Bài thuyết trình: Ứng dụng kĩ thuật phân tử trong xét nghiệm nông nghiệp

Bài thuyết trình: Ứng dụng kĩ thuật phân tử trong xét nghiệm nông nghiệp trình bày giới thiệu nguyên lý kỹ thuật PCR, nguyên lí hoạt động của PCR, một số ứng dụng của PCR trong nông nghiệp hiện nay. Để nắm vững nội dung chi tiết mời các bạn cùng tham khảo tài liệu. Hi vọng tài liệu sẽ giúp ích cho các bạn trong quá trình học tập cũng như nghiên cứu của mình.

NG D NG KĨ THU T PHÂN T  TRONG XÉT 

Danh sách thành viên

Đ t v n đ ặ ấ ề

          Nh  phát minh kĩ thu t PCR mà ngành sinh h c phân t  và nhi u  ờ ậ ọ ử ề

ngành khoa h c khác có s  d ng kĩ thu t sinh h c phân t  đ ọ ử ụ ậ ọ ử ượ c ti p  ế

c n v i m t ph ậ ớ ộ ươ ng pháp m i đem l i k t qu  có ý nghĩa to l n, trong  ớ ạ ế ả ớ

đó có các nghiên c u v  các lĩnh v c y t , khoa h c đ i s ng. PCR là  ứ ề ự ế ọ ờ ố

ph ươ ng pháp đ n gi n, d  th c hi n, có đ  nh y và tính đ c hi u r t  ơ ả ễ ự ệ ộ ậ ặ ệ ấ

cao; do đó, PCR r t thích h p cho xét nghi m ch n đoán trong lĩnh v c  ấ ợ ệ ẩ ự

y h c, pháp y, b nh lí cây tr ng ọ ệ ồ

 NH  V Y: Ư Ậ

 ­ T I SAO L I L A CH N PH Ạ Ạ Ự Ọ ƯƠ NG PHÁP XÉT NGHI M B NG KĨ THU T PCR ? Ệ Ằ Ậ

 ­ C  S  NÀO Đ  THI T K  CÁC M I Đ C HI U CHO M T PH N  NG TRONG M T CHU N ĐOÁN  Ơ Ở Ể Ế Ế Ồ Ặ Ệ Ộ Ả Ứ Ộ Ẩ

?

 ­ TRÊN Đ I T Ố ƯỢ NG LÀ VIRUS C N CÓ NH NG L U Ý GÌ TRONG PH N  NG ? Ầ Ữ Ư Ả Ứ

 ­ Ý NGHĨA C A VI C CHU N ĐOÁN B NG XÉT NGHI M NÀY TRONG NÔNG NGHI P ? Ủ Ệ Ẩ Ằ Ệ Ệ

 I. Gi i thi u nguyên lý k  thu t PCR  ớ ệ ỹ ậ

I.Gi i thi u nguyên lý k  thu t PCR ớ ệ ỹ ậ

   D a vào c  ch  t ng h p gen đ c hi u trong t  bào,  ự ơ ế ổ ợ ặ ệ ế

nhà hóa sinh ng ườ i Mĩ Karry Mullis đã phát minh ra kĩ 

thu t t ng h p gen trong  ng nghi m (PCR) vào năm  ậ ổ ợ ố ệ

1985. PCR là ph ươ ng pháp in vitro đ  t ng h p m t  ể ổ ợ ộ

đo n DNA đ c thù nh  công hi u c a 2 m i  ạ ặ ờ ệ ủ ồ

oligonucleotide g n vào 2 s i đôi c a đo n DNA đích v i  ắ ợ ủ ạ ớ

s  tham gia c a DNA polymerase ự ủ

  

