Tối ưu hoá phương pháp Tetra-ARMS (tetra primer amplification refractory mutation) nhằm phát hiện đột biến Canton trong các trẻ sơ sinh mắc bệnh thiếu men G6PD tại thành phố Hồ Chí Minh

Thiếu men G6PD là bệnh lý khiếm khuyết enzyme ở tế bào hồng cầu hay gặp nhất ở người với nhiều biến chứng nghiêm trọng, đặc biệt ở trẻ sơ sinh. Mục tiêu của đề tài này là tối ưu hóa phương pháp Tetra-ARMS PCR trong việc phát hiện đột biến Canton gây bệnh thiếu men G6PD.

TỐI ƯU HOÁ PHƯƠNG PHÁP TETRA-ARMS (TETRA PRIMER

AMPLIFICATION REFRACTORY MUTATION) NHẰM PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN CANTON TRONG CÁC TRẺ SƠ SINH MẮC BỆNH THIẾU MEN

G6PD TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Vũ Hoàng Uyên*, Nguyễn Thị Huệ**, Đặng Thị Lan Anh*

TÓM TẮT

Bối cảnh: Thiếu men G6PD là bệnh lý khiếm khuyết enzyme ở tế bào hồng cầu hay gặp nhất ở người với

nhiều biến chứng nghiêm trọng, đặc biệt ở trẻ sơ sinh Vì đây là bệnh di truyền, nên việc phát hiện sớm đột biến gây bệnh rất có ý nghĩa trong công tác phòng ngừa và điều trị các biến chứng Chính vì vậy, mục tiêu của đề tài này là tối ưu hóa phương pháp Tetra-ARMS PCR trong việc phát hiện đột biến Canton gây bệnh thiếu men G6PD

Phương pháp: Trước tiên các thành phần chính của phản ứng Tetra-ARMS PCR được tối ưu hóa Sau đó,

quy trình Tetra-ARMS chuẩn được áp dụng để phân tích kiểu gene của đột biến Canton trên ba mươi mẫu bệnh bao gồm kiểu đồng hợp và dị hợp tử (kiểu gene đã được xác định trước bằng xét nghiệm ARMS PCR thông thường) Những mẫu cho kết quả không trùng nhau về kiểu gene giữa hai phương pháp được kiểm tra lại bằng kỹ thuật giải trình tự gene

Kết quả: Trong số 13,33% mẫu bất đồng về kiểu gene giữa hai phương pháp Tetra-ARMS PCR và ARMS

PCR thông thường, Tetra-ARMS cho thấy sự chính xác 100% so với kết quả giải trình tự, trong khi sự phân tích của ARMS lại không trùng hợp

Kết luận: Phương pháp Tetra-ARMS là một kỹ thuật đáng tin cậy, chính xác và có thể được sử dụng như

một phương pháp phân tử bổ sung bên cạnh phương pháp sinh hoá trong việc chẩn đoán bệnh thay vì dùng phương pháp ARMS thông thường

Từ khóa: G6PD, Tetra-ARMS, ARMS, đột biến Canton, so sánh, độ đặc hiệu,độ chính xác

ABSTRACT

OPTIMIZING TETRA- ARMS PCR FOR THE DETECTION OF CANTON MUTATION IN

GLUCOSE-6-PHOSPHATE DEHYDROGENASE DEFICIENCY (G6PD DEFICIENCY)

Nguyen Vu Hoang Uyen*, Nguyen Thi Hue, Dang Thi Lan Anh

* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 19 - No 5 - 2015: 297 - 305

Background: Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency is the most common enzyme defect in

human erythrocytes with a lot of serious manifestations, especially in newborns Since this is a genetic disease, so early detection of causative mutations is significant for the prevention and treatment of severe symptoms Therefore, the objective of this project is to optimize the Tetra-ARMS PCR method for detecting Canton mutation – one of the point mutations causing G6PD deficiency

Methods: The main and primary task of this study is optimizing the key components of Tetra-ARMS PCR

