Phát hiện đột biến gen gây bệnh Alpha Thalassemia

Alpha thalassemia (α thalassemia) là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường gây nên do giảm hoặc mất hoàn toàn sự tổng hợp chuỗi α globin. Cho đến nay, hơn 35 loại đột biến được phát hiện trên gen α globin gây bệnh α thalassemia. Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định một số đột biến phổ biến trên gen α globin ở bệnh nhân α thalassemia bằng kỹ thuật Multiplex ARMS - PCR. 33 bệnh nhân được chẩn đoán xác định là α thalassemia được lựa chọn vào nghiên cứu để xác định đột biến. Kết quả cho thấy 27/33 trường hợp mang đột biến chiếm 82,82% với 3 loại ñột biến phổ biến trên gen α globin. ðột biến SEA 54,7%, α4.2 (28,6%), α3.7 (16,7%), chưa phát hiện được một biến THAI, FIL..

PHÁT HIỆN đỘT BIẾN GEN GÂY BỆNH ALPHA THALASSEMIA

Bùi Thị Minh Phượng, Trần Huy Thịnh, Tạ Thành Văn,

Trần Thị Thúy Hằng, Trần Vân Khánh

Trường đại học Y Hà Nội Alpha thalassemia (α thalassemia) là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường gây nên do giảm hoặc

mất hoàn toàn sự tổng hợp chuỗi α globin Cho ựến nay, hơn 35 loại ựột biến ựược phát hiện trên gen α

globin gây bệnh α thalassemia Nghiên cứu ựược thực hiện nhằm xác ựịnh một số ựột biến phổ biến trên gen

α globin ở bệnh nhân α thalassemia bằng kỹ thuật Multiplex ARMS - PCR 33 bệnh nhân ựược chẩn ựoán

xác ựịnh là α thalassemia ựược lựa chọn vào nghiên cứu ựể xác ựịnh ựột biến Kết quả cho thấy 27/33

trường hợp mang ựột biến chiếm 82,82% với 3 loại ựột biến phổ biến trên gen α globin đột biến SEA 54,7%,

α4.2 (28,6%), α3.7 (16,7%), chưa phát hiện ựược ựột biến THAI, FIL

Từ khóa: Alpha thalassemia, Multiplex PCR

I đẶT VẤN đỀ

Alpha thalassemia (α thalassemia) là bệnh

di truyền lặn nhiễm sắc thể thường do ựột

biến gen α globin, gây giảm hoặc mất hoàn

toàn sự tổng hợp chuỗi globin α đây là một

trong những bệnh huyết sắc tố phổ biến nhất,

phân bố trên toàn thế giới cũng như ở Việt

Nam và khu vực châu Á [1] Theo thống kê: tỷ

lệ người mang gen ựột biến mất ựoạn lớn

dạng SEA (đông Nam Á) là cao nhất (tỷ lệ

90% - 95%), Bắc Thái Lan (14%), Nam Trung

Quốc (5,0 - 8.8%), Hồng Kông (4,5%), Trung

tâm Thái Lan (3,7%) và dạng Bắc đài Loan

(3,5%) [1; 2] Tại Việt Nam, một số nghiên cứu

ựã công bố có 3 ựột biến gây ra bệnh α

thalas-semia gồm SEA, α4.2, α3.7, chưa phát hiện

ựột biến THAI, FIL [3; 4] Alpha thalassemia là

bệnh thiếu máu tan máu nặng và chưa có

phương pháp ựiều trị triệt ựể Alpha

thalas-semia thể nặng và trung bình thường biểu

hiện thiếu máu từ trung bình ựến nặng, cuộc

sống phụ thuộc vào việc truyền máu và thải sắt suốt ựời, người bệnh có chất lượng cuộc sống thấp ựồng thời là gánh nặng cho gia ựình

và xã hội [3; 4] Xác ựịnh ựột biến gen trên bệnh nhân ựể tiến tới phát hiện người lành mang gen bệnh và chẩn ựoán trước sinh nhằm có những tư vấn di truyền thắch hợp ựóng vai trò quan trọng giúp ngăn ngừa và làm giảm tỷ lệ mắc bệnh Phương pháp multi-plex ARMS - PCR ựã ựược sử dụng rộng rãi

