Khóa luận tốt nghiệp ngành Công nghệ sinh học: Ảnh hưởng của lớp mỏng tế bào lên sự phát sinh hình thái của cây hoa Anh thảo (Cyclamen persicum)

Khóa luận tốt nghiệp ngành Công nghệ sinh học: Ảnh hưởng của lớp mỏng tế bào lên sự phát sinh hình thái của cây hoa Anh thảo (Cyclamen persicum) được nghiên cứu nhằm tìm ra môi trường giúp phát sinh hình thái tối ưu dựa trên các chất điều hòa sinh trưởng cần thiết. Các thí nghiệm được tiến hành trên giống Cyclamen persicum – được xem là giống đem lại lợi nhuận nhất.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT

KHOA SINH HỌC

-

HOÀNG TRẦN MINH THU

ẢNH HƯỞNG CỦA LỚP MỎNG TẾ BÀO LÊN

SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI CỦA CÂY HOA

ANH THẢO (Cyclamen persicum)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC KHÓA 29

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đà lạt, 5/2009

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT

KHOA SINH HỌC

-

ẢNH HƯỞNG CỦA LỚP MỎNG TẾ BÀO LÊN

SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI CỦA CÂY HOA

ANH THẢO (Cyclamen persicum)

Cán bộ hướng dẫn: TS Dương Tấn Nhựt

ThS Nguyễn Văn Bình Sinh viên thực hiện: Hoàng Trần Minh Thu

Đà lạt, 5/2009

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Những kết quả và số liệu trong khóa luận này chưa được ai công bố dưới bất kỳ hình thức nào Đây là một

phần nghiên cứu trong đề tài “Nghiên cứu hệ thống tái sinh và bước đầu chuyển gen vào cây hoa Anh Thảo (Cyclame spp.)” do ThS Nguyễn Văn Bình chủ trì,

Viện Sinh học Tây Nguyên cấp kinh phí Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan này

LỜI CẢM ƠN

Tôi rất tâm đắc câu chuyện về hai anh thợ xây khi nói về công việc của mình như sau Khi hai người đang xây bức tường của một tòa nhà, một người đi ngang qua và hỏi anh công nhân thứ nhất: “Anh bạn đang làm gì thế?” Anh ta nói rằng mình đang trộn hồ, đặt các viên gạch lên và xây tường: “Công việc này chẳng có gì là thú vị, thậm chí nó còn chán ngắt, vô cùng cực nhọc và chẳng kiếm được nhiều tiền” Người này bước đến hỏi anh công nhân thứ hai đang mải mê làm việc cũng cùng câu hỏi trên, nhưng thật bất ngờ khi nghe câu trả lời: “Tôi là người may mắn nhất thế giới vì thành quả công việc của tôi góp phần tạo nên những công trình kiến trúc quan trọng và đẹp mắt Tôi biến những viên gạch nhỏ bé tầm thường này thành những kiệt tác vĩ đại và tồn tại mãi với thời gian”

Trước hết, em xin tỏ lòng biết ơn đến Thầy – Tiến sĩ Dương Tấn Nhựt Cảm ơn

những hành trang, kiến thức vô cùng quý giá mà Thầy đã trang bị cho em Cảm ơn những đêm không ngủ, những bữa ăn muộn để giúp em hoàn thành tốt luận văn Cảm ơn Thầy

đã biến những viên gạch ý tưởng, những viên gạch đam mê khoa học nhỏ bé của chúng

em lớn dần lên Thật may mắn khi đến cuối chặn đường sinh viên, bắt đầu bước chân vào đời, em được gặp Thầy Thầy không chỉ dạy cho em biết những kiến thức về khoa học mà Thầy còn dạy em biết về cách sống, đạo làm người để em dần hoàn thiện con người mình Xin gửi đến Thầy mọi lời chúc tốt đẹp nhất

Gửi lời cảm ơn chân thành đến Thạc sĩ Nguyễn Văn Bình – người đã tận tình

hướng dẫn em thực hiện đề tài này Cảm ơn những kinh nghiệm quý báu, những lời khuyên, lời động viên từ một người thầy, người anh như anh Nhờ vào đó mà em nhận ra

sự nổ lực của bản thân quan trọng đến vậy Gửi lời chúc thành công, thành công, thành công và hạnh phúc nữa sẽ đến với anh

Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô bộ môn trường Đại Học Đà Lạt đã tạo điều kiện thuận lợi giúp em thực tập tại Viện Sinh học Tây Nguyên để hoàn thành luận văn này

Kế đến, em xin cảm ơn chị Phượng, chị Thu Ba, chị Hiền, anh Luận, anh Nam cũng

như toàn thể cán bộ, nhân viên phòng Sinh học Phân tử và chọn tạo giống cây trồng thuộc Viện Sinh học Tây Nguyên đã giúp đỡ rất nhiều trong suốt quá trình em thực hiện khóa luận này

Cảm ơn anh Tâm, chị Phượng, anh Bá Nam, anh Tuấn, anh Sơn, anh Tùng, anh

Công, anh Huy Cảm ơn các bạn Hương, Thùy, Hoàn Anh, Loan, Chiến, Nguyễn, Kha, Thưởng, Thương, Kim Cương, Thành, các bạn đã luôn bên Thu trong những tháng ngày

vui vẻ nhiều mà vất vả cũng không ít Được học tập và làm việc cùng các anh chị và các bạn, giúp em hiểu không chỉ có kiến thức, sự tận tụy và khéo léo mà cần phải có niềm đam mê thực sự, niềm đam mê xuất phát từ chính những người trẻ với sự khát khao thành công

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến Ba Mẹ, Ba Mẹ đã cho con cuộc sống, cho

con tình thương của một gia đình trọn vẹn Cảm ơn Hai, Vy, Chi, anh Chương, Ni, Na,

Ford, Euro vì đã là người một nhà với em Gửi lời cảm ơn đến những người bạn vô cùng

thân thiết của Thu: Hải Đường, Anh Thư, Hạ Dung, Đình Nghị, Tiến, Duy Anh đã giúp

đỡ, ủng hộ và luôn bên cạnh Thu Và con đặc biệt gửi lời cảm ơn đến dì Loan, dì đã giúp

con chuyển sang con đường mới, không dễ dàng, nhưng nếu được chọn lại, con vẫn chọn con đường này

Đà Lạt, ngày 21 tháng 5 năm 2009

MỤC LỤC

TRANG

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mu ̣c chữ viết tắt i

Danh mục hình ii

Danh mục bảng iii

Danh mục biểu đồ iv

Lời mở đầu v

PHẦN 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 NHÂN GIỐNG IN VITRO 1

1.1.1 Giới thiệu 1

1.1.2 Các bước nhân giống in vitro 1

1.1.3 Một số kỹ thuật nhân giống in vitro 2

1.1.3.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 2

1.1.3.2 Nuôi cấy mô sẹo 2

1.1.3.3 Nuôi cấy tế bào đơn 2

1.1.3.4 Nuôi cấy tế bào trần – chuyển gen 3

1.1.3.5 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội 3

1.2 MỘT SỐ NHƯỢC ĐIỂM ĐÁNG QUAN TÂM CỦA VI NHÂN GIỐNG 3

1.3 HỆ THỐNG NUÔI CẤY LỚP MỎNG TẾ BÀO 4

1.3.1 Giới thiệu 4

1.3.2 Đặc điểm của phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào 5

1.3.3 Ưu điểm của phương pháp 7

1.4 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN IN VITRO CỦA THỰC VẬT 7

1.4.1 Ảnh hưởng của mẫu cấy đến khả năng phát sinh hình thái của cây 7

1.4.2 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật 12

1.4.2.1 Auxin 12

1.4.2.2 Cytokinin 13

1.4.2.3 Ảnh hưởng của TDZ lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật 14

1.5 SƠ LƯỢC VỀ HOA ANH THẢO 16

1.5.1 Phân loại 16

1.5.2 Đặc điểm của hoa Anh thảo 16

1.5.3 Giá trị kinh tế của hoa Anh thảo 17

1.5.4 Những nghiên cứu in vitro được tiến hành ở hoa Anh thảo 18

PHẦN 2 – VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP

2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH ĐỀ TÀI 20

2.2 MỤC ĐÍCH ĐỀ TÀI 20

2.3 VẬT LIỆU 20

2.3.1 Nguồn mẫu 20

2.3.2 Khử trùng mẫu 21

2.3.3 Môi trường nuôi cấy 21

2.3.4 Điều kiện thí nghiệm 22

2.4 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 22

2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ các loại auxin (2,4-D, IBA, NAA) lên khả năng khởi tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào của phát hoa cây Anh thảo 22