The size for genotyping of Canton mutation in G6PD deficiency is thirty samples including homozygote and heterozygote which were genotyped by ARMS PCR assay After all the essential work done, results analysis and

* Trường ĐH Quốc Tế, ĐHQG Tp.Hồ Chí Minh

** Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Tp Hồ Chí Minh

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số 5 * 2015

final DNA sequencing outcomes are two evidences to prove that Tetra-ARMS PCR is surpassing than conventional ARMS PCR It means that both specificity and accuracy of Tetra primer ARMS PCR are higher than ARMS-PCR

Results: In 13.33% disagreement of genotype between the two methods, Tetra primer ARMS PCR

represented 100% agreement with ADN sequencing results, while conventional ARMS PCR technique contradicted all four discordant samples

Conclusion: Tetra primer ARMS PCR method is a reliable and accurate technique and it is suggested that it

can be used as a complementary method beside biochemical tests for diagnostic cases instead of conventional ARMS PCR method This suggestion originated with perfect rate of agreement between Tetra-ARMS outcomes with the ones For future research, this study will be useful for later accuracy improvement, sensitivity test and enhancement of Tetra-ARMS PCR

Key words: G6PD, Tetra-ARMS, ARMS, Canton mutation, validating, specificity, accuracy

GIỚI THIỆU

Thiếu men G6PD được xem là một trong

những bệnh lý khiếm khuyết enzyme ở hồng

cầu hay gặp nhất với 500 triệu người mắc bệnh

trên toàn thế giới, chiếm khoảng 7,5% dân số thế

giới(9) Bệnh thiếu men G6PD có những biểu hiện

nặng nề ở trẻ sơ sinh, trong đó chủ yếu là gây

vàng da sơ sinh và thiếu máu do tan máu cấp,

mạn tính, chậm phát triển tâm thần vận động và

có thể tử vong

Thông thường, bệnh thiếu men G6PD

được phát hiện nhiều ở những vùng dịch tễ

sốt rét Việt Nam cũng là nước có tỉ lệ bệnh sốt

rét cao, nên bệnh thiếu men G6PD tương đối

phổ biến ở đất nước ta với tỉ lệ bệnh là từ 0,5 -

31%(13) cho các nhóm dân tộc phía Bắc và 1,9 -

4,4%(3) ở các nhóm dân tộc phía Nam Chính vì

lí do đó mà việc sàng lọc sơ sinh cho bệnh lý

này là vô cùng thiết yếu nhằm ngăn chặn

những biểu hiện bệnh nguy hiểm xảy ra ở trẻ

sơ sinh Từ năm 2002, chính phủ Việt Nam đã

thực hiện "Chương trình sàng lọc sơ sinh" ở

một số bệnh viện sản khoa lớn, hầu hết là

bằng các phương pháp sinh hoá Nhưng

những phương pháp này mặc dù nhanh, dễ

ứng dụng và không đòi hỏi trang thiết bị đắt

tiền, độ chính xác của chúng lại không cao, vì

có thể bị ảnh hưởng từ nhiều yếu tố như hồng

cầu lưới, các tế bào bạch cầu, tuổi của hồng

cầu, điều kiện bên ngoài và có thể dẫn đến kết quả dương tính giả hoặc âm tính giả(11,15) Hơn nữa, các xét nghiệm này cũng rất khó để phát hiện người mang gen bệnh (người nữ dị hợp tử) những người mà bị ảnh hưởng bởi hiện tượng bất hoạt nhiễm sắc thể giới tính X Vì vậy, để ngăn ngừa các biến chứng nặng (suy thận, bại não, chậm phát triển tâm thần, và thậm chí tử vong) từ bệnh và sự phát tán của bệnh trong quần thể, các phương pháp chẩn đoán phân tử đơn giản và ít tốn kém với độ chính xác cao để phát hiện thiếu men G6PD đang không ngừng phát triển Theo các nghiên cứu trước đây, bệnh thiếu men G6PD xảy ra bởi các đột biến trên gen G6PD làm thay đổi cấu trúc enzyme G6PD Cho tới nay,

