Bài viết trình bày việc hoàn thiện phản ứng real-time PCR và ứng dụng trong việc xác định tình trạng HLA-B5801 ở các bệnh nhân gút trước khi điều trị allopurinol.
Trang 1Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học
XÁC ĐỊNH TÌNH TRẠNG ALEN HLA-B5801
Ở BỆNH NHÂN GÚT (THỐNG PHONG)BẰNG REAL-TIME PCR
Bùi Nguyễn Nhật Minh*, Nguyễn Thị Hà Giang*, Đỗ Thị Thanh Thủy*
TÓM TẮT
Mở đầu: Bệnh gút (thống phong) là bệnh lý viêm khớp xảy ra khi acid uric tích tụ quá nhiều trong máu, dẫn đến sự lắng đọng các tinh thể muối của acid uric là urate trong một số tổ chức, đặc biệt là màng hoạt dịch khớp, sụn xương, gân, tổ chức dưới da, nhu mô thận và đài bể thận khớp Các tinh thể urate này còn có thể gây ra sỏi thận Allopurinol là thuốc điều trị gút phổ biến hiện nay nhằm làm giảm acid uric trong máu Tuy nhiên, allopurinol cũng là một trong các nguyên nhân gây ra các phản ứng quá mẫn nguy hiểm như phát ban tróc vảy, hội chứng Stevens-Johnson (SJS), và hoại tử da nhiễm độc (TEN) Các phản ứng này có thể dẫn đến tử vong và thường gặp ở các bệnh nhân mang alen HLA-B5801 Nghiên cứu này xác định tình trạng alen HLA-B5801 ở các bệnh nhân gút trước khi sử dụng allopurinol nhằm giảm thiểu nguy cơ gặp phải phản ứng quá mẫn và SJS/TEN Mục tiêu: Hoàn thiện phản ứng real-time PCR và ứng dụng trong việc xác định tình trạng HLA-B5801 ở các bệnh nhân gút trước khi điều trị allopurinol
Đối tượng và phương pháp: Tiến hành trên các bệnh nhân nghi ngờ bị bệnh gút được chẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng Thu nhận mẫu máu chứa EDTA, tách chiết DNA từ máu bệnh nhân, thực hiện kỹ thuật real-time PCR, và phân tích kết quả xác định tình trạng HLA-B5801
Kết quả: Trong tổng số 36 mẫu bệnh nhân, 2 bệnh nhân dương tính với HLA-B5801 (5,6%), 34 bệnh nhân còn lại âm tính (94,4%)
Kết luận: Nghiên cứu đã hoàn thiện phản ứng real-time PCR và ứng dụng để xác định tình trạng HLA-B5801
Từ khoá: Thống phong, Allopurinol, HLA-B5801, real-time PCR
ABSTRACT
DETERMINATION OF THE HLA-B5801 STATUS IN GOUT PATIENTS BY REAL-TIME PCR
Bui Nguyen Nhat Minh, Nguyen Thi Ha Giang, Do Thị Thanh Thuy
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No 1 - 2016: 287 - 290
Introduction: Gout is a monosodium urate crustal deposistion disease Allopurinol is the most common drug used to treat gout However, it might cause the potentially fatal allopurinol hypersensitivity syndrome, which presents with SJS and TEN, to name a few Allopurinol-users with HLA-B5801 tend to have a higher risk
of developing SJS/TEN This study focuses on determining HLA-B5801 status in gout patients, which plays an important role in the treatment of gout
Objective: To evaluate the determination of HLA-B5801 status in gout patients before treatment with allopurinol using real-time PCR