ựể phát hiện ựột biến gen gây bệnh α thalas-semia do ựộ chắnh xác cao, giá thành rẻ và ắt phức tạp [5] Xuất phát từ thực tiễn trên, nghiên cứu ựược tiến hành với mục tiêu: Xác ựịnh một số ựột biến phổ biến trên gen α glo-bin ở bệnh nhân α thalassemia bằng kỹ thuật multiplex ARMS - PCR

II đỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

1 đối tượng

33 bệnh nhân ựược chẩn ựoán mắc bệnh α thalassemia tại Khoa Huyết học, Truyền máu, Bệnh viện Bạch Mai và Bệnh viện Huyết học, Truyền máu Trung ương dựa vào triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng ựiển hình Nghiên cứu có sử dung DNA của người bình thườ ng

ựể làm mẫu ựối chứng

địa chỉ liên hệ: Trần Vân Khánh, Trung tâm Nghiên cứu

Gen - Protein, Trường đại học Y Hà Nội

Email: vankhanh73md@yahoo.com

Ngày nhận: 22/7/2015

Ngày ựược chấp thuận: 9/9/2015

2 Phương pháp

2.1 K& thu*t tách chi.t DNA

+ DNA ñược tách chiết từ máu ngoại vi của bệnh nhân α thalassemia sử dụng Kit tách chiết của hãng QIAGEN (ðức)

+ Kiểm tra nồng ñộ và ñộ tinh sạch của DNA ñược tách chiết bằng phương pháp ño quang trên máy NanoDrop: nồng ñộ DNA 300-380ng/ml, ñánh giá ñộ tinh sạch bằng tỷ lệ

2.2 K& thu*t multiplex ARMS - PCR

Kỹ thuật multiplex ARMS - PCR ñược dùng ñể sàng lọc sự hiện diện của nhiều ñột biến trong cùng một phản ứng Mỗi phản ứng

sẽ dùng mồi ñặc hiệu có trình tự ñầu 3 bổ sung với alen ñột biến và một mồi chung ngược chiều với mồi ñặc hiệu alen Sự hiện

diện của các alen ñột biến ñược biểu hiện bằng sản phẩm DNA khuyếch ñại với các kích thước khác nhau ñã biết trước (biểu ñồ 1) [5]

2.2.1 Thiết k ế mồi

Mồi ñược thiết kế nhằm phát hiện 5 ñột biến thường gặp tại Việt Nam với các mồi ñặc hiệu bổ sung với ñột biến Các ñột biến là: α3.7, α4.2 , SEA, FIL & THAI

- Mồi LIS: Khuy ếch ñại một ñoạn gen tổng hợp protein lis 1 ðây là protein có trong mọi

tế bào, không phụ thuộc vào thể loại, trạng thái hoạt ñộng hay nguồn gốc nên nó c hỉ là gen nội chuẩn, dùng ñể kiểm tra chất lượng thao tác thực hiện và qui trình, kích thước 2.3kb

- Mồi α2: Xác ñịnh thể của ñột biến xuất

hiện trên bản ñồ ñiện di chỉ khi ñột biến có kiểu gen dị hợp tử, kích thước khoảng 1.8kb

Sơ ñồ 1 Tổ hợp gen α globin và vị trí các mồi xác ñịnh ñột biến

A, Vị trí các mồi xác ñịnh ñột biến; B, chiều dài tương ứng của các ñột biến mất ñoạn lớ n (α3.7, α 4.2 , SEA, FIL & THAI) Cặp mồi ñể xác ñịnh ñột biến phải dài hơn ñoạn gen bị ñột biến

và nằm ngoài vị trí ñoạn gen ñột biến (ví dụ cặp mồi THAI-F và THAI-R dùng ñể xác ñịnh ñột biến THAI hoặc FIL - F và FIL - R dùng ñể xác ñịnh ñột biến FIL )

