Bài viết trình bày việc xây dựng quy trình định lượng đồng thời methyl paraben và propyl paraben trong vỏ nang mềm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với đầu dò PDA.
Trang 1XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
METHYL PARABEN VÀ PROPYL PARABEN TRONG VỎ NANG MỀM
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VỚI ĐẦU DÒ PDA
Trương Quốc Kỳ*, Võ Hoàng Nam**, Nguyễn An Công**, Đặng Minh Đức**
TÓM TẮT
Mở đầu: Parabens là tên gọi chung của nhóm chất bảo quản được sử dụng phổ biến trong dược phẩm và mỹ
phẩm Các hợp chất này chủ yếu được sử dụng do khả năng diệt khuẩn và diệt nấm của chúng Methyl paraben
và propyl paraben thường được sử dụng làm chất bảo quản trong vỏ nang mềm Trong Dược điển Việt Nam (DĐVN) V không có quy định về giới hạn này trong vỏ viên nang mềm, trong USP 41 giới hạn này được quy định phải dưới 120%
Mục tiêu: Xây dựng quy trình định lượng đồng thời methyl paraben và propyl paraben trong vỏ nang mềm
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với đầu dò PDA
Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Vỏ viên nang mềm có chứa đồng thời hai chất bảo quản methyl
paraben và propyl paraben Các chất bảo quản này được chiết và định lượng bằng kỹ thuật sắc ký lỏng pha đảo với đầu dò PDA Trong quá trình thực nghiệm, các yếu tố ảnh hưởng đến quả tách và tốc độ chọn lọc của phương pháp đã được khảo sát như tốc độ dòng, thành phần và tỷ lệ dung môi pha động
Kết quả: Đã xây dựng quy trình định lượng đồng thời methyl paraben và propyl paraben trong vỏ viên
nang mềm bằng phương pháp HPLC, sử dụng cột Luna C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), pha động gồm methanol – dung dịch đệm kali dihydrophosphat (55:45, tt/tt), bước sóng phát hiện 272 nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút và nhiệt
độ cột 40 0C Kết quả định lượng cho thấy quy trình có tính chọn lọc cao, khoảng tuyến tính từ 3,94 – 13,80 µg/ml cho methyl paraben và từ 1,98 – 6,94 µg/ml cho propyl paraben, độ đúng thể hiện qua tỷ lệ phục hồi nằm trong khoảng 98% - 102% và RSD < 2% đối với độ chính xác
Kết luận: Đề tài này đã xây dựng thành công quy trình HPLC định lượng đồng thời methyl paraben và
propyl paraben trong vỏ nang mềm Quy trình này đã được áp dụng để định lượng methyl paraben và propyl paraben trong vỏ nang mềm của viên Vitar C và viên Cetiboston
Từ khóa: methyl paraben, propyl paraben, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), vỏ nang mềm
ABSTRACT
SIMULTANEOUS QUANTITATIVE DETERMINATION OF METHYL PARABEN AND PROPYL
PARABEN IN SOFT CAPSULE SHELL BY HPLC WITH PDA DETECTOR
Truong Quoc Ky, Vo Hoang Nam, Nguyen An Cong, Dang Minh Duc
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 - No 3- 2019: 378-383
Background: Parabens are a class of preservatives that are widely used in cosmetic and pharmaceutical
products These compounds are mainly used for their bactericidal and fungicidal properties Methyl paraben and propyl paraben are commonly used as preservatives in soft capsule shell In Vietnamese pharmacopoeia V, regulation of parabens in the soft capsule shell is not yet available In USP 41, Limited of parabens should be below 120%