Method: Use Ct values and melting curve analysis of real-time PCR to determine HLA-B5801 status in gout patients
Results: Out of the 36 patients tested for HLA-B5801, 2 were positive for HLA-B5801 (5.6%), and 34 were negative (94.4%)
* Trung tâm Y sinh học phân tử, Đại học Y Dược Tp HCM
Tác giả liên lạc: CN Bùi Nguyễn Nhật Minh ĐT: 01228254201; Email: minhnnbui@gmail.com
Trang 2Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016
Chuyên Đề Nội Khoa I 288
Conclusion: Our research has successfully applied real-time PCR in determining HLA-B5801 status Key words: Gout, Allopurinol, HLA-B5801, real-time PCR
ĐẶT VẤN ĐỀ
Kháng nguyên bạch cầu người – Human
Leukocyte Antigen (HLA) đóng một vai trò
quan trọng trong khả năng nhận diện các chất lạ
trong cơ thể của hệ miễn dịch(2) Một số HLA đã
được nhận dạng là có liên quan tới một số dạng
bệnh hoặc phản ứng cụ thể Một trong số đó là
HLA-B5801 và phản ứng quá mẫn nguy hiểm ở
các bệnh nhân sử dụng thuốc allopurinol để điều
trị bệnh gút(3)
Allopurinol là một loại thuốc ức chế
xanthin-oxydase, là một enzyme thoái hóa hypoxanthin
thành xanthin và xanthin thành acid uric và làm
giảm cả sinh tổng hợp purine, thuốc được sử
dụng trong điều trị tăng acid uric máu một cách
rộng rãi(3) Tuy nhiên, allopurinol cũng là một
trong các nguyên nhân gây phản ứng quá mẫn
nguy hiểm như phát ban tróc vảy, hội chứng
Stevens-Johnson (SJS), và hoại tử da nhiễm độc
(TEN)(9) Nguy cơ tử vong khi gặp phải các phản
ứng này có thể cao tới 27%(1, 7)
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy nguy cơ gặp
phải các phản ứng quá mẫn nguy hiểm này tăng
lên gấp 80-97 lần ở những bệnh nhân mang alen
HLA-B5801 so với những bệnh nhân không có
alen này(3, 10) Tần số xuất hiện của alen này cao
nhất ở các nước trong khu vực Đông Nam Á
(6-8%)(8) Thống kê tại Đài Loan, Thái Lan, Nhật
Bản, và Hàn Quốc đã cho thấy mối liên kết mạnh
mẽ giữa các bệnh nhân có alen HLA-B5801 và
tình trạng phản ứng quá mẫn, SJS/TEN(3, 5, 6, 11)
ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Bệnh nhân nghi ngờ bị bệnh gút tại bệnh
viện Đại học Y dược từ 1/2015 cho đến 9/2015
Phương pháp nghiên cứu
Thu nhận 2 ml máu chứa chất chống đông
EDTA của các bệnh nhân bị bệnh gút
Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm Y Sinh học Phân tử - Đại học Y Dược TP.HCM Tách chiết genomic DNA từ mẫu máu: Mẫu máu được xử lý trong vòng 24 giờ Genomic DNA được tách chiết bằng bộ Illustra blood genomicPrep Mini Spin kit (GE Healthcare, Anh) theo hướng dẫn của nhà sản xuất
Quy trình real-time PCR: Thực hiện 2 phản ứng real-time PCR bằng bộ PG5801 Detection Kit
(Pharmigene, Inc., Đài Loan) cho mỗi mẫu thí
nghiệm Một phản ứng sẽ khuếch đại alen HLA-B5801, phản ứng còn lại sẽ khuếch đại một gene chứng nội
Phân tích kết quả real-time PCR Bảng 1 Cách phân tích kết quả real-time PCR (dựa trên bộ PG5801 Detection Kit của Pharmigene, Inc.)
