tử khác Kỹ thuật này không phát hiện

được αααanti-4.2

Kỹ thuật RDBα (α Reverse Dot-Blot Assay)

Kỹ thuật dùng để phát hiện 21 đột biến

thường gặp trên gen HBA1 và HBA2 bao gồm

α-3.7, α-4.2, α-SEA, αααanti-3.7, MED, FIL, α-THAI, α-20,5 kb, α1 cd 14 (TGG>TAG), α1 cd

59 (GGC>GAC) (Hb Adana), α2 init cd (ATG>ACG), α2 cd 19 (-G), α2 IVS1 (-5nt), α2

cd 59 (GGC>GAC), α2 cd 125 (CTG>CCG) (Hb Quong Sze), α2 cd 142 (TAA>CAA) (Hb Constant Spring), α2 cd 142 (TAA>AAA) (Hb Icaria), α2 cd 142 (TAA>TAT) (Hb Paksé), α2 (TAA>TCA) (Hb Koya Dora), α2 poly A-1

(AATAAA-AATGAA)

ADN bệnh nhân sẽ được tiến hành khuếch đại theo 3 mix PCR bao gồm A1, A2

và B Mỗi mix bao gồm hỗn hợp đệm phản ứng, enzyme Taq polymerase và 5µl ADN Sản phẩm khuếch đại PCR sẽ được điện di trên gel agarose 2% để kiểm tra trước khi cho tiến hành lai trên teststrip

Ưu điểm của kỹ thuật alpha RDB Assay là

độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tuy nhiên vì độ nhạy cao mà đôi khi cho kết quả dương tính giả Alpha RDB Assay là xét nghiệm nhanh, hiệu quả cao giúp tầm soát nhanh chóng 21 đột biến thường gặp của bệnh lý α-thalassemia Xét nghiệm này thường được sử dụng hỗ trợ cho kỹ thuật Gap-PCR

MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification)

Kỹ thuật giúp phát hiện các đột biến vi mất

và nhân đoạn, phổ biến nhất hiện nay là các bộ kit MLPA của MRC-Holland ADN bệnh nhân

sẽ được tiến hành cho biến tính và lai với các đoạn dò đặc hiệu, mỗi vùng ADN lai tạo thông thường với hai đoạn dò và một trong hai đoạn

dò có chứa đoạn Stuffer, là một đoạn ADN đặc hiệu khác nhau cho mỗi đoạn dò Các đoạn ADN biến tính lai với dò sau đó sẽ được gắn kết lại với nhau nhờ enzyme ligase để tạo ADN chuỗi kép, sau cùng ADN chuỗi kép sẽ được khuếch đại bằng phản ứng PCR Các sản phẩm PCR sau đó sẽ chạy trên máy phân tích và tiến

hành tách biệt các sản phẩm PCR có kích thước

khác nhau Ưu điểm của kỹ thuật MLPA là độ

nhạy và đặc hiệu cao nhưng nhược điểm là chi

phí cao, tốn nhiều thời gian để thực hiện kỹ

thuật Kỹ thuật MLPA có thể được dùng kết

hợp với kỹ thuật Gap-PCR và αRDB để hỗ trợ

và/hoặc khẳng định chẩn đoán

Kỹ thuật Array-CGH chuyên biệt cho locus

alpha và bêta

ADN bệnh nhân và chứng sẽ được cho tiến

hành lai tạo và đánh dấu bằng Cya5 và Cya3

ADN đánh dấu sẽ tiến hành tinh lọc và cho lai

trên hệ thống vi lưới ADN đặc hiệu với 13.921

đoạn dò cho locus alpha và bêta Đây là kỹ thuật

dùng để phát hiện các đột biến vi mất đoạn và

nhân đoạn không điển hình tại hai locus này

Nhược điểm của kỹ thuật này là chi phí cao và

đòi hỏi trang thiết bị hiện đại để thực hiện

Phương pháp giải trình tự HBA1 và HBA2

Gen HBA1 và HBA2 có trình tự chuỗi

nucleotide tương tự nhau trên 97% do đó cần

phải sử dụng các đoạn mồi ngược đặc hiệu để

khuếch đại gen HBA1 và HBA2 Giải trình tự

giúp phát hiện các đột biến mà các kỹ thuật nêu

trên bị giới hạn, ví dụ : HbCs, đột biến đuôi

polyA, Hb Adana, Hb Agrinio

Kỹ thuật QMPSF (Quantitative Multiplex

PCR of Short Fragments)