2.2.2 Kỹ thuật multiplex ARMS - PCR

Thành phần phản ứng gồm: nước cất 3µl, master Mix Quiagen Taq 6µl, DNA 2µl, DMSO 1µl, primer LIS 1µl, primer α2/α3.7 1µl, primer α2 1µl, primer α4.2 1µl, primer SER 1µl, primer THAI 1µl, primer FIL 1µl Thực hiện 35 chu kỳ gồm các giai ñoạn duỗi xoắn ở 95oC

trong 15 phút 40 giây, bám mồi 65o trong 90 giây, kéo dài 72oC trong 2 phút 30 giây,cuối cùng là kéo dài 72oC trong 5 phút Sau khi nhân DNA ñích, ñiện di sản phẩm DNA trên agarose gel 2% và phân tích kết quả

3 ðạo ñức trong nghiên cứu

Các ñối tượng tham gia hoàn toàn tự nguyện

và có quyền rút khỏi nghiên cứu khi không ñồng ý tham gia nghiên cứu Các thông tin liên quan

ñến bệnh nhân ñược ñảm bảo bí mật

III KẾT QUẢ

Trong số 33 bệnh nhân, ñã phát hiện ñược 27/33 (82,82%) bệnh nhân có ñột biến mất ñoạn

trên gen α globin gây bệnh α thalassemia

Bảng 1 Các loại ñột biến và kiểu gen phát hiện trên gen α globin

Dị hợp tử ñơn

(n = 9)

ðồng hợp tử

(n = 4)

Dị hợp tử kép

(n = 14)

Tổng

Bệnh nhân không phát hiện thấy ñột biến 6

Các ñột biến thườ ng gặp trên gen α globin ở nhóm nghiên cứu là ñột biến SEA, α4.2, α3.7

Bệnh nhân có thể có ñột biến dị hợp tử ñơn, ñồng hợp tử hoặc dị hợp tử kép kết hợp

Biểu ñồ 1 Tỷ lệ các thể bệnh α Thalassemia

Trong số 27 trường hợp phát hiện ñược ñột biến có 4 trường hợ p (15%) bệnh nhân có ñột biến ñồng hợp tử, 9 trường hợ p (33%) ñột biến dị hợp tử và 14 (52%) dị hợp tử kết hợp Tất cả

14 trường hợ p dị hợp tử kép gây thể HbH

Biểu ñồ 2 Tỷ lệ các ñột biến bệnh nhân α Thalassemia

Trong số 3 loại ñột biến phát hiện ñược có 23 trường hợp ñột biến SEA chiếm 54,7%; 12 trường hợp mắc ñột biến α4.2 chiếm 28,6%; 7 trường hợp ñột biến α3.7 chiếm 16,7%

IV BÀN LUẬN

Kỹ thuật Multiplex ARMS - PCR ñược sử dụng ñể phát hiện 5 loại ñột biến phổ biến gây bệnh α thalassemia Nhóm nghiên cứu ñã sử dụng kỹ thuật Multiplex ARMS - PCR và ñã phát hiện ñược 27/33 trường hợp bệnh nhân

có ñột biến chiếm 82,82%

Mẫu nghiên cứu của chúng tôi ñều là thể HbH (dị hợ p tử kép), thể dị hợp tử ñơn, và ñồng hợp tử vì tất cả các bệnh nhân ñều trong tình trạng thiếu máu nặng, thiếu máu vừa các chỉ số xét nghiệm ñều giảm, kết quả ñiện di huyết sắc tố HbA1 < 97%, HbA2 < 3%, có HbH

ở các thể HbH ñã ñược phát hiện gen ñột biến tương ứng với ñặc ñiểm của bệnh [2; 6]