Chứng nội
Ct ≤ 27
Mẫu
Ct ≤ 35
Ct ≤ 7 Dương tính
Ct > 7 Âm tính Mẫu Ct > 35 Âm tính Chứng nội
Ct > 27
Phản ứng PCR bị ức chế
Chạy lại mẫu Không đủ lượng DNA
Kết quả real-time PCR được phân tích sử dụng chương trìnhEppendorf Mastercycler ep
realplex (Eppendorf, Đức) và dựa vào hai giá trị,
chu kỳ ngưỡng (Ct, threshold cycle) và nhiệt độ nóng chảy (Tm, melting point) Ct thể hiện số chu
kỳ mà tại đó sản phẩm khuếch đại được phát hiện nhờ sự thay đổi của tín hiệu huỳnh quang Melting point là nhiệt độ nóng chảy của một đoạn DNA khi 50% lượng DNA đã bị biến tính Melting point thể hiện độ đặc hiệu của phản ứng khuyếch đại dựa vào nhiệt độ nóng chảy đặc hiệu của từng sản phẩm PCR.Mỗi mẫu thí nghiệm sẽ cho 2 giá trị Ct, một từ alen HLA-B5801 và một từ chứng nội, từ hai giá trị trên, giá trị delta Ct (Ct = CtB5801 – CtChứng nội) Phương pháp phân tích dựa trên giá trị Ct được nêu trong bảng 1
Trang 3Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Đặc điểm của nhóm nghiên cứu:
Bảng 2 Đặc điểm bệnh nhân trong nghiên cứu
Đặc điểm Tổng (n=36)
Tuổi trung bình (phạm vi giao động) 45,5(23-78)
Giới Nam/nữ (% nam) 35/1 (97,2%)
HLA-B5801 (+) 2 (nam)
Kết quả real-time PCR
Để xác định tình trạng HLA-B5801 ở bệnh
nhân, chúng tôi đã tiến hành real-time PCR sử
dụng thuốc nhuộm SYBR Green I Hình 1 cho
thấy kết quả real-time PCR của một bệnh nhân
dương tính HLA-B5801 Hình 2 cho thấy kết quả
melting curve của chứng nội và mẫu HLA-B5801
dương tính
Hình 1 Real-time PCR của mẫu HLA-B5801 (+)
BÀN LUẬN
Bệnh gút là bệnh lý viêm khớp xảy ra khi
acid uric tích tụ quá nhiều trong máu Việc này
dẫn đến sự lắng đọng các tinh thể urat natri
trong một số tổ chức, đặc biệt là màng hoạt dịch
khớp, sụn xương, gân, tổ chức dưới da, nhu mô
thận và đài bể thận khớp Bệnh thường xuất hiện
nhiều ở nam hơn so với nữ(12) Phương pháp
chữa trị gút chủ yếu tập trung vào việc làm giảm
và duy trì lượng acid uric ở dưới mức nguy
hiểm, giúp cho các tinh thể muối urat phân huỷ
Ngoài việc dùng thuốc làm tăng đào thải acid
uric niệu, người ta dùng allopurinol để ức chế
sinh tổng hợp acid uric
Hình 2 Kết quả melting curve mẫu HLA-B5801 (+)
Ngày nay, khoa học đã thừa nhận HLA-B5801 chính là một trong những dấu ấn di truyền dự báo các tác hại nghiêm trọng trên da khi sử dụng allopurinol và đưa ra khuyến cáo về việc xác định tình trạng alen HLA-B5801 trước khi tiến hành điều trị với allopurinol (4) Chính vì vậy, xét nghiệm HLA-B5801 cần phải được thực hiện trước khi dùng allopurinol, đặc biệt ở các bệnh nhân Đông Nam Á(3) Nếu bệnh nhân có alen HLA-B5801 thì sẽ được các bác sĩ tư vấn sử dụng thuốc thay thế hoặc theo dõi chặt chẽ và thay đổi liều lượng thuốc allopurinol phù hợp nhằm giảm thiểu nguy cơ xảy ra phản ứng quá mẫn nguy hiểm
Phương pháp real-time PCR để xác định HLA-B5801 sử dụng thuốc nhuộm SYBR Green I
và phân tích melting curve là một phương pháp đơn giản và không cần sử dụng đoạn dò đặc hiệu Melting curve sử dụng melting point, là nhiệt độ nóng chảy của một đoạn DNAkhi 50% lượng DNA đã bị biến tính Nhiệt độ nóng chảy thể hiện độ đặc hiệu của phản ứng khuếch đại dựa vào nhiệt độ nóng chảy đặc hiệu của từng sản phẩm PCR Vì thế, việc phân tích melting curve là một bước để khẳng định kết quả real-time PCR của HLA-B5801 vì nó thể hiện nhiệt độ nóng chảy đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại HLA-B5801 và nhiệt độ nóng chảy của chứng nội, giúp cho việc khẳng định kết quả dương tính và âm tính chắc chắn hơn Ngoài ra, đây là phương pháp hữu dụng trong việc phòng ngừa