Kỹ thuật QMPSF-β sử dụng nhiều cặp đoạn

mồi khác nhau trong cùng một phản ứng PCR

hay PCR multiplex, các đoạn mồi này được

đánh dấu huỳnh quang ở đầu 5' đoạn mồi xuôi,

phân tử huỳnh quang thường được sử dụng là

5-FAM, NED và HEX cho màu xanh dương,

vàng và xanh lá cây Mỗi cặp đoạn mồi cho sản

phẩm khuếch đại PCR có kích thước khác nhau

và sẽ được tách biệt khi tiến hành điện di mao

quản trên máy giải trình tự ABI PRISM® 3130

Genetic Analyzer (Life Technology) Kỹ thuật

QMPSF dùng để phát hiện các vi đột biến mất

và nhân đoạn ở gen HBB(28)

Kỹ thuật giải trình tự gen β

Gen HBB được chia ra thành 5 đoạn khác

nhau và được khuếch đại bằng 5 phản ứng PCR với tên gọi lần lượt là A, B, C, D, E Mỗi đoạn được khuếch đại bằng một cặp đoạn mồi chuyên biệt Cặp đoạn mồi A được dùng để khuếch đại promotor (vùng gen khởi động), đoạn mồi B dùng để khuếch đại exon 1, đoạn mồi C dùng khuếch đại exon 2, đoạn mồi D dùng khuếch đại exon 3 và sau cùng đoạn mồi

E dùng để khuếch đại vùng 3'UTR

PCR-digestion

Phương pháp sử dụng sản phẩm khuếch đại PCR sau đó tiêu hóa bằng enzyme giới hạn, tùy mỗi loại đột biến mà tạo ra vị trí cắt khác nhau chuyên biệt cho enzyme, từ đó ta lựa chọn enzyme giới hạn phù hợp βS là đột biến thường gặp gây bệnh lý hồng cầu hình liềm hay Sickle cell disease, thường gặp ở chủng tộc da đen và các quốc gia ở Phi châu

Hình 1: Ứng dụng của kỹ thuật PCR-Digestion

trong chẩn đoán tiền sản β S : (M) Marker, (1) Cha mang β S dị hợp tử (2) Mẹ mang β S dị hợp tử (3) và (4) Thai nhi mang β S dị hợp tử (5) Chứng mang β S

dị hợp tử (6) Chứng mang β S đồng hợp tử (7)

Chứng bình thường (8) Chứng mang β S và β C (9) Sản phẩm PCR không xử lý bằng enzyme giới hạn

1 2 3 4 5 6 7 8 9 M

687

bp

435 bp

162

235

bp 202 bp

Một ví dụ điển hình là chẩn đoán đột biến

βS bằng phương pháp enzyme giới hạn qua việc

sử dụng một cặp đoạn mồi khuếch đại chuỗi

trùng hợp (PCR) với sản phẩm sau cùng là 687

bp, sau đó sản phẩm khuếch đại được tiêu hóa

bằng enzyme giới hạn Bsu36I, enzyme này sẽ

cắt ADN ở vị trí 5' CC↓TNAGG 3' Sản phẩm

của allele đột biến βS sẽ cho kích thước là 437 bp

và ngược lại, sản phẩm của allele βA sẽ cho các

sản phẩm 235 bp, 202 bp Đây là kỹ thuật tương

đối đơn giản và dùng để chẩn đoán nhanh các

đột biến thường gặp trên gen HBB như βE, βC,

βD-Punjab, βO-arab Ngoài ra, kỹ thuật này còn được

sử dụng trong góp phần hỗ trợ khẳng định chẩn

đoán với các kỹ thuật khác như giải trình tự và

tầm soát tiền sản các đột biến thường gặp

β-thalassemia

Điện di Hemoglobin

Các phương pháp điện di hemoglobin

thông thường bao gồm : Acide/Alkaline

Electrophoresis, IsoElectric Focusing (IEF),

HPLC (High Pressure Liquid Chromatography)