ðột biến SEA chiếm tỷ lệ cao nhất 54,7%

cũng tương ứng nghiên cứu của Lý Thị Thanh

Hà và cộng sự là 58,8% Tuy nhiên, kết quả này có sự khác biệt với nghiên cứu ở Malaysia (0,5%) và ở Chines (1,36%) ðiều này cho thấy ở Việt Nam ñột biến SEA chiếm chủ yếu [3; 7; 8]

ðột biến α 4.2 chiếm tỷ lệ cao thứ 2: 28,6%

có sự khác biệt so với nghiên cứu của Lý Thị Thanh Hà (5,9%), nghiên cứu ở Malaysia (0,25%) và nghiên cứu ở Chines (1,36%) [7; 9; 10] ðột biến α 3.7 chiếm tỷ lệ 16,7% cũng tương ñối cao hơn s o với nghiên cứu của Lý Thị Thanh Hà (không phát hiện ñược), nghiên cứu ở Malaysia (8%) và nghiên cứu ở Chines (2,7%) [3; 11]

Chưa tìm thấy ñột biến THAI, FIL nào trong các bệnh nhân nghiên cứu Kết quả này tương ñương với kết quả c ủa Lý Thị Thanh

Hà ðiều này chứng tỏ ñột biến Thai và ñột biến FIL chưa phát hiện thấy ở Việt Nam Hai loại ñột biến này thường có ở tộc người Thái Lan và Philipphin [12; 13]

Ngoài các loại ñột biến trên nghiên cứu của Lý Thị Thanh Hà còn phát hiện ñược thêm 2 loại ñột biến ñiểm là HbQs và HbCs [3] Tuy nhiên, nghiên cứu của chúng tôi c hưa tìm ñược 2 loại ñột biến này Vì thời gian nghiên cứu chưa ñủ nên chúng tôi sẽ tiếp tục

nghiên cứu ựể tìm thêm c ác loại ựột biến

khác Do ựặc ựiểm phân bố các gen α globin

trên nhiễm sắc thể, nên sự biểu hiện các thể

bệnh ựa dạng hơn β Thalassemia Có 4 thể

α1, α2, thể HbH, thể BartỖs Trong ựó thể α

ựồng hợ p tử chiếm 15%, dị hợp tử ựơn chiếm

33%, dị hợp tử kép (HbH) chiếm 52% Theo

Schneider và cs thì ở người Mỹ da ựen tỷ lệ

mang gen α Thalaasemia là từ 2 ựến 7%,

nhưng hầu hết rất ắt gặp bệnh HbH [7; 14; 15]

Việc xuất hiện bệnh HbH không những chỉ

phụ thuộc vào người mang gen α

Thalassemia (ựể những người này có k hả

năng kết hôn với nhau) mà còn phụ thuộc vào

kiểu gen α1 cis hay α1 trans có mặt trong quần

thể [16]

V KẾT LUẬN

Nghiên cứu ựã phát hiện ựược 27/33

trường hợp mang gen ựột biến với 3 loại ựột

biến trong ựó:

đột biến SEA 23/42 c hiếm tỷ lệ cao nhất là

54,7% đột biến α4.2 chiếm tỷ lệ 28,6% và

16,7% ựột biến α3.7

Trong số 27 bệnh nhân phát hiện mang ựột

biến trên gen α-globin phát hiện ựược 15%

ựồng hợp tử; 33% mang dị hợp tử ựơn và

52% dị hợp tử kép

Lời cảm ơn

Nhóm nghiên cứu trân trọng cảm ơn Khoa

Huyết học, Truyền máu, Bệnh viện Bạch Mai

và Bệnh viện Huyết học, Truyền máu Trung

ương ựã giúp ựỡ trong quá trình thực hiện

nghiên cứu đề tài ựược thực hiện với sự hỗ

trợ kinh phắ của ựề tài nhánh cấp nhà nước

ỘNghiên cứu một số chỉ số sinh học, trình tự

gen ty thể người Việt Nam trưở ng thành và

ựột biến gen gây bệnh thalassemiaỢ thuộc ựề

tài nhiệm vụ Quỹ gen Ộđánh giá ựặc ựiểm di

truyền người Việt NamỢ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Nguyễn Công Khanh (2008) Bệnh