2.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của TDZ kết hợp với các loại auxin (2,4-D, IBA, NAA) lên khả năng khởi tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào của phát hoa cây Anh thảo 23

2.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của TDZ, BA hoặc Kinetin kết hợp với 2,4-D lên khả năng tăng sinh mô sẹo của cây hoa Anh thảo in vitro 25

2.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của BA, Kinetin kết hợp với IBA hoặc NAA lên khả năng phát sinh chồi của hoa Anh thảo in vitro 26

2.4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của BA và Kinetin lên khả năng tăng sinh và kéo dài chồi của cây hoa Anh thảo in vitro 27

2.4.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của IBA, NAA lên sự hình thành rễ của cây hoa Anh thảo in vitro 28

2.5 PHÂN TÍCH SỐ LIỆU 28

2.5.1 Tính trung bình và phương sai của mẫu 28

2.5.2 Vẽ biểu đồ 29

PHẦN 3 – KẾT QUẢ & THẢO LUẬN 3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ các loại auxin 2,4-D, IBA, NAA lên khả năng khởi tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào của phát hoa cây Anh thảo 30

3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của TDZ kết hợp với các loại auxin (2,4-D, IBA, NAA) lên khả năng khởi tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào của phát hoa cây Anh thảo 32

3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của TDZ, BA hoặc Kinetin kết hợp với 2,4-D lên khả năng tăng sinh mô sẹo của cây hoa Anh thảo in vitro 36

3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của BA, Kinetin kết hợp với IBA, NAA lên khả năng phát sinh chồi cây hoa Anh thảo in vitro 40

3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của BA và Kinetin lên khả năng tăng sinh và kéo dài chồi của cây hoa Anh thảo in vitro 43

3.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của IBA và NAA lên sự tạo rễ của cây hoa Anh thảo in vitro 46

PHẦN 4 – KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận 50

4.2 Đề nghị 51

PHẦN 5 – TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

Tài liệu tiếng Anh

Phụ lục

CHỮ VIẾT TẮT

Chất điều hòa sinh trưởng:

BA : 6-Benzyl adenin

GA 3 : Gibberellic acid

IAA : Indole-3-acetic acid

IBA : Indole-3-butyric acid

NAA : α-Naphthalene acetic acid

TDZ : Thidiazuron

Môi trường:

MS : Murashige và Skoog, 1962

WPM : Woody plant medium (môi trường nuôi cấy cây thân gỗ)

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Một số giống hoa Anh thảo (Cyclamen sp.)

Hình 2 Hoa Anh thảo

Hình 3 Cây hoa Anh thảo sử dụng làm nguồn mẫu

Hình 4 Sơ đồ tóm tắt quy trình nhân giống hoa Anh thảo (Cyclamen persicum) bằng

phương pháp lớp mỏng tế bào phát hoa

Hình 5 Ảnh hưởng của các loại auxin (2,4-D, IBA, NAA) lên khả năng khởi tạo mô

sẹo từ lớp mỏng tế bào của phát hoa cây Anh thảo

Hình 6 Ảnh hưởng của TDZ kết hợp với các loại auxin (2,4-D, IBA, NAA) lên khả

năng khởi tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào của phát hoa cây hoa Anh thảo

Hình 7 Ảnh hưởng của TDZ, BA, Kinetin kết hợp với 2,4-D lên khả năng tăng sinh mô

sẹo của hoa Anh thảo

Hình 8 Ảnh hưởng của BA, Kinetin kết hợp với IBA, NAA lên khả năng phát sinh chồi

của hoa Anh thảo

Hình 9 Ảnh hưởng của BA và Kinetin lên khả năng tăng sinh và kéo dài chồi của hoa

Anh thảo

Hình 10 Ảnh hưởng của IBA và NAA lên khả năng tăng sinh trưởng rễ của hoa Anh

thảo

Hình 11 Cấu tạo giải phẫu chồi in vitro của hoa Anh thảo

Hình 12 Hình chụp soi nổi mẫu mô sẹo hoa Anh thảo

Hình 13 Hình chụp soi nổi chồi in vitro hoa Anh thảo

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Nồng độ các loại auxin (2,4-D, IBA, NAA) trong môi trường khởi tạo mô sẹo Bảng 2.2 Nồng độ TDZ kết hợp với các loại auxin (2,4-D, IBA, NAA) trong môi trường

khởi tạo mô sẹo

Bảng 2.3 Nồng độ của TDZ, BA, Kinetin kết hợp với 2,4-D trong môi trường tăng sinh

mô sẹo

Bảng 2.4 Nồng độ của BA, Kinetin kết hợp với IBA hoặc NAA trong môi trường phát

sinh chồi

Bảng 2.5 Nồng độ của BA và Kinetin trong môi trường tăng sinh và kéo dài chồi

Bảng 2.6 Nồng độ của IBA và NAA trong môi trường tạo rễ

Bảng 3.1 Hình thái mô sẹo từ mẫu cấy lớp mỏng tế bào của phát hoa cây Anh thảo

trong môi trường bổ sung các loại auxin

Bảng 3.2 Hình thái mô sẹo từ mẫu lớp mỏng tế bào của phát hoa cây Anh thảo trong

môi trường bổ sung TDZ kết hợp với các loại auxin

Bảng 3.3 Khả năng tăng sinh mô sẹo của cây hoa Anh thảo trong môi trường bổ sung

TDZ, BA, Kinetin kết hợp với 2,4-D

Bảng 3.4 Khả năng phát sinh chồi từ mô sẹo của cây hoa Anh thảo trong môi trường bổ

sung BA, Kinetin kết hợp với IBA và NAA

Bảng 3.5 Khả năng tăng sinh và kéo dài chồi của cây hoa Anh thảo trong môi trường có

bổ sung BA và Kinetin

Bảng 3.6 Khả năng tạo rễ từ chồi của hoa Anh thảo trong môi trường có bổ sung IBA

và NAA

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 1 So sánh ảnh hưởng của TDZ kết hợp với các loại auxin (2,4-D, IBA, NAA) ở

các nồng độ khác nhau lên sự khởi tạo mô sẹo của hoa Anh thảo

Biểu đồ 2 So sánh ảnh hưởng của TZD, BA, Kinetin kết hợp với 2,4-D ở các nồng độ

khác nhau lên sự tăng sinh mô sẹo của hoa Anh thảo

Biểu đồ 3 So sánh ảnh hưởng của BA, Kinetin kết hợp với IBA, NAA ở các nồng độ

khác nhau lên sự hình thành chồi của hoa Anh thảo

Biểu đồ 4 So sánh ảnh hưởng của BA, Kinetin ở các nồng độ khác nhau lên

khả năng tăng sinh và kéo dài chồi của hoa Anh thảo

Biểu đồ 5 So sánh ảnh hưởng của IBA và NAA ở các nồng độ khác nhau lên khả năng

tăng sinh trưởng rễ của hoa Anh thảo

LỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay khi khoa học kỹ thuật phát triển, đời sống con người được nâng cao, các nhu cầu thẫm mỹ ngày càng được chú trọng hơn Nhu cầu chơi và trồng hoa trang trí trở thành một phần không thể thiếu trong cuộc sống Trong thế giới hoa muôn màu muôn vẻ, hoa Anh thảo là một trong những đối tượng mới được biết đến ở nước ta, có giá trị kinh tế cao và rất được ưa chuộng do sự đa dạng về màu sắc, chủng loại, cũng như hình dáng rất đặc trưng và lạ mắt của loài hoa này