(Urrechaga, 2012) và CZE (Capillary Zone

Electrophoresis) Acid/Alkaline electrophoresis

dựa trên sự khác biệt về điện tích của các phân

tử hemoglobin, hemoglobin tích điện âm và sẽ

di chuyển về cực dương (Anode) Kỹ thuật IEF

dựa trên sự khác biệt về điện tích của các phân

tử hemoglobin khi tiến hành điện di, phân tử hemoglobin sẽ di chuyển trên thạch agarose trong môi trường PH từ 6 đến 8 và ngừng lại tại

vị trí đẳng điện Hai phương pháp điện di hemoglobin hiện nay đang được sử dụng rộng rãi là HPLC và CZE(14) Cả hai phương pháp HPLC và CZE đều tiến hành điện di hemoglobin dựa trên sự tích điện phân tử, một kết quả điện di hemoglobin bình thường cho kết quả với HbA2 trong khoảng từ 2,1% đến 3,1%, HbF thường dưới 1% và HbA trong khoảng 97% CZE có độ đặc hiệu cao hơn HPLC nhưng

độ nhạy thấp và thường bỏ sót các đột biến hiếm tuy nhiên HPLC không thể phân tách được một số dạng đột biến hemoglobin như HbE và HbA2, HbH và Hb Bart's Do đó, khi tiến hành phân tích kiểu hình các dạng đột biến khác nhau trong điện di hemoglobin, theo khuyến cáo nên sử dụng sự kết hợp nhiều phương pháp tầm soát khác nhau để hỗ trợ chẩn đoán

Kết quả ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử kết hợp điện di hemoglobin trong tầm soát các đột biến thalassemia

Hemoglobin Constant Spring (α Cs )

Hình 2: Kết quả xét nghiệm di truyền: (A) Gap-PCR α1α2 cho kết quả âm tính (B) RDBα cho kết quả HbCs đồng hợp tử và (C) được kiểm chứng lại bằng giải trình tự α2

Bệnh nhân nữ, 21/12/1978, đến khám vì

thiếu máu nhược sắc hồng cầu nhỏ, xét nghiệm

sắt với kết quả định lượng ferritine là 595µg/L

Phết máu ngoại biên cho thấy bất thường tế bào

hồng cầu với nhiều chấm sẫm bắt màu kiềm

(hématies ponctuées), tế bào hồng cầu có nhiều

kích thước khác nhau (anisocytose), sự xuất

hiện của tế bào đẳng sắc (normochromie) và

nhược sắc (anisochromie)

Xét nghiệm điện di hemoglobin với HbA2:

1,7%, HbF: 2,9%, HbA: 91,6% và HbX: 3,8%

Số lượng tế bào hồng cầu: 4,22 x 106/µl, Hb:

10,3g/dl, Hct: 43%, VGM: 80,6fl, TCMH: 24,4pg,

CCMH: 30,3g/dl, IDR: 15,2

Bệnh nhân được tiến hành xét nghiệm di

truyền với Gap-PCR âm tính, αRBD assay và

giải trình tự gen α1α2 cho kết quả Hb Constant

spring (HbCs) đồng hợp tử(16)

Đột biến điểm trên gen HBA1 (Hb Grady)

Bệnh nhi nữ sinh ngày 05/04/2014, bệnh

nhân đến làm xét nghiệm di truyền vì thiếu

máu nhược sắc hồng cầu nhỏ Kết quả điện di

hemoglobin với HbA: 87,2%, HbA2: 1%, HbF

<1%, biến thể HbA2 (HbA2 variant): 0,8%, và

biến thể HbA (HbA variant): 11%

Xét nghiệm sắt với sắt huyết thanh

5,2µmol/l, transferrine: 3,62g/l và giảm

transferrine bão hòa là 6%

Công thức máu: hồng cầu: 5,1x106/µL, Hb:

10,9 g/dl, Hct: 34%, VGM: 66,7fL, TCMH: 21,4

pg, CCMH: 32,1g/dL

Bệnh nhân được tiến hành xét nghiệm di

truyền bao gồm Gap-PCR α1α2, RDBα với kết

quả âm tính tuy nhiên giải trình tự α1α2 cho kết

quả Hb Grady ở trạng thái dị hợp tử

Đột biến vi mất đoạn không điển hình tại

locus α

Bệnh nhi nam, sinh ngày 27/12/2014, nhập

viện vì thiếu máu nhược sắc hồng cầu nhỏ và

bất thường trên điện di hemoglobin

Hình 3: Sơ đồ phả hệ tóm tắt các kết quả xét nghiệm

bao gồm điện di hemoglobin, công thức máu thường quy và một số kết quả di truyền của gia đình bệnh nhân

Bệnh nhân cùng gia đình được tiến hành xét nghiệm di truyền với Gap-PCR α1α2, RDBα

và giải trình tự với kết quả âm tính, tuy nhiên MLPA phát hiện vi mất đoạn locus α

Chẩn đoán HbH do sự kết hợp của đột biến

α SEA và α -3,7

Hình 4: Ứng dụng kỹ thuật Gap-PCR trong chẩn

đoán α-thalassemia: (1) Bệnh nhân mang đột biến

α SEA /α -3,7 (2) Mẹ mang dị hợp tử α -3,7 /αα (3) Cha mang đột biến α SEA /αα (M) Marker kích thước

Bệnh nhi nam, sinh ngày 15/06/2015, nhập

viện vì thiếu máu nhược sắc hồng cầu nhỏ và

điện di hemoglobin cho kết quả HbH 13,1% Xét

nghiệm sắt với kết quả độ bão hòa transferrine

14% giảm và tăng ferritine máu 284µg/L Bệnh

nhân được tiến hành xét nghiệm di truyền (32,42)

β thalassemia kết hợp bất thường của gen α

Bệnh nhân nữ, sinh ngày 26/11/1983, được

chỉ định làm xét nghiệm di truyền do thiếu máu

nhược sắc hồng cầu nhỏ với kết quả công thức

máu như sau Hb: 11,6g/dl, VGM: 57fl, TCMH:

18,3pg, CCMH: 32g/dl, hồng cầu lưới:

113x106/µl Phết máu ngoại biên cho thấy bất

thường về hình dạng (poikilocytose), tế bào nhỏ

(microcytose), tế bào hồng cầu với nhiều chấm

sẫm bắt màu kiềm Điện di hemoglobin cho kết

quả với HbA2: 4.3%, HbF: <1%, HbA: 95,7%

Sinh hóa cho kết quả tán huyết với tăng LDH và

bilan sắt cho kết quả tăng Ferritine: 752 µg/L, độ

bảo hòa của transferrine là 31% Bệnh nhân

được tiến hành làm các xét nghiệm di truyền

với kết quả đột biến IVS-II-nt654 HBB:

c.316-197C>T +/- và triplication αααanti-4.2 Đột biến

c.316-197C>T là một dạng đột biến β+ nặng nhưng thường không cho kiểu hình dưới dạng thể lâm sàng nặng với ứ đọng ferritine cao do

đó có sự mất không tương quan kiểu gen-kiểu hình

Đột biến bất thường gen HBB và hemoglobin

có ái tính cao với oxygen

Bệnh nhân nữ, sinh ngày 17/07/1968 đến khám và chỉ định làm xét nghiệm di truyền do bệnh lý đa hồng cầu với công thức máu như sau hồng cầu: 5,1x106/µl, Hb: 17,0 g/dl, Hct: 49,3%, VGM: 96,9fl, TCMH: 33,3pg, CCMH: 34,5g/dl, điện di hemoglobin HbA2: 2,2%, HbA: 97,8%, HbF: <1% Tiền căn bản thân năm 2011 Hb là 20,2g/dl, Hct là 57,3%, bệnh nhân làm xét

nghiệm JAK2 âm tính và được tiến hành điều trị

bằng cách cho ly trích máu Năm 2012, Hb là 19,7g/dl, Hct là 56,5%, định lượng EPO tăng nhẹ với 20,9mU/ml, khí máu cho kết quả bình

thường Xét nghiệm di truyền gen HBB cho kết quả Hb Sandiego HBB: c.328G>A (codon 109