hemoglobin Huyết học lâm s àng nhi k hoa -Nhà xuất bản Y học, 127 - 146

2 Nguyễn Công Khanh (1993) Tần suất

bệnh hemoglobin ở Việt Nam Y học Việt

Nam, 174 (8), 11 - 16

3 Lý Thị Thanh Hà, Ngô Diễm Ngọc, Nguyễn Thị Phương Mai và cộng sự (2010)

Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn ựoán trước và sau sinh bệnh alpha

Thalassemia tại bệnh viên Nhi Trung ương

Tạp chắ Nhi k hoa, 3(3), 337 - 342

4 Bạch Quốc Tuyên., đặng đức Quý, Nguyễn đình Lượng (1974) Một số trường

hợp huyết sắc tố bình thường phát hiện ở

bệnh viện Bạch Mai Công trình nghiên c ứu huyết học và truyền máu 1963 - 1974, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội

5 Anchalee Thedsawad, Sumalee jindadamrongwech, Suporn Chuncharunee

et al (2012) Multiplex ARMS - PCR Analysis

for Nineteen β - Thalassemia Mutation Jour-nal of Hematology and Tranfusion Medicine,

22 (1), 1 - 38

6 Chui DH, Waye JS (1998) Hydrops

fetalis caused by alpha-thalassemia: an

emerging health care problem Blood, 91,

2213 - 2222

7 H.M Aderson H.M Ranney (1990)

Southeast Asian Iminmgarant: The new

tha-lassemia in American, Seminars in

Hematol-ogy, 27, 239 - 246

8 Flatz G (1965) Hemoglobinophathiess

in Thai Lhann Br J Haematol, 11, 216 - 217

9 David J R (1977) The moleculer

mechanism of α thalassemia in the black

Blood, 50, 105

10 Die sseroth A (1976) Hemoglobin

syn-thesis in somatic cell hy brid: independent

seg-regation of the human alpha and beta globin

gene Science, 191, 1262

11 Embury S.H (1979) Organization of

the α globin gen in the chines α thalassemia

syndromes J.Clin.Invest, 63

12 Chui DH, Waye JS (1998) Hydrops

fetalis caused by alpha-thalassemia, an

emerging health care problem Blood, 91,

2213 - 2222

13 Dương Bá Trực (1996) ðặc ñiểm lâm

sàng và huy ết học bệnh HbH ở trẻ em Việt Nam, Bước ñầu tìm hiểu tần suất alpha

tha-lassemia ở Hà Nội Luận văn Tiến sỹ k hoa học, Trường ñại học Y Hà Nội, 36 - 42

14 Hurst d (1991) Anaemia and

hemoglo-bin parties in Southeast Asian refugee c

hil-dren The J.of Paediatrics, 102 (5), 692

15 David J R (1977) The moleculer

mechanism of α thalassemia in the black

Blood, 50, 105

16 Told D.Lai MCS, Braga C.A, Soo N.H (1969) Alpha thalassemia in Chinese cord

blood studies Br J.Haematol, 16, 551 - 556

Summary MOLECULAR DIAGNOSIS OF ALPHA-THALASSEMIA BY

MULTIPLEX ARMS-PCR

Alpha-thalassemia (α -thalassemia) is an autosomal recessive blood disorder that is character-ized by an absence or a reduction in α-globin chain synthesis More than 35 different mutations located within the α-globin gene are currently recognized throughout the world as causes for α-thalassemia The purpose of this study is to detect common mutations in α-globin using Multiplex ARMS - PCR 33 unrelated patients with α-thalassemia were selected for this study The results showed that 27 out of 33 patients having mutation, it accounted for 82.82% with 3 common mutations in α-globin gene The most frequent mutations are SEA 54.7%, α4.2 (28.6%), α3.7 (16.7%)

Keywords: Alpha thalassemia, Multiplex PCR