Gi i thiêu các b ớ ướ ơ ả c c  b n c a k  thu t PCR trong vi c  ủ ỹ ậ ệ

    Phân tích phát hi n s n ph m  ệ ả ẩ

PCR b ng quang ph  hay đi n  ằ ổ ệ

di

Th c hi n xét nghi m ch n  ự ệ ệ ẩ

đoán b ng PCR ằ

Sáu khâu chính c a quy trình xét nghi m b ng k  thu t PCR ủ ệ ằ ỹ ậ  

 1. L y m uấ ẫ : ADN có th  tách chi t t  ể ế ừ

nh ng m u khác nhau, nh  máu tữ ẫ ư ươi, máu 

khô, t  bào niêm m c, nế ạ ước xúc mi ng, tóc, ệ

da, phân, v.v  M u có th  l y t i ch  ho c ẫ ể ấ ạ ỗ ặ

g i t  xa hàng nghìn kilômet, m t nhi u ử ừ ấ ề

ngày, trong phong bì bình thường, qua b u ư

đi n, không c n b o qu n l nh.ệ ầ ả ả ạ

Kí hi u­L y m u đem  ệ ấ ẫ

phân tích

Có th  là DNA kép, đ n, ho c RNA đ ể ơ ặ ượ c tách chi t t  các đ i t ế ừ ố ượ ng  nghiên c u. DNA m u có đ  nguyên v n cao tránh l n t p ch t ứ ẫ ộ ẹ ẫ ạ ấ

L ượ ng DNA đ ượ ử ụ c s  d ng cũng có khuynh h ướ ng gi m  (t  1mg  ả ừ

xu ng còn 100µg) vì th  ng ố ế ườ i ta s  d ng polymerase cho hi u qu   ử ụ ệ ả cao .

 2. Tách chi t ADN ế : Nhi u quy trình tách chi t  ề ế

ADN khác nhau c a th  gi i đã đ ủ ế ớ ượ c nghiên 

c u, th  nghi m và thích  ng v i đi u ki n  ứ ử ệ ứ ớ ề ệ

n ướ c ta. Do v y, góp ph n gi m giá thành,  ậ ầ ả

ti t ki m kinh phí. V i m i lo i m u có m t  ế ệ ớ ỗ ạ ẫ ộ

quy trình tách chi t thích h p riêng. Đ m b o  ế ợ ả ả

ch t l ấ ượ ng và s  l ố ượ ng ADN t  nh ng l ừ ữ ượ ng 

m u nh ẫ ỏ  

Tách chi t ADN ế  

Tinh s ch ADN ạ  

 3.  Nhân ADN đ c hi u ặ ệ : 

 Đây là khâu quan tr ng nh t c a quy  ọ ấ ủ

trình. Các h n h p hoá ch t khác nhau và  ỗ ợ ấ

các chu trình nhi t khác nhau đã đ ệ ượ c th   ử

nghi m cho t ng c p m i. Trên c  s  đó,  ệ ừ ặ ồ ơ ở

đã t i  u hoá thành ph n c a t ng h n  ố ư ầ ủ ừ ỗ

h p, t ng chu trình nhi t cho t ng c p  ợ ừ ệ ừ ặ

m i, d a vào nh ng hoá ch t s n có trên  ồ ự ữ ấ ẵ

th  tr ị ườ ng trong n ướ c 

  Nhân ADN đ c hi u ặ ệ  

 4. Đi n di ệ : Đi n di đ c dùng đ  tách bi t các  ệ ượ ể ệ

đo n ADN có đ  dài ng n khác nhau. Đ  tách  ạ ộ ắ ộ

bi t này ph  thu c nhi u y u t  Các y u t  đã  ệ ụ ộ ề ế ố ế ố

đ ượ ự c l a ch n và t i  u hoá trên c  s  v t li u  ọ ố ư ơ ở ậ ệ

s n có, h  giá thành đáng k  và tăng đ  phân  ẵ ạ ể ộ

gi i lên hàng trăm l n, giúp phân bi t rõ các  ả ầ ệ

đo n ADN ch  chênh l ch nhau b n nucleotid.  ạ ỉ ệ ố

Đi n di ệ  

 5. Nhu m màu ADN: ộ  Ch t l ấ ượ ng đi n di và  ệ

k t qu  nhân ADN đ c hi u ch  có th  hi n rõ  ế ả ặ ệ ỉ ể ệ

trên b n gel v i quy trình nhu m ADN đ ả ớ ộ ượ c 

t i  u hoá và ph ố ư ươ ng pháp nhu m thích h p  ộ ợ

đ ượ ự c l a ch n. Ngoài ra, kinh nghi m và k   ọ ệ ỹ

năng c a k  thu t viên cũng r t c n thi t, góp  ủ ỹ ậ ấ ầ ế

ph n h  giá thành chung  ầ ạ

  Nhu m màu ADN  ộ

 6. Phân tích k t qu : ế ả  B n gel sau khi nhu m  ả ộ

xong s  có d ng nh  hình trên. Các đo n ADN có  ẽ ạ ư ạ

đ  dài khác nhau hi n rõ trên b n gel, có th  quan  ộ ệ ả ể sát b ng m t th ằ ắ ườ ng và đo đ m. Trong m t s   ế ộ ố