Những tiến bộ trong công nghệ sinh học cùng với những thành tựu trong nuôi cấy

mô và tế bào thực vật là một trong những động lực thúc đẩy chúng ta ngày càng tìm ra nhiều phương pháp tối ưu hơn trong nhân giống các loài hoa Việc ứng dụng công nghệ sinh học phần lớn là kỹ thuật nuôi cấy mô và các phương pháp sinh học tế bào, kỹ thuật chuyển gene đã không chỉ rút ngắn quy trình nhân giống mà còn cho phép các nhà khoa học khắc phục một số vấn đề quan trọng trong nông nghiệp và môi trường Trong đó, việc ứng dụng hệ thống lớp mỏng tế bào đã tạo ra bước nhảy vọt mang lại nguồn nguyên liệu

to lớn trong nhân giống

Các nhà khoa học đã sử dụng nhiều phương thức khác nhau để nghiên cứu về quá trình phát sinh hình thái từ các bộ phận của cây hoa Anh thảo Do đó, trong đề tài này,

mục tiêu đặt ra là sử dụng hệ thống lớp mỏng tế bào để khảo sát sự phát sinh hình thái của cây hoa Anh thảo Nhờ đó chúng tôi tìm ra môi trường giúp phát sinh hình thái tối

ưu dựa trên các chất điều hòa sinh trưởng cần thiết Các thí nghiệm được tiến hành trên

giống Cyclamen persicum – được xem là giống đem lại lợi nhuận nhất Môi trường khởi

tạo mô sẹo, tăng sinh mô sẹo, hình thành chồi, kéo dài chồi và tạo rễ tối ưu là những mục tiêu hàng đầu đặt ra nhằm nâng cao hệ số nhân giống, tạo cây khỏe mạnh và góp phần giảm giá thành cây trồng cho phù hợp với túi tiền người chơi hoa Việc dùng phát hoa làm

nguyên liệu nuôi cấy sẽ giúp nhân giống in vitro hoa Anh thảo thuận lợi và hiệu quả hơn

Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09

Phần 1

TỔNG QUAN

TÀI LIỆU

1.1 NHÂN GIỐNG IN VITRO

1.1.1 Giới thiệu

Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô và tế bào thực vật đều là thuật ngữ mô tả các

phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng Môi trường có các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hormone sinh trưởng và đường Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa hoặc rễ Trước kia người ta dùng phương pháp nuôi cấy tế bào và mô thực vật để nghiên cứu đặc tính cơ bản của tế bào như

sự phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hưởng của các hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy

Trong 30 năm trở lại đây, nuôi cấy mô thực vật đã đạt những thành tựu to lớn trong việc phục tráng và nhân giống cây sạch bệnh Phương pháp này có những ưu điểm sau:

 Tạo được số lượng cây giống lớn và đồng nhất trong thời gian ngắn với diện tích thí nghiệm nhỏ và có điều kiện lý hóa kiểm soát được

 Tạo được nhiều cây con từ mô và cơ quan của cây (lóng, thân, phiến lá, hoa, hạt phấn, chồi phát hoa) mà ngoài tự nhiên không thực hiện được

 Tạo cây sạch virus bằng cách nuôi cấy mô phân sinh ngọn

 Dễ dàng tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chuyển gen

1.1.2 Các bước nhân giống in vitro

Nhân giống cây trồng in vitro gồm các bước cơ bản sau:

 Tạo thể nhân giống in vitro

 Nhân giống in vitro

 Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro

 Chuyển cây in vitro ra vườn ươm

1.1.3 Một số kỹ thuật nhân giống in vitro

1.1.3.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Một phương thức nhân giống hiệu quả trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (từ chồi đỉnh và chồi bên) Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ chất dinh dưỡng khoáng vô cơ, hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thích hợp Từ một đỉnh sinh trưởng, sau một khoảng thời gian nuôi cấy nhất định, mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi Chồi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ để trở thành một cây hoàn chỉnh Cây con được chuyển ra đất dần dần thích nghi và phát triển bình thường

1.1.3.2 Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản biệt hóa của các tế bào đã phân hóa Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự hiện diện của auxin Mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường có chất điều hòa sinh trưởng thích hợp

Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với các loại thực vật không có khả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ Một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma cao

1.1.3.3 Nuôi cấy tế bào đơn

Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt trên máy lắc có tốc

độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng rẽ gọi là tế bào đơn Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng để tăng sinh khối Với các cơ chất thích hợp được bổ sung vào trong môi trường, tế bào có khả năng sản xuất các chất có hoạt tính sinh học Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng, tế bào đơn được trải lên môi trường thạch và sau khi môi trường thạch được bổ sung auxin thì chúng phát triển thành từng cụm mô sẹo cho đến khi môi trường có tỷ lệ cytokinin/auxin thích hợp, lúc đó chúng đã có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh

1.1.3.4 Nuôi cấy tế bào trần – chuyển gen

Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose, có sức sống và duy trì đầy đủ chức năng sẵn có Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh (tính toàn thế ở thực vật) Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép tạo giống cây trồng mới Quá trình dung hợp có thể thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài

1.1.3.5 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội

Hạt phấn ở thực vật được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp tạo thành cây hoặc mô sẹo Mô sẹo được tái sinh thành cây đơn bội hoàn chỉnh

1.2 MỘT SỐ NHƯỢC ĐIỂM ĐÁNG QUAN TÂM CỦA VI NHÂN GIỐNG

Những năm 70 của thế kỷ XX là thập niên của sự bùng nổ công nghệ sinh học thực vật Nó là công cụ nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học Điều quan trọng nhất trong vi nhân giống là việc nghiên cứu vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng và sự kích thích hình thành chồi với số lượng lớn

Tuy nhiên, việc ứng dụng các phòng thí nghiệm có công nghệ hiện đại chỉ mới được triển khai nhiều nhất trong vi nhân giống trên đối tượng cây cảnh trang trí Vấn đề này vẫn chưa có sự thay đổi lớn trong suốt 20 năm qua

Bên cạnh đó, còn có một số giới hạn khác trong ứng dụng vi nhân giống đối với tất

cả các loài thực vật:

 Giới hạn về sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống, nghĩa là cây con tạo ra thường ít đồng nhất về mặt kiểu hình

 Tiến trình nhân giống phức tạp (bao gồm nhiều giai đoạn liên quan nhau và kéo dài

5 – 6 tháng trước khi có thể thích ứng trồng ngoài vườn ươm)

 Giá thành sản phẩm nhân giống còn khá cao

 Có thể xảy ra đột biến do tác dụng của các chất điều hòa sinh trưởng thêm vào môi trường

Trong các khó khăn trên, vấn đề hiện đang được quan tâm nhất là giá thành sản phẩm còn cao Theo Kozai và cộng sự (1992), nguyên nhân chính là sự thất thoát do nhiễm khuẩn và nấm trong quá trình nuôi cấy, tỷ lệ sống sót thấp của cây trong giai đoạn

ra mạ, giá nhân công chiếm 60 – 70% tổng giá thành sản phẩm cần thiết trong quá trình cấy chuyền mẫu cấy sang môi trường mới, giá thành trang thiết bị (chiếu sáng, bình nuôi cấy,…) và nguyên liệu cơ bản (đường, agar,…) còn khá cao Việc cấy chuyền lặp lại nhiều lần làm giảm đáng kể sức sinh trưởng và phát triển của thực vật, có khi làm tăng tính bất thường về di truyền cho tế bào ngay cả sự hình thành rễ chính và rễ thứ cấp có thể không thành công Hạn chế nghiêm trọng nhất trong vi nhân giống là tỷ lệ sống sót của

cây thấp sau khi chuyển ra vườm ươm do sự khác biệt lớn giữa điều kiện môi trường in

vitro và ex vitro và sự cần thiết phải nuôi cấy vô trùng bắt buộc phải sử dụng các trang

thiết bị chuyên biệt và đắt tiền

Sự gia tăng giá cả trong suốt những năm 80 của thế kỷ XX là nguyên nhân nhiều phòng thí nghiệm ở nhiều nước phát triển phải đóng cửa Ở Mỹ, chỉ còn khoảng 150 –

180 phòng thí nghiệm còn hoạt động vào cuối thập niên 80 so với 500 phòng vào đầu thập niên này

Tất cả những khó khăn trên được xem như trở ngại to lớn cho việc ứng dụng rộng rãi

vi nhân giống trong nhân giống các giống thực vật có chất lượng cao

1.3 HỆ THỐNG NUÔI CẤY LỚP MỎNG TẾ BÀO

1.3.1 Giới thiệu

Các khái niệm về mạng lưới ức chế, trong đó sự tăng trưởng, phát triển và lão hóa bắt nguồn từ mối tương quan có thể điều chỉnh được giữa: i) cơ quan, mô, tế bào; ii) các cụm tế bào khác nhau; iii) các bào quan trong tế bào đã đưa Trần Thanh Vân đến với khái niệm hệ thống lớp mỏng tế bào (TCL) vào đầu những năm 70 của thế kỷ XX