*Bộ môn hóa chuyên ngành, Khoa Dược, Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch
**Công ty cổ phần dược phẩm Boston Việt Nam
Trang 2Objectives: The aim of study was to develop a HPLC-PDA method for simultaneous quantitative
determination of methyl paraben and propyl paraben in soft capsule shell
Methods and Subject: The subject of this study was a soft capsule shell containing methyl paraben and
propyl paraben These parabens were extracted and determined by HPLC with PDA detector Several chromatographic conditions such as mobile phase and flow rate were investigated to improve the column efficiency and selectivity
Results: The appropriate chromatographic condition were found out for simultaneous quantitative
determination of methyl paraben and propyl paraben, using a Luna C18 (150 × 4.6 mm; 5 µm), mixture of methanol and phosphate buffer (55:45, tt/tt) as eluent in isocratic mode, flow rate of 1.0 ml/min, and detection wavelength of 272 nm and column temperature of 40 0C The method was shown high selectivity, wide linearity range from 3.94 – 13.80 µg/ml for methyl paraben and from 1.98 – 6.94 µg/ml for propyl paraben Intra-day standard devitation was below 2% and the recovery range was 98% - 102%
Conclusion: A simple liquid chromatographic method was successfully develop for simultaneous
quantitative determination of methyl paraben and propyl paraben in the soft capsule shell The validated method was applied for quantitative determination of methyl paraben and propyl paraben in the soft capsule of Vitar C and the soft capsule of Cetiboston
Keyword: methyl paraben, propyl paraben, HPLC, soft capsule shell
ĐẶT VẤN ĐỀ
Parabens là tên gọi chung của nhóm chất bảo
quản hóa học, được sử dụng phổ biến và lâu đời
Về mặt hóa học, parabens là một loạt các este của
acid parahydroxybenzoic hay còn được gọi là
acid 4-hydroxybenzoic Các hợp chất này chủ
yếu được sử dụng do khả năng diệt khuẩn và
diệt nấm của chúng(1) và hạn chế sự phân hủy
của các hoạt chất dẫn đến giảm hiệu quả của
dược phẩm, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm
Methyl paraben và propyl paraben được sử
dụng làm chất bảo quản trong vỏ nang mềm
Gần đây có nhiều nghiên cứu cho thấy, các hợp
chất parabens có thể hoạt động tương tự như
hormone oestrogen trong các tế bào của cơ thể
Các hoạt động này có liên quan nhất định đến
bệnh ung thư vú(2) Trong Dược điển Việt Nam
(DĐVN) V không có quy định về giới hạn này
trong vỏ viên nang mềm, trong USP 41 giới hạn
này được quy định phải dưới 120%(3) Vì những
lý do trên, việc kiểm soát các chất bảo quản
parabens trong vỏ nang mềm là rất cần thiết Đề
tài này được thực hiện nhằm mục đích đưa ra
một quy trình phân tích định lượng methyl paraben và propyl paraben trong vỏ nang mềm
ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Vỏ nang mềm có chứa chất bảo quản methyl
paraben và propyl paraben
Trang thiết bị, hóa chất, dung môi
Trang thiết bị
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao của Shimadzu LC-20AD với đầu PDA Máy đo pH Shott 850 Cân phân tích Sartorius BP221S Bể siêu âm Elma Và Các dụng cụ thủy tinh đạt yêu
cầu chính xác dùng trong phân tích