Trang 4Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016
Chuyên Đề Nội Khoa I 290
khả năng ngoại nhiễm sản phẩm PCR được
khuếch đại
Dựa vào giá trị Ct và phân tích đường cong
nóng chảy cho sản phẩm PCR đặc hiệu với gen
HLA-B5801 và sản phẩm khuếch đại của chứng
nội, các mẫu HLA-B5801 dương tính có melting
point 88,85±0,35°C, trong khi các mẫu chứng nội
có melting point 81,60±0,34°C Các kết quả này
cho thấy độ đặc hiệu của bộ kit với alen
HLA-B5801 và chứng nội Bộ kít này cho kết quả 2
mẫu B5801 dương (5,6%), và 34 mẫu
HLA-B5801 âm (94,4%)
Thực hiện xét nghiệm HLA-B5801 sẽ giúp
bác sĩ đề ra phương hướng điều trị bệnh gút
hiệu quả nhất cho bệnh nhân và tránh được các
phản ứng phụ của thuốc
KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã thành công trong việc sử
dụng phương pháp real-time PCR trong việc xác
định HLA-B5801 ở các bệnh nhân bịgút Ứng
dụng kỹ thuật này trước khi cho bệnh nhân sử
dụng alluporinol sẽ tránh hoặc giảm nhẹ được
các phản ứng quá mẫn nguy hiểm, đồng thời
giúp đưa ra phương pháp và liều lượng thuốc
điều trị phù hợp cho từng bệnh nhân
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Arellano F, Sacristan J (1993) Allopurinol hypersensitivity
syndrome: a review Ann Pharmacother, 27: 337-343
2 Fan W, Huang L, Zhou Z, Zeng X, Li G, Deo P, Hu L, Li Y
(2012) Rapid and reliable genotyping of HLA-B*27 in the
Chinese Han population using a duplex real-time TaqMan PCR
assay Clin Biochem, 45: 106-111
3 Hershfield MS, Callaghan JT, Tassaneeyakul W, Mushiroda T, Thorn CF, Klein TE, Lee MTM (2012) Clinical pharmacogenetics implementation consortium guidelines for human leucocyte
antigen-B genotype and Allopurinol dosing Clin Phaarmacol Ther, 93: 153-158
4 Hung SI, Chung WH, Liou LB, Chu CC, et al (2005) HLA-B*5801 allele as a genetic marker for severe cutaneous adverse
reactions caused by allopurinol Proc Natl Acad Sci U.S.A, 102:
4134-4139
5 Kang HR, Jee YK, Kim YS, Lee CH, Jung JW, et al (2011) Positive and negative associations of HLA class I alleles with
allopurinol-induced SCARS in Koreans Pharmacogenet Genomics,
21: 303-307
6 Kaniwa N, Saito Y, Aihara M, Matsunaga K, et al (2008) HLA-B locus in Japanese patients with anti-epileptics and allopurinol-related Stevens-Johnson syndrome and toxic epidermal
necrolysis Pharmacogenomics, 9: 1617-1622
7 McInnes GT, Lawson DH, Jick H (1981) Acute adverse reactions
attributed to allopurinol in hospitalised patients Ann Rheum Dis,
40: 245-249
8 Middleton D, Menchaca L, Rood H, Komerofsky R (2003) New
allele frequency database Tissue Antigens, 61: 403-407
9 Mockenhaupt M, Viboud C, Dunant A, et al (2008) Stevens-Johnson syndrome and toxic epidermal necrolysis: assessment of medication risks with emphasis on recently marketed drugs
The EuroSCAR-study J Invest Dematol, 128: 35-44
10 Somkrua R, Eickman EE< Saokaew S, Lohitnavy M, Chaiyakunapruk N (2011) Association of HLA-B*5801 allele and allopurinol induced stevens johnson syndrome and toxic epidermal necrolysis: a systematic review and metaanalysis
BMC Med Genet, 12: 118
11 Tassaneeyakul W, Jantararoungtong T, Chen P, Lin PY, et al (2009) Strong association between HLA-B*5801 and allopurinol-induced Stevens—Johnson syndrome and toxic epidermal
necrolysis in a Thai population Pharmacogenet Genomics, 19:
704-709
12 Yeo SI (2013) HLA-B*5801: utility and cost-effectiveness in the
Asia-Pacific Region Int J Rheum Dis, 16: 254-257