tr ườ ng h p, có th  xác đ nh trình t  ADN đ  có  ợ ể ị ự ể

k t lu n cu i cùng. Hàng nghìn b n gel nh  th  đã  ế ậ ố ả ư ế

đ ượ c phân tích và hi n đ ệ ượ ư c l u gi  t i Phòng thí  ữ ạ nghi m.  ệ

Phân tích k t qu ế ả 

­ T I SAO L I L A CH N PH Ạ Ạ Ự Ọ ƯƠ NG PHÁP  XÉT NGHI M B NG KĨ THU T PCR ? Ệ Ằ Ậ

ü Trong nông nghi p hi n đ i có nhi u lo i b nh c n ph i đệ ệ ạ ề ạ ệ ầ ả ược chu n đoán ẩ

s m ngay t i vớ ạ ườ ươn  m hay trên ngu n h t gi ng đ  lo i b  tác nhân gây h i ồ ạ ố ể ạ ỏ ạ

trước khi được đ a ra tr ng tr t và s n su t đ i trà m t khác trên nh ng đ i ư ồ ọ ả ấ ạ ặ ữ ố

tượng nghi ng  đã b  lây nhi m m m b nh có th  lo i tr  s m đ  tránh vi c ờ ị ễ ầ ệ ể ạ ừ ớ ể ệ

lây lan nh m gi m thi u thi t h i đ n m c th p nh t. Vì th  nh ng  u th  ầ ả ể ệ ạ ế ứ ấ ấ ế ữ ư ế

c a kĩ thu t này giúp đ a ra k t qu  m t cách chính xác và k p th i đ  có th  ủ ậ ư ế ả ộ ị ờ ể ể

gi i quy t m m móng các ngu n b nh.ả ế ầ ồ ệ

­ C  S  NÀO Đ  THI T K  CÁC M I Đ C HI U  Ơ Ở Ể Ế Ế Ồ Ặ Ệ CHO M T PH N  NG TRONG M T CHU N  Ộ Ả Ứ Ộ Ẩ

ĐOÁN ?

 Khi nhi t đ  h  xu ng đ n nhi t đ  g n m i, m t m i s  ệ ộ ạ ố ế ệ ộ ắ ồ ộ ồ ẽ g n đ c hi u ắ ặ ệ vào m ch mang nghĩa trong khi m t ạ ộ

m i khác s  g n vào m ch đ i nghĩa. Trong đó, m i là các trình t  oligonucleotide ng n có th  bám đ c hi u ồ ẽ ắ ạ ố ồ ự ắ ể ặ ệvào m t vùng trình t  nh t đ nh. M i s  là đi m kh i đ u đ  các polymerase có th  th c hi n t ng h p m ch ộ ự ấ ị ồ ẽ ể ở ầ ể ể ự ể ổ ợ ạ

b  sung m i cũng nh  xác đ nh đo n ADN đổ ớ ư ị ạ ược khu ch đ i.ế ạ  Do đó, vi c thi t k  m i s  quy t đ nh m c đ  ệ ế ế ồ ẽ ế ị ứ ộ

đ c hi u và năng su t c a ph n  ng.ặ ệ ấ ủ ả ứ

 Vi c thi t k  m i đ c hi u cho m t ph n  ng đ a vào trình t  b o t n n m trong vùng b o t n genome c a ệ ế ế ồ ặ ệ ộ ả ứ ự ự ả ồ ằ ả ồ ủsinh v t, trình t  b o t n th  hi n đ c tr ng riêng bi t cho t ng sinh sinh v t c  th  mà d a vào đó có th  ậ ự ả ồ ể ệ ặ ư ệ ừ ậ ụ ể ự ểthi t k  các m i đ c hi u cho t ng loài sinh v t.ế ế ồ ặ ệ ừ ậ  