Hóa chất dung môi Chuẩn methyl paraben (viện kiểm nghiệm
thuốc TP Hồ Chí Minh) hàm lượng 99,90% và propyl paraben (viện kiểm nghiệm thuốc TP Hồ
Chí Minh) hàm lượng 99,90% Methanol đạt tiêu
chuẩn dùng trong sắc ký lỏng (Scharlau) Ethanol, kali dihydrophosphat, acid hydrocloric,
natri hydroxyd đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck)
Phương pháp nghiên cứu
Dựa vào cấu trúc của các parabens và tham khảo Dược điển Mỹ (USP 41)(3), kỹ thuật sắc ký
Trang 3lỏng pha đảo được áp dụng với pha động bao
gồm dung dịch đệm phosphate và methanol, sắc
ký đồ được ghi ở bước sóng 272 nm với tốc độ
dòng 1,0 ml/phút với nhiệt độ cột là 40 0C Trong
quá trình thực nghiệm, các yếu tố ảnh hưởng
đến hiệu quả tách và độ chọn lọc của phương
pháp được khảo sát như dung môi pha động và
tỉ lệ pha động được khảo sát và tối ưu để có hệ
số bất đối As từ 0,8 – 1,5 và có hệ số phân giải Rs
≥1,5 Sau khi tìm được điều kiện sắc ký thích
hợp, sẽ tiến hành thẩm định theo hướng dẫn của
ICH(4), bao gồm khảo sát tính phù hợp hệ thống,
khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng Sau
khi được thẩm định, quy trình được ứng dụng
để định lượng một số vỏ nang của chế phẩm
viên nang mềm trên thị trường có chứa các chất
bảo quản này Mức chất lượng áp dụng theo
USP 41
Chuẩn bị mẫu và dung dịch đệm
Dung dịch đệm
Dung dịch đệm kali dihydrophosphat: cân
chính xác khoảng 6,8 g kali dihydrophosphat
hòa tan trong 1000 ml nước
Chuẩn bị mẫu
Dung môi pha mẫu
Ethanol – nước (70: 30, tt/tt)
Dung dịch gốc
Dung dịch chuẩn gốc methyl paraben: Cân
chính xác khoảng 49,5 mg chuẩn methyl paraben
vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 35 ml
dung môi pha mẫu, lắc siêu âm đến tan hoàn
toàn, để nguội và thêm dung môi pha mẫu vừa
đủ đến vạch, lắc đều Lấy chính xác 10,0 ml
dung dịch này vào bình định mức 50 ml, bổ
sung đến vạch bằng dung môi pha mẫu, lắc đều
Dung dịch chuẩn gốc propyl paraben: Cân
chính xác khoảng 50,0 mg chuẩn propyl paraben
vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 70 ml
dung môi pha mẫu, lắc siêu âm đến tan hoàn
toàn, để nguội và thêm dung môi pha mẫu vừa
đủ đến vạch, lắc đều Lấy chính xác 10,0 ml
dung dịch này vào bình định mức 50 ml, bổ sung đến vạch bằng dung môi pha mẫu, lắc đều
Dung dịch chuẩn hỗn hợp
Lấy chính xác 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc methyl paraben và lấy chính xác 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc propyl paraben vào bình định mức 100 ml và thêm dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45 μm, siêu âm đuổi khí
Dung dịch thử
Cân 20 viên, loại bỏ dịch thuốc trong nang, lau sạch vỏ nang, xác định khối lượng trung bình vỏ nang mềm, cắt nhỏ vỏ nang Cân chính xác khoảng 240,0 mg vỏ nang mềm (tương ứng
1/2 nang) đã cắt nhỏ cho vào bình định mức 100
ml, thêm khoảng 30 ml nước, thêm 1 ml acid hydrocloric đậm đặc, đun cách thủy ở 60 oC khoảng 15 phút, thỉnh thoảng lắc, để nguội, thêm 2 ml dung dịch natri hydroxyd 5 M và bổ sung vừa đủ đến vạch bằng ethanol 96%, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45 μm
Mẫu trắng
Dung môi pha mẫu
Mẫu placebo
Vỏ nang không có chất bảo quản methyl paraben và propyl paraben được chuẩn bị tương
tự mẫu thử
KẾT QUẢ