Thực vật có khả năng tái chương trình hóa (reprogram) các chương trình biệt hóa sự phát triển của cơ thể và có khả năng xây dựng quá trình phân chia chức năng mới, cấu trúc mới (mô sẹo, rễ, chồi, phôi soma và hoa), mẫu phát sinh hình thái mới Trong trường hợp hình thành cấu trúc mới là chồi và phôi soma, cá thể mới có thể hình thành mà không cần quá trình giảm phân và sinh sản hữu tính Sự phát triển bên trong thực vật được kiểm soát về không gian và thời gian trong một mạng lưới các đơn vị khác nhau: cơ quan, mô

và tế bào Nếu như có sự thay đổi trong mạng lưới này thì sự ức chế ở mức cá thể có thể xảy ra Khái niệm về phương pháp TCL là cô lập tế bào từ mạng lưới ức chế này và tái

chương trình chúng bằng nuôi cấy in vitro (Nhựt và cộng sự, 2003)

1.3.2 Đặc điểm của phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào

Hệ thống lớp mỏng tế bào (TCL) bao gồm các mẫu cấy có kích thước nhỏ được cắt

ra từ các bộ phận khác nhau của thực vật (thân, lá, rễ, phát hoa, các bộ phận của hoa, lá mầm, phôi) Nếu mẫu cấy được cắt theo chiều dọc được gọi là lTCL, nếu được cắt theo chiều ngang gọi là tTCL Các lTCL (1 mm × 0.5 hay 10 mm) chỉ chứa một loại mô như lớp đơn của tế bào biểu bì hoặc một vài lớp (3 – 6 lớp) của tế bào vỏ, ngược lại các tTCL (dày khoảng 0,2 đến 0,5 mm hoặc vài mm) bao gồm một số tế bào thuộc các mô khác nhau (mô biểu bì, mô vỏ, thượng tầng, mô ruột hay tế bào nhu mô) (Trần Thanh Vân và Gendy, 1996) tTCL và lTCL có đặc điểm chung là mỏng Đặc điểm mỏng đóng vai trò

quan trọng vì các phân tử đánh dấu sự biệt hóa có thể định vị in situ ở những tế bào đích

hay những tế bào đáp ứng Quá trình định vị này cho phép giới hạn các tế bào cảm ứng không mong muốn (Trần Thanh Vân, 2003)

Khi cắt mẫu, mô thực vật bị thương, nhiều enzyme hoặc các polysaccharide sinh ra rất cần cho quá trình cảm ứng sự sinh trưởng và phát triển của thực vật (Trần Thanh Vân

và Mutaftschiew, 1990) Lý do cơ bản của việc ứng dụng một vài tế bào trong hệ thống TCL là chúng có mối liên hệ mật thiết với các tế bào bị thương (nơi xảy ra tổng hợp cấu tạo vách tế bào mới và nơi phóng thích của oligosaccharide) và chất dinh dưỡng cùng với các yếu tố khác bên trong môi trường để “kiểm soát” sự phát sinh hình thái Tuy nhiên, cũng bởi lý do đó có thể nói chúng khá phụ thuộc vào môi trường Ngược lại, các mẫu

cấy lớn hơn (như thân hoặc các mảnh lá) cho thấy sự phân cực mạnh trong phản ứng với môi trường và chúng có thể chứa các hợp chất nội sinh cao hơn, bao gồm các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (plant growth regulators – PGRs) nên chúng không phụ thuộc nhiều vào môi trường

Một hệ thống đa bào như hệ thống TCL được định nghĩa như trên mang những tổ chức không gian và thời gian cố hữu Khác với khi sử dụng một tế bào tách ra hay tế bào trần, sau khi tách chúng tạo nên vách tế bào và hình thành nên cụm tế bào mới với tổ chức không gian và thời gian khác biệt với sự hỗ trợ trước khi tiến hành quá trình tách ra từ mô hay cơ quan cho Hơn nữa, hầu hết các trường hợp trong quá trình phát triển của tế bào đơn hay tế bào trần có sự hình thành một lượng nhỏ mô sẹo, phôi soma trộn lẫn tế bào không phải là phôi như các tế bào ống và rễ Ngược lại, hệ thống TCL có sự hình thành những thành phần đó với số lượng lớn hơn Không những chúng được tiếp xúc trực tiếp với môi trường mà còn được chương trình hóa một cách riêng biệt hoặc kết hợp tương ứng với không gian và thời gian (Trần Thanh Vân, 1973; 1974; 1981)

Việc giảm số lượng tế bào trong phương pháp lớp mỏng tế bào có ý nghĩa quan trọng vì ảnh hưởng đến quá trình phát triển hoặc các chương trình biệt hóa mô, cơ quan Các chương trình biệt hóa có thể thay đổi từ việc thay đổi mối tương quan giữa cơ quan

và mô nuôi cấy với kích thước của chúng khi nuôi trên môi trường có cùng tính chất Lát cắt dọc được dùng phổ biến và các dạng phát sinh hình thể mong muốn có thể tạo được qua việc điều khiển mức độ tác động của các nhân tố ngoại sinh

Bên cạnh đó, khoảng thời gian để quá trình phát sinh hình thái xuất hiện tương đối ngắn (trung bình khoảng 14 ngày sau khi cấy) Tần số cũng khá cao, gần 100% mẫu có phản ứng Cường độ của các cơ quan được thiết lập trước, do đó tỷ số giữa số lượng tế bào phản ứng và tế bào hiện diện trên mẫu TCL là rất cao Ví dụ như trên một mẫu lTCL

của cây thuốc lá (Nicotiana tobacum) có kích cỡ 1 × 10 mm bao gồm 3 – 6 lớp tế bào

biểu bì và được thu nhận từ cánh hoa, các cơ quan sau đây được biệt hóa trực tiếp trên bề mặt của TCL (mà không trải qua quá trình mô sẹo trung gian): i) 50 hoa trong chương trình hoa, ii) 500 – 700 chồi trong chương trình chồi, iii) 15 – 20 rễ trong chương trình rễ

Các tính chất mong muốn khác có được trong phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào là sự đồng nhất về sinh lý, di truyền và có thể ứng dụng phương pháp này cho mọi thực vật Tuy nhiên, điều kiện môi trường lý tưởng phù hợp cho sự tồn tại của mẫu TCL

phụ thuộc vào loài và đòi hỏi chúng ta phải thử nghiệm lại tất cả các điều kiện nuôi cấy in

vitro bao gồm PGRs, chất dinh dưỡng, ánh sáng, sự thẫm thấu nhiệt độ (Trần Thanh Vân,

1980)

1.3.3 Ưu điểm của phương pháp

 Diện tích tiếp xúc của mẫu với môi trường lớn nên mẫu dễ dàng hấp thu các chất dinh dưỡng từ môi trường

 Dễ định vị vùng cho phản ứng do chỉ có một lớp mỏng tế bào

 Lượng hormone nội sinh trong mẫu thấp vì thế các chất điều hòa sinh trưởng thực vật dễ tác động lên mẫu

 Mẫu nuôi cấy đồng nhất và nhanh chóng trả lời các cảm ứng

 Tần số phát sinh cơ quan, việc hình thành phôi thấp

 Tạo ra thực vật hoàn chỉnh, ít bị biến đổi

 Không xảy ra sự tương tác giữa các cơ quan và giữa cơ quan với toàn bộ cơ thể thực vật

 Nhanh chóng đạt kết quả trong thời gian ngắn

1.4 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN IN VITRO CỦA THỰC VẬT

1.4.1 Ảnh hưởng của mẫu cấy đến khả năng phát sinh hình thái của cây

Vật liệu nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh

trưởng và phát triển in vitro Những ảnh hưởng có thể được tóm tắt như sau:

 Kiểu gen

Khả năng tái sinh trong giới thực vật rất đa dạng Những cây hai lá mầm thông thường có khả năng tái sinh mạnh hơn cây một lá mầm, cây hạt trần rất khó tái sinh (trừ

khi chúng còn non) Trong số các cây hai lá mầm, Solanaceae, Begoniaceae,

Crassulaceae, Gesneriaceae, Crucferae là những loài dễ tái sinh nhất Nếu một loài dễ tái

sinh cơ quan trong môi trường tự nhiên (các giống lai Saintpaulia ionantha, Begonia rex,