Val>Met)(13)

β-thalassemia do vi mất đoạn tại locus β kết hợp với đột biến α

Hình 5: (A) Kết quả Gap-PCR cho locus β với

M là marker kích thước:

(1) Bệnh nhân với đột biến HPFH3 (2) Chứng (+)

với đột biến HPFH3 (3) Người lành không mang

đột biến HPFH3 (4) Chứng (-).

B) Kết quả Gap-PCR cho locus α với M là marker kích

thước (1) Con mang ααα anti-3,7 /αα (2) Mẹ mang ααα anti-3,7 /αα (3)Cha bình thường (4) Chứng bình thường

(5) Chứng (+) ααα anti-3,7 /αα.

A

Hình 6: Giải trình tự gen β cho kết quả

HBB:c.92+5G>C ở trạng thái đồng hợp tử

Bệnh nhi nữ, sinh ngày 19/03/2015, nhập

viện và làm xét nghiệm di truyền do thiếu máu

nhược sắc hồng cầu nhỏ Hb: 8,4g/dl, VGM: 64fl,

hồng cầu non là 141.000/mm3 Điện di

hemoglobin với HbA2: 0,8%, HbF: 93,3% và

HbA: 0% Tiền căn bản thân cha mang bất

thường về bệnh lý di truyền hồng cầu IVS-I-5nt

G>C ở trạng thái dị hợp tử Bệnh nhân cùng mẹ

được tiến hành làm xét nghiệm thường quy và

di truyền

Mẹ bệnh nhân có kết quả xét nghiệm công

thức máu thường quy như sau hồng cầu: 5,73

x106/µL, Hb: 14,2g/dl, Hct: 42,5%, VGM:

74,2fL, TCMH: 24,8pg, CCMH: 33,4g/dl, hồng

cầu lưới: 1.6% Bilan sắt như sau Fer: 8,6

µmol/L (9-30.4), Transferrine: 0.48mg/L

(0.5-1.67), Ferritine: 35 µg/L (10-125 µg/L) Điện di

hemoglobin HbA2: 1,8%, HbF: 31% và HbA:

67,2% Phết máu ngoại vi cho thấy hồng cầu

có kích thước nhỏ (microcytosis)

Kết quả xét nghiệm di truyền cho thấy bệnh

nhân mang 2 loại đột biến khác nhau với

IVS-I-5nt G>C hay HBB:c.92+5 G>C di truyền từ cha

và vi mất đoạn locus β từ gen ψβ cho đến vùng

3'β di truyền từ mẹ (HPFH3) Ngoài ra, xét

nghiệm gen α phát hiện bệnh nhân mang

αααanti-3,7/αα di truyền từ mẹ

Bệnh nhân vi mất đoạn không điển hình tại

locus α

Bệnh nhân nữ, sinh ngày 09/11/1975, đến

khám vì mệt mỏi kéo dài và bất thường trên

điện di Hemoglobin với HbH là 12%, công thức

máu với Hb: 12.3g/dl, VGM: 67fl, TCMH: 21pg

Bệnh nhân được tiến hành truyền máu mỗi 6

tuần/lần Ứ đọng sắt tại gan cần điều trị chelateur hexade 250mg/ngày (IRM sắt tại gan 220umol/g) Siêu âm không phát hiện lách to

Mẹ bệnh nhân có công thức máu với Hb : 10g/dl, VGM: 68fl

Hình 7: Kết quả Array-CGH cho thấy vi mất đoạn

16p13.3, mất toàn bộ locus α với kết quả arr(hg19)16p13.3(84,980-250,896)x1 mat, 431 đoạn mồi bị lệch, log 2 ratio =-038