Điều kiện sắc ký
Với điều kiện HPLC Pha động: methanol – dung dịch đệm kali dihydrophosphat (55:45, tt/tt)
Cột sắc ký: Luna C18 (150 x 4,6 mm; 5 μm) Nhiệt độ cột: 40 0C
Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
Thể tích bơm mẫu: 50 μl
Bước sóng phát hiện: 272 nm
Thì phù hợp cho việc định lượng đồng thời methyl paraben và propyl paraben trong vỏ
Trang 4nang mềm vì có hệ số bất đối của các pic đều
nằm trong khoảng từ 0,8 – 1,5 và có hệ số phân
giải Rs ≥1,5 Kết quả các thông số sắc ký của các
pic được ghi trong Bảng 1
Bảng 1 Các thông số sắc ký của pic methyl paraben
và propyl paraben
Thông số
Chất
Thời gian lưu (t R ) (phút)
Diện tích píc (S)
A S R s
Khảo sát tính phù hợp của hệ thống
Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp
có nồng độ methyl paraben và propyl paraben
tương ứng là 9,86 μg/ml và 4,96 μg/ml
Bảng 2 Tính phù hợp hệ thống
Thông số
Chất
RSD% của
thời gian
lưu (t R )
RSD% của diện tích píc (S)
A S Rs
RSD%
của số đĩa
lý thuyết (N)
Methyl
paraben
Propyl
paraben
Các số liệu thu được cho thấy: RSD (%) của
diện tích pic methyl paraben, propyl paraben
nhỏ hơn 2,0% Hệ số bất đối của pic methyl
paraben, pic propyl paraben nhỏ hơn 0,8 đến 1,5
Độ phân giải giữa hai pic methyl paraben và
propyl paraben là 10,33 Như vậy điều kiện sắc
ký phù hợp cho việc định tính, định lượng
methyl paraben và propyl paraben trong vỏ viên nang mềm có chứa hoạt chất này
Tính đặc hiệu
Tiến hành sắc ký, mẫu trắng (pha động), mẫu placebo, mẫu chuẩn và mẫu thử, thu được
sắc ký đồ như Hình 1
Từ sắc ký đồ Hình 1 và Hình 2 cho thấy tại
thời điểm 4,0 phút (thời gian lưu của pic methyl paraben), tại thời điểm 9,2 phút (thời gian lưu của pic propyl paraben), mẫu trắng, mẫu placebo không có pic xuất hiện, mẫu chuẩn và mẫu thử cho pic tách rõ ràng (có độ tinh khiết pic lớn hơn 0,999), có cùng thời gian lưu tương ứng Phổ UV của pic chính trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch thử có cực đại và hình dạng tương tự phổ UV của pic chính trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch chuẩn
Khoảng tuyến tính
Khoảng tuyến tính từ 40 – 140% nồng độ định lượng của methyl paraben và propyl paraben Pha 6 dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ khoảng từ 3,94 đến 13,80 g/ml cho methyl paraben và từ 1,98 đến 6,94 g/ml cho propyl paraben Tiến hành sắc ký ở điều kiện khảo sát thu được diện tích píc tương ứng với từng nồng độ Xử lý dữ liệu bằng excel 2007 cho thấy sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích đỉnh Với hệ số tương quan R2 ≥ 0,999
Kết quả được thể hiện trong Bảng 3
Hình 1 Sắc ký đồ mẫu trắng (A), mẫu placebo (B), mẫu chuẩn (C) và mẫu thử (D)
D
C
Trang 5Hình 2 Phổ UV-Vis của chuẩn methyl paraben (A), chuẩn propyl paraben (B), phổ UV-Vis của thử methyl
paraben (C), thử propyl para (D) và Phổ tính tinh khiết của pic methyl paraben mẫu thử (E), pic propyl para mẫu thử (E)
Quy trình đạt tính tuyến tính
Độ đúng và độ chính xác
Bảng 3 Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác và
tính tuyến tính
Chỉ tiêu thẩm
định
Giá trị thống kê Methyl paraben Propyl paraben
Phương trình hồi
qui
y = 61401 x + 3787
R2 = 0,9997
y = 54888 x – 375