Streptocarpus) thì hầu như dễ tái sinh in vitro Cũng có những trường hợp ngoại lệ như

những đoạn cắt từ lá của Kalanchoe farinacea hầu như không có khả năng hình thành chồi bất định in vivo nhưng có thể thực hiện trong điều kiện in vitro, điều này có thể do sự

hấp thu các chất điều hòa sinh trưởng

 Tuổi của cây

Các mô phôi thường có khả năng tái sinh cao do đó ở ngũ cốc người ta thường dùng phôi và hạt làm vật liệu nuôi cấy mô Khi cây già đi, khả năng tái sinh của chúng cũng giảm theo và các bộ phận của cây non dễ tái sinh hơn như trong trường hợp cây bụi Một vài ví dụ cụ thể chỉ sự khác nhau về khả năng tái sinh và phân chia tế bào giữa cây già và

cây non in vitro: Hedera helix (Stoutemeyer và Britt, 1965), Lunaria annua (Pierik, 1967)

và Anthurium andreanum (Pierik và cộng sự, 1974) Khi mô phân sinh và chồi đỉnh được tách khỏi cây mẹ thì chúng vẫn giữ những đặc tính già hay non trong điều kiện in vitro

tùy vào điều kiện ban đầu Đôi khi qua nhiều lần cấy chuyền, mô phân sinh già từng bước được trẻ hóa do gia tăng khả năng tái sinh và phân chia tế bào Điều này được Hackett

(1985) chứng minh trên những đối tượng như Pinus vinifera, Malus sylvestris,

Cryptomeria japonica Sự hình thành chồi bất định là một trong những phương pháp giúp

trẻ hóa

 Tuổi của mô và cơ quan

Những mô còn non và mềm thường dễ nuôi cấy hơn những mô cứng nhưng cũng có nhiều trường hợp ngoại lệ Các mẫu cấy từ cuống lá còn non tái sinh tốt hơn những mẫu cấy từ cuống lá già do cơ quan của chúng già hơn nên khả năng tái sinh và phân chia tế

bào giảm Chúng ta cần lưu ý rằng khả năng tái sinh của những loài khác nhau tăng lên trong suốt giai đoạn ra hoa: các bộ phận của phát hoa còn non đôi khi tái sinh rất mạnh, ví

dụ như Freesia (Bajaj và Pierik, 1974), Lunaria annua (Pierik, 1967), Primula obconica

(Coumans và cộng sự, 1979)

 Tình trạng sinh lý

Tình trạng sinh lý ảnh hưởng mạnh đến khả năng tái sinh và phân chia tế bào in

vitro Thông thường các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh dưỡng dễ tái sinh hơn trong

giai đoạn sinh sản Các mẫu cấy từ vảy của cây huệ tây ở giai đoạn sinh dưỡng tái sinh tốt hơn những mẫu cấy ở giai đoạn sinh sản (Robb, 1957) Các chồi của cây trong giai đoạn

ngủ đông (cuối thu đầu đông) khó nuôi cấy in vitro hơn chồi của những cây không còn

ngủ (vào mùa xuân trước khi chúng bắt đầu phát triển)

 Tình trạng sức khỏe

Vào thời điểm tiến hành nuôi cấy in vitro, nếu sử dụng các bộ phận của các cây

trong tình trạng khỏe mạnh thì khả năng nuôi cấy thành công hơn Do đó, chúng ta nên chọn mẫu từ những cây khỏe mạnh nhất làm thí nghiệm vì điều này ảnh hưởng đến phần trăm nhiễm và khả năng tái sinh của mẫu sau khi được tách khỏi cây mẹ

 Điều kiện phát triển

Các mẫu cấy từ nguồn mẫu trong tự nhiên phản ứng khác với các mẫu cấy từ nguồn mẫu trong nhà kính Nhìn chung, những vật liệu từ nhà kính (thon dài và vàng hơn) tái

sinh dễ hơn vật liệu bên ngoài, ví dụ như cây Rhododendron (Pierik và Steegmans, 1975) Điều kiện phát triển của những cây nở hoa vào mùa đông như Begonia có ảnh hưởng mạnh đến sự hình thành chồi và rễ bất định trong nuôi cấy in vitro

 Vị trí của mẫu cấy trên cây

Topophysis là hiện tượng mà vị trí của mẫu cấy trên cây có ảnh hưởng đến sự sinh

trưởng phát triển in vitro sau khi tách mẫu Ever (1984) đã khảo sát hiện tượng topophysis

ở cây Pseudotsuga menziesii, ông nhận thấy những chồi ban đầu được tách từ những vị trí thấp trên cây phát triển trong môi trường in vitro tốt hơn và chồi gốc tăng trưởng nhanh

hơn chồi nách Sự hình thành hành bất định của các mẫu cấy lan dạ hương được tách ra từ phần gốc của vảy hành tốt hơn từ phần đỉnh Điều này cũng xảy ra tương tự đối với lily (Robb, 1957) Điều đáng lưu ý là những mô sẹo phát sinh từ những mẫu cấy có nguồn gốc

từ các phần khác nhau của cây như rễ, chồi, cuống lá đều có phản ứng in vitro giống nhau

 Kích thước mẫu cấy

Các cấu trúc nhỏ như tế bào, cụm tế bào và mô phân sinh khó cảm ứng để tăng trưởng hơn những cấu trúc lớn như thân, lá, củ Các phần được tách rời khỏi cây tự nó dự trữ chất dinh dưỡng và hormone, do đó mẫu cấy có kích thước càng lớn càng dễ tái sinh

và phát triển Các bộ phận của cây có chứa nhiều chất dinh dưỡng dự trữ như củ, thân

hành thường dễ tái sinh trên môi trường in vitro hơn những cơ quan ít dự trữ Đối với

những mẫu bị cắt, phần trăm bề mặt bị tổn thương cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh Ảnh hưởng của vết thương lên sự tái sinh của các mẫu cấy từ vảy hành Lily đã được Aartrijk chứng minh vào năm 1984

 Vết thương

Sự tổn thương trên bề mặt mẫu cấy đóng vai trò quan trọng trong sự tái sinh mẫu cấy Bề mặt tổn thương tăng lên làm gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng và các chất điều hòa sinh trưởng đồng thời ethylen được tạo ra nhiều hơn Ngoài ra, chúng ta có thể tăng cường sự hình thành rễ bất định bằng vết thương

 Phương pháp cấy

Các mẫu cấy có thể được đặt trên môi trường theo nhiều cách khác nhau: có cực (thẳng đứng với phần gốc cắm xuống môi trường) hoặc không cực (cắm phần ngọn xuống môi trường) Chồi và rễ thường tái sinh dễ và nhanh khi mẫu được cấy không cực (Pierik

và Steegmans, 1975) Mẫu tái sinh tốt khi được cung cấp đầy đủ oxy nhưng những nhân

tố khác cũng đóng vai trò quan trọng Phần gốc của mẫu cấy không cực có các chất dự trữ không có khả năng khuếch tán vào trong agar do nó không tiếp xúc với môi trường Như

ở trường hợp tất cả cây thuộc họ Amaryllidaceae (Pierik và cộng sự, 1985), sự tái sinh chỉ

xảy ra ở phần gốc của vảy hành, do đó, phương pháp cấy không cực dẫn đến sự hình thành thân hành bất định tốt hơn phương pháp cấy có cực

 Công tác chuẩn bị

Điều kiện sinh lý của vật liệu ban đầu có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của mẫu cấy

in vitro Chúng ta có thể thay đổi tình trạng sinh lý của vật liệu ban đầu bằng các biện

pháp sau:

o Phun chất điều hòa sinh trưởng lên cây mẹ

o Tiêm chất điều hòa sinh trưởng vào vật liệu

o Đặt mẫu cấy ban đầu trong những dung dịch dinh dưỡng có chất điều hòa sinh trưởng (BA, GA3)

 Ảnh hưởng của nguồn carbon dioxid và ánh sáng

Ở những vùng lạnh, những thay đổi trong quá trình sinh trưởng của mẫu cấy xảy ra suốt mùa đông có thể giải thích dựa trên những thay đổi bức xạ Khi giảm 1% ánh sáng sẽ làm giảm 1% năng suất trong nhà kính nhưng mối tương quan này không đóng vai trò trong trường hợp với những cây non (Bruggink, 1987) Những điều kiện ánh sáng trong nhân giống những cây cấy ghép có thể đem lại nhiều lợi ích không chỉ trong giai đoạn vườm ươm mà còn sau khi trồng bên ngoài