Đột biến β E đồng hợp tử

Bệnh nhân nữ sinh ngày 28/09/1982, nhập viện vì thiếu máu nhược sắc hồng cầu nhỏ và bất thường điện di hemoglobin Công thức máu với hồng cầu: 4.42x106/µl, Hb: 9.6g/dl, Hct: 30,6%, VGM: 69.2fl, TCMH: 21.7pg, CCMH: 31,4g/dl, IDR: 15,6%, hồng cầu lưới: 3.03% Xét nghiệm G6PD với G6PD: 173mU/10.9 hồng cầu (120-240) và điện di hemoglobin HbA: 0%, HbF: 2,6%, HbE: 80% Sinh hóa cho kết quả như sau LDH: 341Ui/ml, bilirubin toàn phần: 8µmol/L, bilirubin kết hợp: 1µmol/l, bilibrubine gián tiếp: 7µmol/l, haptoglobine: 0.3g/l, Fer: 20µmol/l,

transferrine: 3.06g/l, độ bảo hòa của transferrine:

26% và ferritine: 37µg/l

Hình 8: Giải trình tự gen HBB cho kết quả β E đồng

hợp tử Hb E (β26(B8) Glu>Lys, GAG>AAG hay

HBB:c.79G>A) HBB:p.Q26K (Edison ES et al.,

2011; Fucharoen S et al., 2012)

BÀN LUẬN

Bệnh lý hemoglobin là một trong các bệnh

lý di truyền phức tạp liên quan đến các gen α β,

sự tương tác của các đột biến α β gây ra nhiều

loại kiểu hình thalassemia khác nhau, kết quả

của sự mất cân bằng các chuỗi α β trong quá

trình tổng hợp hemoglobin Sự kết hợp của

nhiều loại kỹ thuật chẩn đoán phân tử cho phép

tầm soát các đột biến ở nhiều mức độ phân tử

khác nhau từ các vi mất đoạn locus α β đến các

đột biến điểm khi mà việc ứng dụng một kỹ

thuật riêng lẻ có thể bỏ sót việc tầm soát đột

biến Ngoài ra, sự kết hợp phân tích mối tương

quan giữa kiểu gen-kiểu hình bao gồm công

thức máu, đặc biệt là điện di hemoglobin, phân

tích phả hệ, dữ kiện lâm sàng giúp ích rất lớn

trong định hướng chẩn đoán, thiết lập mối

tương quan dạng đột biến với dạng biểu hiện

kiểu hình để từ đó góp phần hỗ trợ tham vấn di

truyền, chẩn đoán tiền sản và định hướng điều

trị trong các bệnh lý thalassemia thể nặng như

HbH đặc trưng bởi tán huyết mạn tính, kết tụ

chuỗi β globin, ứ đọng sắt thứ phát, rối loạn sản

sinh hồng cầu, gan lách to (7) Người mang βE

thường ít biểu có biểu hiện lâm sàng với thiếu

máu nhẹ và kích thước hồng cầu nhỏ, tuy nhiên

khi đột biến βE kết hợp với đột biến β

thalassemia sẽ cho bệnh cảnh lâm sàng β

thlassemia điển hình từ thể trung bình đến thể

nặng Đột biến αCs ở trạng thái dị đồng hợp tử

thường cho kiểu hình lâm sàng với thiếu máu, ứ

đọng sắt đến truyền máu phụ thuộc Hơn nữa,

sự phát triển của sinh học phân tử ngày càng

mở ra các chiến lược mới trong việc hỗ trợ chẩn đoán và điều trị như sự phát hiện các yếu tố biến đổi di truyền liên quan đến yếu tố nguy cơ, tiên lượng liên quan đến tỷ lệ HbF trong bệnh

lý thalassemia như locus BCL11A, XmnI, các

dạng haplotype khác nhau, bệnh lý Gilbert kết hợp, G6PD (27,37,2) góp phần rất lớn trong tiên lượng, điều trị bệnh lý thalassemia Qua các trường hợp lâm sàng cụ thể nêu trên, bệnh lý thalassemia có thể chẩn đoán đơn thuần bằng

kỹ thuật Gap-PCR như trường hợp 4.4 với HbH

do các đột biến thường gặp như α-3,7 và αSEA, nhưng đối với sự đa dạng về các loại đột biến khác nhau (đột biến hiếm) và nhất là khi đột biến α kết hợp β thì đa số các trường hợp cần kết hợp ít nhất hai kỹ thuật chuyên biệt khác nhau để có kết quả chẩn đoán phân tử (33,11) Các