đã có hơn 184 đột biến gene được phát hiện(4)

và đa phần là các đột biến điểm nằm trong vùng mã hóa của gene G6PD, dẫn đến làm thay đổi các amino acid trên protein(2,10) Vì vậy, thông qua việc phát hiện những đột biến này, các nhà khoa học có thể sàng lọc các thiếu men G6PD với độ chính xác cao Tại Việt Nam, theo kết quả từ một nghiên cứu năm 2007 cho thấy đột biến mất nghĩa thuộc phân lớp II-Canton xảy ra với tần suất cao ở những bệnh nhân thiếu G6PD: 26,3%(3) ở thành phố Lâm Đồng và 26,67% ở thành phố

Hồ Chí Minh(6)

Hình 1: Để tăng cường độ đặc hiệu cho mồi, một nucleotid không liên kết ở vị trí số 2 từ đầu 3’ được tích hợp

trong hai mồi bên trong Sự có mặt của đột biến được thể hiện bằng sản phẩm DNA khuếch đại với các kích thước khác nhau đã biết trước (5)

Chính vì vậy, Canton trở thành đối tượng

của nghiên cứu này Đột biến Canton nằm trên

exon 12 của gen G6PD và là dạng đột biến

điểm thay thế nucleotid G ở vị trí 1376 thành T

trên cDNA, làm cho acid amin Arginin ở vị trí

459 trên phân tử protein bị biến đổi thành

Leucin(12) Đột biến này cũng đã được chứng

minh là một trong những đột biến gây bệnh

trong quần thể người Kinh- Việt Nam qua

sàng lọc trên 300 bệnh nhân(7) bằng phương pháp ARMS PCR thông thường Đây là một phương pháp đơn giản, phù hợp với điều kiện nghiên cứu ở các nước đang phát triển; tuy nhiên, tính chuyên biệt của nó chưa cao vì hai mồi chuyên biệt cho hai alen cần xác định chỉ khác nhau tại một nucleotide ở đầu 3’, do đó xác suất các mồi có thể bắt cặp sai nucleotide

là rất cao(1) Một nhược điểm khác của phương

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số 5 * 2015

pháp này là để phát hiện một mẫu cần phải

thực hiện hai phản ứng PCR trong hai

eppendorf riêng biệt: một để phát hiện alen

bệnh và một để phát hiện alen lành; điều này

đã làm tăng chi phí, thời gian thực hiện, cũng

như tăng nguy cơ sai sót của phương pháp

Ngược lại, phương pháp giải trình tự DNA

có thể coi là một phương pháp đáng tin cậy nhất

và chính xác nhất để phát hiện các đột biến,

nhưng nó cũng là phương pháp tốn kém nhất và

đòi hỏi nhiều trình tự và điện di, với nhiều thiết

bị phức tạp Do đó, kỹ thuật này không thể áp

dụng rộng rãi trong một số lượng lớn cá thể

Ngoài ra, còn có một số kỹ thuật khác đang được

phát triển như phân tích dựa trên enzyme cắt

giới hạn (RFLP) hay phân tích đường cong nóng

chảy (HRM) lại yêu cầu nhiều thời gian để tối ưu

hóa, đòi hỏi những thiết bị và hóa chất đắt tiền,

không phù hợp với các nước đang phát triển(1,14)