 Ảnh hưởng của nhân tố khoáng

Chất khoáng là một trong những nhóm chất dinh dưỡng quan trọng cho sự phát triển

in vitro Có nhiều cách kết hợp muối đa lượng và vi lượng Chaussat và cộng sự (1986) đã

phát triển chương trình máy tính để tính toán hàm lượng muối cần thiết để tạo thành một dung dịch dinh dưỡng với đầy đủ những đặc tính mà chúng ta biết đến (thành phần ion, nồng độ ion, pH) Ngược lại, từ thành phần dung dịch dinh dưỡng, chương trình sẽ cho biết tính chất của dung dịch đó Thông thường các dung dịch stock đậm đặc được sử dụng

để chuẩn bị môi trường dinh dưỡng

Sự kết hợp giữa muối đa lượng và vi lượng phụ thuộc nhiều vào loại cây thí nghiệm Môi trường Murashige và Skoog (1962) là môi trường phổ biến nhất vì hầu hết các loài cây có thể thích nghi được Tuy nhiên chúng ta cần lưu ý rằng dung dịch dinh dưỡng không phải lúc nào cũng thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển vì nồng độ muối

khoáng trong dung dịch quá cao Ví dụ cây đồng tiền rất nhạy cảm với muối đa lượng in

vitro (Pierik và Seger, 1972) Lloyd và McCowm (1980) đã tìm ra một môi trường thích

hợp cho một số loài thân gỗ nhạy cảm với muối gọi là môi trường WPM (woody plant medium)

1.4.2 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự sinh trưởng và phát triển của

thực vật

1.4.2.1 Auxin

Auxin là một chất có nhân indole, có công thức nguyên là C10H9O2N Auxin gồm có hai loại là auxin có nguồn gốc nội sinh được tổng hợp bởi thực vật và auxin tổng hợp do con người tạo ra Các loại auxin thông dụng thường dùng: IAA, IBA, NAA, 2,4-D

Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nó tùy thuộc vào nồng

độ và sự kết hợp của chúng với các chất điều hòa sinh trưởng khác

Auxin tác động lên sự kéo dài tế bào Hiệu quả này là sự tiếp nối cho sự gia tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập nước vào trong tế bào; sự đề kháng của thành tế bào giảm đi và tế bào tự kéo dài ra

Auxin thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện bằng một sự phóng thích ion H+ Ion này gây ra một hoạt tính acid có tác dụng làm giảm tính đề kháng của thành tế bào bởi sự hấp thu ion K+

Tác động lên sự chuyển hóa, đặc biệt nhất là trên sự tổng hợp ARN ribosome

Auxin kích thích sự phân chia tế bào một cách đặc biệt trong quá trình hình thành

mô sẹo và sự hình thành rễ bất định Auxin cũng ức chế sự phát triển của chồi nách và sự hình thành phôi soma trong môi trường nuôi cấy mô sẹo

Tất cả cây trồng đều tổng hợp auxin tùy theo giai đoạn phát triển của chúng Chúng được tổng hợp ở lá non, trong các chồi đang hoạt động, ở phát hoa và ở trên các quả còn non Auxin lưu thông từ đỉnh xuống phần dưới các cơ quan với một sự phân cực rõ ràng được nhìn thấy rõ trên các thực vật còn non Nhưng trong quá trình vận chuyển này, chúng bị oxy hóa do hoạt động của auxin – oxydases, điều này cho thấy các nồng độ auxin luôn cao hơn ở những vùng tổng hợp ra chúng Như vậy auxin hiện diện với nồng

độ vừa đủ ở mức độ các điểm tăng trưởng hoặc ở phát hoa để đảm bảo cho sự nhân giống

và kéo dài tế bào

Đối với một số loài, auxin cần cho sự hình thành rễ từ các đoạn cắt (Erwin và cộng

sự, 1997)

1.4.2.2 Cytokinin

Các cytokinin được khám phá trong quá trình nuôi cấy in vitro Người ta biết rằng

trong môi trường nuôi cấy, việc thêm cytokinin sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc phân chia tế bào và hình thành chồi Cytokinin là các chất adenine được thay thế, chất này được biết qua hai nhóm nội sinh là: Zeatin và IPA (Isopentenyladenine) Cytokinin gồm hai nhóm là cytokinin tự nhiên và cytokinin tổng hợp, trong đó hai loại được sử dụng nhiều nhất là Kinetin và BAP

Cytokinin tác động hiệu quả lên sự phân chia tế bào với sự hiện diện của auxin: auxin tạo điều kiện thuận lợi cho sự nhân đôi ADN và cytokinin cho phép tách rời chromosome

Cytokinin có vai trò trong sự tạo cơ quan thực vật, chúng kích thích mạnh mẽ sự thành lập chồi non, trái lại chúng là chất đối kháng với sự tạo rễ

Cytokinin kích thích lên sự chuyển hóa, bảo vệ các chất chuyển hóa chống lại tác động của enzyme ly giải làm chậm quá trình lão hóa Các chồi nách được xử lý bằng cytokinin sẽ tăng trưởng và cạnh tranh với chồi tận cùng

Tóm lại, cytokinin giúp duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và

định hướng tế bào trong con đường phân hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho nuôi cấy in

vitro

1.4.2.3 Ảnh hưởng của TDZ lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật

TDZ dường như ảnh hưởng đến nhiều nhân tố sinh lý hóa trong tế bào nhưng những nhân tố này có thể có hoặc không liên quan trực tiếp đến sự cảm ứng phát sinh hình thái,

do đó cách thức tác động của TDZ vẫn chưa được hiểu rõ Tuy nhiên những nghiên cứu gần đây về ảnh hưởng của TDZ lên sự phát sinh hình thái giúp chúng ta ngày càng hiểu rõ hơn những cơ chế căn bản của nó

TDZ tương đối bền trong hệ thống tái sinh và vẫn có hoạt tính cao ngay cả sau một thời gian dài được dự trữ trong dung dịch stock Những khám phá gần đây đã chỉ ra rằng các phân tử TDZ hình thành các polymer mạch ngắn trong suốt thời gian dự trữ kéo dài (Murch và cộng sự, chưa xuất bản) Nhiều bài báo cáo trước chỉ ra rằng TDZ có thể hoạt động thông qua những thay đổi của chất điều hòa sinh trưởng nội sinh thực vật một cách trực tiếp hay do stress Những khả năng khác có thể xảy ra như sự biến đổi màng tế bào, mức năng lượng, sự hấp thu và đồng hóa năng lượng

Ngoài ra, TDZ còn đóng vai trò là một cytokinin hữu hiệu trong nuôi cấy cây thân

gỗ Ở nồng độ thấp (< 1 µM), TDZ có thể gia tăng số lượng chồi nách nhiều hơn các cytokinin khác, tuy nhiên TDZ có thể ức chế sự kéo dài chồi Trong một vài trường hợp chúng ta cần chuyển chồi sang môi trường kéo dài chồi chứa TDZ ở nồng độ thấp hay ít các cytokinin có hoạt tính TDZ ở nồng độ cao hơn 1 µM có thể kích thích sự hình thành

mô sẹo, chồi bất định hay phôi soma Quá trình hình thành rễ sau đó có thể không hiệu quả hay một phần bị ức chế bởi hàm lượng TDZ tích tụ Một tác dụng phụ không mong muốn của TDZ là sự hình thành chồi có sọc khi nuôi cấy một số loài cây Tóm lại, nhờ hoạt tính cytokinin cao mà TDZ có những tác dụng tích cực ở các loài thân gỗ, TDZ được

xem như là một trong những cytokinin có hoạt tính nhất trong nhân giống in vitro của

nhiều loài thân gỗ

Có nhiều bằng chứng quan trọng về vai trò của TDZ trong ức chế tạo chồi nách và cảm ứng tạo chồi bất định Nhiều loại cây trồng khác nhau từ những cây ăn quả ở vùng nhiệt đới đến những cây tạo củ đã được tái sinh thông qua sự tạo chồi của TDZ Có nhiều bài báo đề cập về những loài được vi nhân giống bằng TDZ đã được xuất bản trước đây (Huetteman và Preece, 1993; Lu, 1993) Thông thường, khi mẫu cấy được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung hàm lượng cytokinin cao sẽ kích thích tạo chồi hay nhân nhanh chồi