kỹ thuật RDBα, MLPA, Array-CGH có vai trò quyết định trong hỗ trợ chẩn đoán cho kỹ thuật Gap-PCR, cho phép sự tầm soát đột biến ở nhiều mức độ phân tử khác nhau bao gồm các đột biến thường gặp tại locus α Các kỹ thuật giúp tầm soát các đột biến tại locus β bao gồm QMPSF-β, giải trình tự và Gap-PCR β Tuy nhiên, sự phân tích các dữ kiện lâm sàng, biểu hiện kiểu hình có vai trò rất quan trọng trong hỗ trợ chẩn đoán (ví dụ trường hợp 4.5 trong phần kết quả) Sau cùng, chúng tôi muốn nhấn mạnh vấn đề dịch tể học bệnh lý thalassemia cũng như việc tầm soát các đột biến thường gặp trong dân số nguy cơ Việt Nam bao gồm βE, αCs, αSEA giúp tầm soát người mang dị hợp tử nhằm mục đích ngăn ngừa xuất hiện các thể nặng trong bệnh lý thalassemia như Hydrops fetalis, HbH, HbE/β thalassemia, β0 thể dị hợp tử (11,6) bằng việc phân tích tương quan kiểu gen-kiểu hình nhờ vào sự ứng dụng chặt chẽ các xét nghiệm

thường quy theo mô hình "công thức máu-điện

di hemoglobin-sinh học phân tử"

KẾT LUẬN

Kết hợp nhiều loại kỹ thuật phân tử khác nhau trong tầm soát các dạng đột biến α β có

tầm quan trọng chiến lược giúp nâng cao hiệu

quả và khẳng định chẩn đoán lâm sàng, thiết

lập tương quan kiểu gen-kiểu hình, tham vấn,

tiên lượng, điều trị các bệnh lý thalassemia

phức tạp tại Việt Nam

TÀI LIỆU THAM KHẢO

CK, Alias H, Abdul-Latiff Z, Othman A (2014) A case

to compound heterozygosity for Hb Adana (HBA2: c179G>A

α-thalassemias in Malay families Hemoglobin ;38(4):277-81

Tashfeen S (2015) Frequency of Gγ-globin promoter -158

homozygous/compound heterozygous beta thalassaemia

Hematol Oncol Stem Cell Ther Mar;8(1):10-5

Spring Harb Perspect Med Feb 1;3(2):a011775

The correlation of α-globin gene mutations and the XmnI

polymorphism with clinical severity of Hb E/β-thalassemia

Hemoglobin ;38(5):335-8

(2016) Hb Hope (β136Gly→Asp) and Hb Grady

(α119_120insGluPheThr) compound heterozygosity in a

Mauritanian patient Clin Chem Lab Med Feb 1;54(2):e35-6

(2011).Interaction of hemoglobin E with other abnormal

hemoglobins Acta Haematol.;126(4):246-8

recognized HbH disease.Blood Cells Mol Dis ;55(4):387-95

F, Imanian H, Azarkeivan A, Najmabadi H (2015) Hb

Dartmouth (HBA2: c.200T>C): An α2-Globin Gene

Associated with Hb H disease in One Homozygous Patient

Hemoglobin.; 39(3):152-5

Molecular analysis of beta-thalassemia in Vietnam

Hemoglobin 2000 May;24(2):99-104

10 Fucharoen S, Fucharoen G (2012) Hb H disease with various

β hemoglobinopathies: molecular, hematological and

diagnosticaspects Hemoglobin.;36(1):18-24

11 Fucharoen S, Weatherall DJ The Hemoglobin E

Thalassemias (2012) Cold Spring Harb Perspect Med.;2:a011734

Haemoglobinopathies in southeast Asia Indian J Med

Res 2011 Oct;134:498-506

13 González Fernández FA, Villegas A, Ropero P, Carreño MD,

(2009).Haemoglobinopathies with high oxygen affinity

Experience of Erythropathology Cooperative Spanish Group

Ann Hematol Mar;88(3):235-8

14 Greene DN, Vaughn CP, Crews BO, Agarwal AM (2015)

Advances in detection of hemoglobinopathies Clin Chim

Acta Jan 15;439:50-7

15 He S, Zheng C, Meng D, Chen R, Zhang Q, Tian X, Chen S

(2015) Hb H Hydrops Fetalis Syndrome caused by

Association of the (SEA) Deletion and Hb Constant Spring (HBA2: c.427T>C) Mutation in a Chinese Family