­  Trình t  đích quan tr ng trong phát hi n vi sinh v tự ọ ệ ậ

­  Trình t  v a có vùng b o t n cao cho m t nhóm vi sinh ự ừ ả ồ ộ

v t và v a có vùng bi n đ ng đ c tr ng cho t ng loài ậ ừ ế ộ ặ ư ừ

riêng bi t.ệ

Thi t k  m i đ c hi u cho  ế ế ồ ặ ệ

loài

TRÊN Đ I T Ố ƯỢ NG LÀ VIRUS C N CÓ  Ầ

NH NG L U Ý GÌ TRONG PH N  NG ? Ữ Ư Ả Ứ

 Ho t tính RNase H: ho t tính RNase cho phép phá h y đ c hi u RNA trong ph c h p (RNA­ạ ạ ủ ặ ệ ứ ợRNA b  tr ), hi n tổ ợ ệ ượng này không có l i cho PCR n u quá trình phá h y khuôn m u RNA ợ ế ủ ẫ

c nh tranh v i quá trình t ng h p DNA  khi t o s i DNA đ u tiên. Nói cách khác n u trong ạ ớ ổ ợ ạ ợ ầ ế

ph n  ng test virus ta b  sung thêm RNase thì ph n  ng chuy n RNA s  không đ t k t quả ứ ổ ả ứ ể ẽ ạ ế ả

 Enzmye phiên mã ngược ( ReverseTransciptase): các enzyme ReverseTransciptase ph  ụthu c RNA, xúc tác quá trình t ng h p RNA­>DNA đ u tiên sau đó DNApolimerase m i th c ộ ổ ợ ầ ớ ự

hi n ph n  ng t ng h p chu i DNA c a virus.ệ ả ứ ổ ợ ỗ ủ

M T VÍ D  V  XÉT NGHI M VIRUS  Ộ Ụ Ề Ệ

DÂU TÂY(Strawberry)

 B y virus r p truy n qua đả ệ ề ường 

được tái chuy n trong dâu tây:ể

Trong đó: SCV, SMYEV, SMoV, và SVBV đã đ ượ c coi 

là b n virus quan tr ng nh t v  kinh t  c a dâu tây ố ọ ấ ề ế ủ

A: xu t hi n hóa đ  trên toàn vấ ệ ỏ ườn, tang trưởng không đ uề

B: các dãi đ  lây lanỏ

C: c n c nh s  hóa đ , còi c c, méo mó qu  nh  c a dâuậ ả ự ỏ ọ ả ỏ ủ

 Ảnh điên di phân tích k t qu  test virus trên m t s  ế ả ộ ố

ch ng dâu tây ph  bi n t i Đà L tủ ổ ế ạ ạ

 Các tri u ch ng suy gi m trong cây dâu tây:ệ ứ ảA: m ch d n hóa đạ ẫ ỏ

B: lá bi n d ng, m ch d n hóa đ , t n thế ạ ạ ẫ ỏ ổ ương trên cu ng ốlá

M  R NG:  Ở Ộ PCR ĐA M I­ MULTIPLEX PCR Ồ

 Multiplex PCR là phương pháp s  d ng nhi u c p m i cùng lúc đ  khu ch đ i ử ụ ề ặ ồ ể ế ạ

nhi u khu v c trên trình t  DNA đích, có th  s  d ng kĩ thu t này đ  đ nh nhóm ề ự ự ể ử ụ ậ ể ị

ho c phân lo i virus b ng các trình t  Nucleic acidặ ạ ằ ự

 Trong m t xét nghi m đ  tăng đ  tin c y cho k t qu  và ti t ki m th i gian, chi phí, ộ ệ ể ộ ậ ế ả ế ệ ờ

ph n  ng c n đả ứ ầ ược “Mix” h n h p m i ta có th  phát hi n cùng lúc nhi u virus trên ỗ ợ ồ ể ệ ềcùng m t m u. Do tính ch t đ c hi u c a m i nên vi c ph i h p s  đ t hi u qu  ộ ẫ ấ ặ ệ ủ ồ ệ ố ợ ẽ ạ ệ ảcao trong xét nghi m mà không làm  nh hệ ả ưởng đ n k t qu  thí nghi mế ế ả ệ

Ph n  ng multiplex PCR có th  chia thành 2 lo i:ả ứ ể ạ

 a) Ph n  ng multiplex PCR dùng m t khuônả ứ ộ

 Phương pháp này s  d ng m t lo i khuôn, thử ụ ộ ạ ường là ADN h  gen, cùng v i các c p ệ ớ ặ

m i (các m i xuôi và m i ngồ ồ ồ ược) đ  khu ch đ i m t vùng gen c  th  có ch a trong ể ế ạ ộ ụ ể ứ