TDZ cho thấy khả năng thúc đẩy sự biệt hóa các cơ quan tăng trưởng có tổ chức trong các mô nuôi cấy ở nồng độ rất thấp và giúp sự tái sinh chồi hiệu quả hơn khi so sánh với các cytokinin khác (Fellman và cộng sự, 1987; Fiola và cộng sự, 1990) Một trong những công dụng hiệu quả nhất của TDZ là khả năng tái sinh các loài thân gỗ (Preece và cộng sự, 1991), ở những loài này sự phát sinh cơ quan chỉ xảy ra khi môi trường được bổ sung một lượng lớn cytokinin loại adenine

TDZ cảm ứng sự phát sinh cơ quan ở nồng độ thấp thông qua việc giảm bớt ưu thế của đỉnh sinh trưởng dẫn đến sự hình thành chồi bất định hay chồi nách trực tiếp trên chồi đỉnh được nuôi cấy (Huetteman và Preece, 1993; Lu, 1993) Thêm vào đó, TDZ được sử dụng ở những loài khó được cảm ứng bởi các cytokinin loại adenine

Hình 1 Một số giống hoa Anh thảo (Cyclamen)

1.5 SƠ LƯỢC VỀ HOA ANH THẢO

Chi : Cyclamen Hình 2 Hoa Anh thảo

Loài : Cyclamen persicum

1.5.2 Đặc điểm của hoa Anh thảo

Hoa Anh thảo là loại cây thân thảo sống lâu năm có hoạt động ngủ hè, với các thân

củ mọc trên mặt đất hay ngầm (xuất hiện từ trụ dưới lá mầm) đường kính 4 – 12 cm, từ đó sinh ra các lá vào cuối mùa đông, cũng như hoa vào mùa thu; các lá bị chết đi về mùa hè tại những khu vực nóng và khô hạn nhất ven Địa Trung Hải để bảo tồn nước Lá hình tròn hay tam giác, dài 2 – 10 cm, rộng 2 – 7 cm và thường điểm các đốm hình móng ngựa màu trắng bạc nhạt xung quanh phần giữa của lá Các đốm này được một số nhà thực vật học cho là một dạng của sự ngụy trang tự nhiên để làm giảm khả năng bị động vật gặm ăn Hoa mọc thành vòng xoắn gồm từ 3 tới 10 hoa, mỗi hoa mọc trên một cuống mảnh dẻ cao

3 – 12 cm, với 5 cánh hoa hợp nhất; có màu từ trắng tới hồng hay tía đỏ, phần lớn có màu hồng nhạt Quả là loại quả nang có 5 khoang, đường kính 1 – 2 cm, chứa nhiều hạt dính nhớt đường kính khoảng 2 mm

Các loài Anh thảo nói chung được trồng để lấy hoa, chúng được trồng trong chậu cả trong và ngoài nhà Một vài loài chịu lạnh có thể trồng ngoài nhà tại các khu vực có khí hậu ôn hòa như khu vực tây bắc châu Âu và vùng ven tây bắc Thái Bình Dương

Loài Anh thảo được những người trồng hoa bán nhiều nhất là C persicum, nó kém

chịu lạnh Một vài giống chọn lọc có thể có hoa màu trắng, hồng tươi, đỏ hay tía Khi nở hoa, cần giữ chúng ở nhiệt độ dưới 20°C (68°F), với nhiệt độ ban đêm dao động trong khoảng từ 7°C (44°F) tới 15°C (59°F) Nhiệt độ trên 20°C có thể khiến cây rơi vào trạng thái ngủ

Tại nhiều khu vực bản địa của chúng, quần thể Anh thảo hoang dại đã bị suy giảm nghiêm trọng do thu hái bất hợp pháp để phục vụ cho mục đích thương mại nên một số loài hiện nay đã rơi vào tình trạng nguy cấp Tuy nhiên, ở một số ít các khu vực khác, các hiệp hội bảo tồn thực vật đã giáo dục người dân địa phương trong kiểm soát việc thu hoạch hoa một cách cẩn thận ở mức độ thích hợp, bao gồm cả việc gieo hạt cho các vụ mùa tương lai, đảm bảo cho cả sự duy trì của các quần thể hoang dại lẫn đảm bảo sự thu nhập dài hạn Nhiều loài Anh thảo cũng được nhân giống trong các vườn ươm mà không gây tổn hại cho các cây hoang dại

Các loài Anh thảo có chứa các chất độc; chúng cũng đã được sử dụng trong y học để làm một loại thuốc sổ mạnh, nhưng độc tính của nó làm cho điều này trở nên khá nguy hiểm

1.5.3 Giá trị kinh tế của hoa Anh thảo

Hoa Anh thảo là một trong những cây trồng chậu phổ biến hiện nay, nó được nhân giống từ hạt giống theo phương diện thương mại, tuy nhiên hạt giống tương đối đắt tiền

và có một vài biến đổi trong việc trồng trọt từ hạt giống

Hoa Anh thảo với hình dáng khá đặc biệt đã trở thành loại cây trang trí có tầm quan trọng chính về kinh tế ở Châu Âu và Nhật Bản Nhưng ở nước ta hiện nay vẫn chưa có phòng thí nghiệm nào nhân giống hoa Anh thảo, vì thế, hoa được bán trên thị trường đa phần là nhập hạt giống hoặc củ giống từ nước ngoài Điều này tạo nhiều bất lợi vì không chủ động được nguồn giống mà còn làm tăng giá thành sản phẩm lên Giá hoa Anh thảo trên thị trường hiện nay là 60.000 – 70.000 VNĐ một chậu

Được biết việc nhân giống hoa Anh thảo cũng có nhiều giới hạn, đặc biệt là việc tạo được điều kiện tối ưu cho cây sau khi cây được đưa ra môi trường bên ngoài Tiêu chuẩn quan trọng nhất để thành công trong việc trồng hoa Anh thảo là nhiệt độ thấp, không khí trong lành và độ ẩm cao Chính điều này đã giúp Đà Lạt trở thành điểm đến đầy tiềm

năng cho loại hoa mới này

1.5.4 Những nghiên cứu in vitro được tiến hành ở hoa Anh thảo

Năm 1991, Kiviharju và cộng sự đã nghiên cứu sự phát sinh phôi vô tính của hoa

Anh thảo (Cyclamen persicum Mill.) dựa vào vật liệu mô cây Phôi vô tính của Cyclamen

persicum Mill có thể được tạo ra thông qua giai đoạn mô sẹo của vật liệu mô non bao

gồm bao phấn, bầu nhụy và phôi hợp tử Môi trường MS có bổ sung 1,0 – 1,5 mg/l 2,4-D

và 10 % v/v nước dừa là yếu tố quan trọng để cảm ứng phát sinh phôi vô tính, phôi vô tính nảy mầm trong môi trường MS không chứa các chất điều hòa sinh trưởng Các cây sau khi được chuyển ra nhà kính vẫn phát triển và ra hoa bình thường và có kiểu hình đồng nhất với cây mẹ, tuy nhiên vẫn có một vài trường hợp ngoại lệ

Năm 2000, Mohannad và Karam đã nhân giống in vitro cây hoa Anh thảo từ mô giống Khi sử dụng mô củ, mô cuống lá, mô lá mầm và mô rễ in vitro cấy vào môi trường

MS có bổ sung 0,1 mg/l NAA và BA tại các nồng độ khác nhau, Mohannad và Karam (2000) đã nhận thấy có sự phát sinh cơ quan Bên cạnh đó, hai ông cũng khảo sát sự phát triển chồi dưới ảnh hưởng của BA, TDZ hoặc Zeatin, cũng như sự tạo rễ của chồi dưới ảnh hưởng của NAA hoặc IBA tại các nồng độ khác nhau Sau khi tiến hành thí nghiệm, Mohannad và Karam đã đưa ra kết quả rằng tỷ lệ hình thành chồi và số lượng chồi lớn nhất thu được từ mô củ khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2 mg/l BA, 0,11 mg/l TDZ hoặc 1 mg/l Zeatin Khi bổ sung NAA hoặc IBA ở nồng độ 0,5 mg/l hoặc 1 mg/l vào

môi trường kết quả thu được 86 – 100 % chồi có tạo rễ Các chồi hình thành rễ in vitro

khi chuyển ra điều kiện nhà kính có khả năng thích nghi tốt

Năm 2008, Prange và cộng sự đã tiến hành nhân giống sinh dưỡng của các loài hoa Anh thảo khác nhau thông qua sự hình thành rễ tự sinh từ mô cây giống Trong khi cây