Hemoglobin ;39(3):216-9

16 He Y, Zhao Y, Lou JW, Liu YH, Li DZ (2016) Fetal Anemia and Hydrops Fetalis with Homozygous Hb Constant Spring

(HBA2: c.427T>C) Hemoglobin Jan 13:1-5

17 Huisman TH, Miller A Hb Grady and alpha thalassemia: a contribution to the problem of the number of Hb alpha

structural loci in man Am J Hum Genet 1976 Jul;28(4):363-9

18 Huisman TH, Wilson JB, Gravely M, Hubbard M (1974) Hemoglobin Grady The First Example of Variant with

Elongated Chains Due to an Insertion of Residues Proc Natl Acad Sci U S A Aug;71(8):3270-3

19 Jamuar SS, Lai AH, Tan AM, Chan MY, Tan ES, Ng IS (2011) Use of deferiprone for iron chelation in patients with

transfusion-dependent thalassaemia J Paediatr Child Health

Nov;47(11):812-7

20 Javid B, Said-Al-Naief N Craniofacial manifestations of

β-thalassemia major (2015) Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Jan;119(1): e33-40

VH, Fucharoen S (2015) Hemoglobin Constant Spring

Asian Populations: Haplotypic Heterogeneities and Phyloge

netic Analysis PLoS One Dec 18;10(12):e0145230

22 Li YQ, Li R, Li DZ (2013) Detection of Hb Constant Spring (α142, Term→Gln, TAA>CAA (α2)) in heterozygotes

combined with β-thalassemia Hemoglobin ;37(2):197-200

23 Megawati D, Nainggolan IM, Swastika M, Susanah S, Mose

JC, Harahap AR, Setianingsih I (2014) Severe α-thalassemia intermedia due to a compound heterozygosity for the highly

a novel codon 24 (HBA2: c.75T>A) mutation

Hemoglobin ;38(2):149-51

24 Nguyen HV, Sanchaisuriya K, Nguyen D, Phan HT, Siridamrongvattana S, Sanchaisuriya P, Fucharoen S, Fucharoen G, Schelp FP (2013) Thalassemia and hemoglobinopathies in Thua Thien Hue Province, Central

Vietnam Hemoglobin.; 37(4): 333-42

25 Nguyen VH, Sanchaisuriya K, Wongprachum K, Nguyen

MD, Phan TT, Vo VT, Sanchaisuriya P, Fucharoen S, Schelp

Hemoglobin Constant Spring is markedly high in women of

community-based survey and hematologic features Blood Cells Mol Dis

Apr;52(4):161-5

26 O'Riordan S, Hien TT, Miles K, Allen A, Quyen NN, Hung

NQ, Anh do Q, Tuyen LN, Khoa DB, Thai CQ, Triet DM, Phu NH, Dunstan S, Peto T, Clegg J, Farrar J,Weatherall D (2010) Large scale screening for haemoglobin disorders in southern Vietnam: implications for avoidance and

management Br J Haematol Aug;150(3):359-64

27 Pakdee N, Yamsri S, Fucharoen G, Sanchaisuriya K, Pissard

S, Fucharoen S (2014).Variability of hemoglobin F expression

in hemoglobin EE disease : hematological and molecular

analysis Blood Cells Mol Dis Jun-Aug;53(1-2):11-5

28 Pissard S, Raclin V, Lacan P, Garcia C, Aguilar-Martinez P, Francina A, Joly P.Characterization of three new deletions in the β-globin gene cluster during a screening survey in two French urban areas.Clin Chim Acta 2013 Jan 16;415:35-40