Ph n  ng  ả ứ ELISA

Đ t v n đ : ặ ấ ề

 Ngoài vi c xét nghi m các b nh lí do sinh v t gây ra, trong nông nghi p vi c s  d ng các ệ ệ ệ ậ ệ ệ ử ụ

lo i hóa ch t, thu c b o v  th c v t (BVTV) cũng là m t y u t  h t s c quan tr ng. D  ạ ấ ố ả ệ ự ậ ộ ế ố ế ứ ọ ư

lượng thu c BVTV trong nông s n hi n nay là v n đ  c a xã h i. ELISA­ m t phố ả ệ ấ ề ủ ộ ộ ương pháp xét nghi m đã đệ ượ ức  ng d ng t  lâu trong xét nghi m các b nh lí, g n đây phát tri n theo ụ ừ ệ ệ ầ ể

hướng ki m tra, đánh giá m c đ  ô nhi m d  lể ứ ộ ể ư ượng các h p ch t BVTV trong nông s n và ợ ấ ảtrong môi trường sinh thái nông nghi pệ

Đ nh nghĩa ị :

E LISA ( Enzyme­Linked 

ImmunoSorbent Assay_ Xét nghi m  ệ

h p thu mi n d ch liên k t v i enzyme ấ ễ ị ế ớ ) 

d a trên s  k t h p gi a kháng  ự ự ế ợ ữ

nguyên và kháng th  đ c hi u, ph n  ể ặ ệ ả

Nguyên t c: ắ

S  d ng KT đ n dòng(Mabs) ph  b   ử ụ ơ ủ ề

m t nh ng đĩa gi ng. N u có s  hi n  ặ ữ ế ế ự ệ

di n c a KN trong m u,KN s  t o  ệ ủ ẫ ẽ ạ

Ðĩa plastic s  d ng đ  ti n hành xét nghi m  ử ụ ể ế ệ ELISA 

Có hai ph ươ ng pháp xét nghi m  ệ ELISA:

 Phương pháp ELISA gián ti p(indirect ELISA): dùng đ  phát hi n kháng th  ế ể ệ ểchuyên bi t trong huy t thanh ệ ế

  Phương pháp ELISA tr c ti p( direct ELISA): dùng đ  phát hi n kháng nguyên ự ế ể ệtrong m u xét nghi m.ẫ ệ

Các lo i enzyme th ạ ườ ng dùng:

 Alkaline phosphatase

 Peroxydase

 Glucoxydase

 β­galactosidase

 b  KIT Elisa. ộ

u đi m:

Ư ể

Nh ượ c đi m: ể   đ  chính xác không cao ộ

Ph ươ ng pháp ELISA c nh tranh dùng  ạ

m t Enzyme đánh d u t o nên c ng h p enzyme có kh  năng liên k t v i kháng ộ ấ ạ ộ ợ ả ế ớ

th   Khi cho d ch chi t m u và c ng h p enzyme vào trong các gi ng, thu c tr  ể ị ế ẫ ộ ợ ế ố ừsâu trong d ch chi t và c ng h p enzyme s  cùng c nh tranh nhau đ  liên k t v i ị ế ộ ợ ẽ ạ ể ế ớkháng th  Sau khi r a trôi nh ng ch t d  th a sau p  c  ch t tể ữ ữ ấ ư ừ ư ơ ấ ương  ng v i ứ ớ

enzyme s  đẽ ược cho vào dướ ựi s  xúc tác c a các enzyme p  t o màu hay phát ủ ư ạ

hu nh quang s  xu t hi n trong gi ng. Thu c tr  sâu nhi u thì c ng h p enzyme ỳ ẽ ấ ệ ế ố ừ ề ộ ợ

do kém c nh tranh nên kháng th  gi  l i ít màu s  nh t và ngạ ể ử ạ ẽ ạ ượ ạc l i

Trong ki u (2) c ng h p gi a KN­ Protein s  để ộ ợ ữ ẽ ược c  đ nh trên b  m t r n. Thu c ố ị ề ặ ắ ố

tr  sâu và m t lừ ộ ượng kháng th  c  đ nh để ố ị ược cho vào, thu c tr  sâu là m t KN t  ố ừ ộ ự

do s  c nh tranh v i KN c  đ nh bám vào KT. Lẽ ạ ớ ố ị ượng KN t  do càng nhi u thì KT ự ề

b  KN gi  c  đ nh càng ít. Sau khi r a trôi ch t th a sau p  ngị ữ ố ị ữ ấ ừ ư ười ta dùng m t KT ộ

th  2 có đánh d u b ng enzyme đ  phát hi n KT ban đ u b  gi  l i. T  đó ta có ứ ấ ằ ể ệ ầ ị ữ ạ ừ

th  đ nh lể ị ượng được thu c tr  sâu trong m u.ố ừ ẫ