Cyclamen persicum Miller có giá trị kinh tế quan trọng như một loại cây trang trí phổ biến

trên thế giới, thì chỉ một vài loài trong số 19 loài mang những đặc điểm có giá trị nhằm

đem lại lợi nhuận về kinh tế Để khảo sát những đặc điểm này dưới điều kiện nuôi cấy in

vitro và trong nhà kính thì một phương pháp có hiệu quả trong nhân giống in vitro của các

loài hoa Anh thảo khác nhau đã được thiết lập Những cây giống Cyclamen mirabile Hildebrand, Cyclamen coum Miller, Cyclamen graecum Link và Cyclamen hederifolium

Aiton con vô trùng đã hình thành lá mầm, củ và rễ được sử dụng như vật liệu ban đầu Môi trường 1/2 MS có bổ sung 0,5 mg/l NAA và 1 mg/l BAP hoặc bổ sung 0,5 mg/l IAA,

1 mg/l BAP, 1 mg/l 2iP và 1 mg/l Kinetin là môi trường được sử dụng để cảm ứng tạo chồi Những mô thích hợp nhất cho sự cảm ứng chồi là củ và/hoặc lá mầm tùy thuộc vào loài Khi sử dụng rễ như mô ban đầu có ít chồi hơn hoặc không có chồi hình thành, nhưng

có sự hình thành rễ với tần số cao Trong cùng một loài, đã có những khác biệt rõ ràng về phản ứng của kiểu di truyền đối với sự khác nhau của môi trường Môi trường chứa ít cytokinin cho thấy sự hình thành rễ cao, có thể chứa lượng auxin nội sinh cao trong mô Chỉ có duy nhất một báo cáo về sự chuyển gen là của Aida và cộng sự (1999) Họ đã

mô tả một phương pháp đó là chuyển gen thông qua Agrobacterium Các mép cuống lá úa vàng của cv Anneke bị nhiễm với A tumefaciens giống AGL0 hoặc LBA4404 sử dụng vector plasmid pIG121 Hm bao gồm gen gus reporter, nptII và gen hpt như gen đánh dấu

chọn lọc Các mô được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l TDZ, 1,0 mg/l 2,4-D, 300 mg/l ticarcillin và 5 mg/l hygromycin hoặc 100 mg/l kanamycin trong môi trường chọn lọc, kết quả thu được 103 cây chuyển gen từ 920 mô

Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09

Phần 2

VẬT LIỆU

&

PHƯƠNG PHÁP

2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH ĐỀ TÀI

Đề tài được tiến hành tại phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống cây trồng của Viện Sinh học Tây Nguyên

Thời gian tiến hành đề tài: từ tháng 1 năm 2009 đến tháng 6 năm 2009

2.2 MỤC ĐÍCH ĐỀ TÀI

Đề tài nhằm thiếp lập hệ thống phát sinh hình thái từ lớp mỏng tế bào của phát hoa

cây Anh thảo „Cyclamen persicum‟ nuôi cấy in vitro

Muốn thiết lập được qui trình phát sinh hình thái này chúng ta cần có điều kiện tối

ưu trong quá trình nuôi cấy in vitro để tạo được các nguồn nguyên liệu theo mong muốn

Điều kiện nuôi cấy đó bao gồm điều kiện môi trường nuôi cấy, điều kiện ánh sáng, điều kiện nhiệt độ, điều kiện thoáng khí… Trong các điều kiện nêu trên thì điều kiện môi trường nuôi cấy là quan trọng nhất, với các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác nhau

và với những tỷ lệ khác nhau sẽ góp phần quyết định đến quá trình biệt hóa khác nhau của

mô, tế bào, cơ quan thực vật trong nuôi cấy in vitro

Với thời gian nghiên cứu có hạn, trong đề tài này chúng tôi tập trung khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến khả năng phát sinh mô sẹo, chồi và

rễ của cây hoa Anh thảo nuôi cấy in vitro

2.3 VẬT LIỆU

2.3.1 Nguồn mẫu

Nguồn mẫu được lấy tại Viện Sinh học Tây Nguyên Sử dụng phát hoa cây Anh thảo

ở giai đoạn nụ hoa khi chúng vẫn còn chưa nở, chọn những phát hoa có đường kính 5 – 6

mm, cắt thành từng lớp có chiều dày khoảng 1 – 2 mm

Hình 3 Cây hoa Anh thảo sử dụng làm nguồn mẫu 2.3.2 Khử trùng mẫu

Thao tác khử trùng ngoài phòng cấy: Các phát hoa được rửa sơ bộ dưới vòi nước,

sau đó chúng được ngâm trong dung dịch nước tẩy rửa Sunlight trong 15 phút Để giảm bớt khả năng nhiễm trùng, các phát hoa được đặt dưới vòi nước chảy trong vòng 1 giờ

Thao tác khử trùng trong phòng cấy: Các phát hoa được rửa bằng cồn 70º trong

vòng 30 giây, rồi rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần Sau đó các phát hoa được khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% có nhỏ một vài giọt Tweens 20 (Polyoxyetilen sorbitan monolaurat) và cuối cùng rửa nhẹ nhàng 5 lần trong nước vô trùng

2.3.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường được sử dụng là MS (Murashige và Skoog, 1962) Ngoài các thành phần như khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin còn bổ sung thêm các thành phần như: 30 g/l sucrose, 8,5 g/l agar Môi trường nuôi cấy được chứa trong các bình thủy tinh loại 100 ml

và 250 ml Thể tích môi trường đối với loại bình 100 ml là 25 ml và đối với loại bình 250

ml là 40 ml Tất cả các môi trường nuôi cấy điều chỉnh đến pH = 5,7 bằng NaOH 1N hoặc HCl 10% trước khi hấp khử trùng trong autoclave tại nhiệt độ 121ºC, áp suất 1 atm trong

40 phút

2.3.4 Điều kiện thí nghiệm

Địa điểm: Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro được tiến hành tại phòng thí nghiệm

Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống cây trồng – Viện Sinh học Tây Nguyên

Điều kiện phòng nuôi in vitro:

2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ các loại auxin (2,4-D, IBA,

NAA) lên khả năng khởi tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào của phát hoa cây Anh

thảo

Mục đích thí nghiệm

Khả năng tạo mô sẹo tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy, trong đó chủ yếu là các chất điều hòa sinh trưởng Trong thí nghiệm này, chúng tôi khảo sát môi trường có chứa các loại auxin (2,4-D, IBA hoặc NAA) ở các nồng độ khác nhau lên khả năng cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu phát hoa cây Anh thảo

Mô tả thí nghiệm

Các mẫu phát hoa sau khi khử trùng được cắt thành từng lát mỏng 1 – 2 mm và cấy vào môi trường cảm ứng tạo mô sẹo là môi trường MS có bổ sung 2,4-D, IBA hoặc NAA tại các nồng độ khác nhau như bảng 2.1 Thí nghiệm gồm 15 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 4 lần và mỗi bình cấy 2 mẫu

Bảng 2.1 Nồng độ các loại auxin (2,4-D, IBA và NAA) trong môi trường khởi tạo mô

2,4-D

0,1 0,3 0,5 0,7 1,0

IBA

0,1 0,3 0,5 0,7 1,0

NAA

0,1 0,3 0,5 0,7 1,0

Chỉ tiêu theo dõi

Theo dõi tỷ lệ tái sinh mẫu (%), cân trọng lượng tươi (g) của mô sẹo được hình thành sau 8 tuần nuôi cấy

2.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của TDZ kết hợp với các loại auxin (2,4-D,

IBA, NAA) lên khả năng khởi tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào của phát hoa cây

Anh thảo

Mục đích thí nghiệm

TDZ được xem là một loại cytokinin kích thích quá trình tạo mô sẹo trên mẫu Vì vậy, trong thí nghiệm này, chúng tôi khảo sát hiệu quả của TDZ kết hợp với 2,4-D, IBA hoặc NAA tại các nồng độ khác nhau lên khả năng cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu phát hoa cây Anh thảo