R2 = 0,9999 Khoảng tuyến tính 3,94 -13,80 g/ml 1,98 - 6,94 g/ml
Độ phục hồi trung bình của methyl paraben
từ 99,12 – 99,73% và từ 99,12 – 99,80% cho propyl
paraben, độ phục hồi của phương pháp đều
nằm trong khoảng cho phép từ 98 – 102% và có
RSD ≤ 2,0%, và quy trình có độ chính xác cao
(RSD ≤ 2,0%) Từ kết quả Bảng 3 ta thấy rằng quy
trình đạt độ đúng và độ chính xác cao
Ứng dụng quy trình để định lượng có vỏ nang
chứa các chất bảo quản methyl paraben và
propyl para của viên nang mềm đang lưu
hành trên thị trường
Bảng 4 Kết quả định lượng methyl paraben và
propyl paraben trong chế phẩm
Tên thuốc Methyl paraben Propyl paraben
Lô 1 Lô 2 Lô 3 Lô 1 Lô 2 Lô 3
Cetiboston 99,8% 95,4% 101,2% 100,5% 97,3% 98,8%
Quy trình phân tích sau khi thẩm định đã được ứng dụng để định lượng methyl paraben
và propyl paraben trong vỏ nang mềm của 2 chế phẩm là viên nang mềm Vitar C và viên nang mềm Cetiboston Mỗi chế phẩm định lượng 3 lô pilot Theo quy định của USP 41 (không được quá 120% so với lượng dùng trong 1 nang, tính theo khối lượng trung bình vỏ nang mềm)
Kết quả phân tích 3 lô ta thấy rằng hàm lượng chất bảo quản methyl paraben và propyl paraben đều dưới giới hạn cho phép của USP 41
do đó các chế phẩm trên đạt tiêu chuẩn về chất bảo quản trong vỏ viên nang mềm
BÀN LUẬN
Định lượng đồng thời methyl paraben và propyl paraben trong vỏ viên nang mềm bằng HPLC với đầu dò PDA đây là phương pháp chính xác có độ nhạy cao, khoảng xác định rộng Với phương pháp này giúp cho việc kiểm soát
A
C
E
B
D
F
Trang 6hàm lượng của các chất bảo quản sử dụng với
mục đích diệt khuẩn và diệt nấm để bảo quản vỏ
nang mềm một cách chính xác và tin cậy Ngoài
ra việc kiểm soát hàm lượng này cũng góp phần
kiểm soát các tác dụng dược lý không mong
muốn của các chất bảo quản giúp bảo vệ sức
khỏe người sử dụng thuốc
KẾT LUẬN
Các kết quả thực nghiệm cho thấy phương
pháp HPLC xây dựng cho phép thử định lượng
methyl paraben và propyl paraben vỏ nang của
viên nang mềm Phương pháp đã được thẩm
định có tính đặc hiệu, độ chính xác cao, độ đúng
tốt, đạt Khoảng tuyến tính phù hợp nồng độ
định lượng trong thành phẩm với độ tương
quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ và diện
tích pic trong khoảng nồng độ đã khảo sát
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Doron S, Friedman M, Falach M, Sadovnic E, Zvia H (2001) Short communication Antibacterial effect of parabens against
lanktonic and biofilm Streptococcus sobrinus International
Journal of Antimicrobial Agents, 18:pp.575– 578
2 Byford JR, Shaw LE, Drew MG, Pope GS, Sauer MJ, Darbre PD
(2002) Oestrogenic activity of parabens in MCF7 human breast
cancer cells Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 80:pp.49 – 60
3 The United States Pharmacopeial Convention (2018) The United
States Pharmacopoeia 41 - National Formulary 36 (USP 41-NF 36),
https://www.uspnf.com/purchase-usp-nf
4 ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005) Validation of
Analytical Procedures: Text and Methodology International
Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, pp.1-13
Ngày nhận bài báo: 31/01/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 12/02/2019 Ngày bài báo được đăng: 20/04/2019