Tetra-primer amplification refractory

mutation system (Tetra-ARMS hoặc T-ARMS) là

một sự kết hợp của Tetra-ARMS và kỹ thuật

ARMS thông thường(5,16) Đây là một phương

pháp đáp ứng được các tiêu chí được đặt ra (giá

thành thấp, không phức tạp, không đòi hỏi thiết

bị đắt tiền và đảm bảo độ chính xác cao) Kỹ

thuật này bao gồm một phản ứng PCR theo sau

là phân tích bằng điện di Phản ứng PCR được

vận hành chỉ trong một eppendorf nhỏ sử dụng

đồng thời 2 cặp mồi đặc hiệu: một bộ mồi (mồi

bên trong) được thiết kế và đặc hiệu cho khu vực

đa hình, trong khi bộ còn lại (mồi bên ngoài) là

để làm tham chiếu chuẩn trong phản ứng PCR

T-ARMS PCR có cải tiến hơn với hai mồi bên

trong và thêm một nucleotide không liên kết đặt

tại nucleotide số 2 ở đầu 3’ (Hình 1) Trong

những năm gần đây, phương pháp này đã được

sử dụng bởi các nhà khoa học trên thế giới vào

việc xác định đột biến điểm bằng cách sử dụng

chỉ một phản ứng PCR duy nhất để có thể phát

hiện cả hai alen, mà không cần dùng enzyme

hạn chế Đặc biệt hơn, phương pháp này có thể

phân biệt chính xác kiểu gene đồng hợp hay dị hợp tử

Tetra-ARMS PCR có thể giúp chúng ta giảm

số lượng phản ứng và chi phí vì chỉ có một phản ứng PCR được thực hiện cho từng mẫu Vì vậy, mục tiêu chính của nghiên cứu này là tối ưu hóa phương pháp Tetra-ARMS PCR để phát hiện đột biến Canton, sau đó so sánh độ đặc hiệu và độ nhạy của phương pháp với ARMS truyền thống Kết quả của phương pháp này sẽ là điều kiện tiên quyết để phát triển các xét nghiệm phân tử với độ đặc hiệu cao và chi phí hiệu quả cho việc xác định kiểu gene gây bệnh đột biến của bệnh thiếu men G6PD ở quy mô lớn

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng và phương pháp thu thập mẫu

Đối tượng của nghiên cứu này là quần thể người Kinh bị thiếu men G6PD Mẫu máu khô từ các em bé sơ sinh tại bệnh viện Phụ Sản Từ Dũ- thành phố Hồ Chí Minh được thu thập và kiểm tra mức độ hoạt động của enzyme cũng như các biểu hiện lâm sàng đặc trưng và được tuyển chọn bởi các bác sĩ của bệnh viện Tất cả các mẫu thu thập đều có phiếu đồng thuận từ bố mẹ của các em tham gia và được lưu trữ lại tất cả các

thông tin dữ liệu lâm sàng

Tách chiết DNA bộ gene

DNA bộ gen được tách bằng bộ kit QIAamp DNA Mini Kit của hãng Qiagene với một số chỗ điều chỉnh để lượng DNA tách chiết từ máu khô cao hơn

Tối ưu hóa thành phần và quy trình nhiệt cho Tetra-ARMS PCR

Để tầm soát đột biến Canton, một bộ bốn mồi đặc biệt đã được thiết kế bằng phần mềm Primer1(16) để khuếch đại 3 phân đoạn của gen G6PD có kích thước từ 200-800bp Mồi xuôi và mồi ngược bên trong được dùng để phát hiện alen đột biến, trong khi mồi xuôi và mồi ngược bên ngoài dùng cho alen không bệnh, đồng thời làm khuôn cho hai mồi bên trong và sản xuất ra sản phẩm PCR có chứa đột biến (Hình 2)

Hình 2: Vị trí bốn mồi trên gen G6PD

Trong quá trình nghiên cứu, từng điều

kiện: nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi, nồng độ

DNA được điều chỉnh nhằm tối ưu hoá phản

ứng và để đảm bảo chất lượng sản phẩm cho

bước chạy PCR trên 30 mẫu Phản ứng PCR

được thực hiện trên hệ thống máy

Eppendorf® PCR (6325ZH804133) Thành

phần cho mỗi phản ứng PCR bao gồm: 2,5ul

của mồi xuôi và ngược bên ngoài 10uM – 0,5ul

của mồi xuôi bên trong 10uM - 1ul của mồi

ngược bên trong 10uM - 12,5ul TopTaq Master Mix 2x (của hãng Thermo Scientific) - khoảng 150ng DNA và thêm nước cho đủ 25ul Chu trình nhiệt của phản ứng PCR như sau: 1 bước biến tính ở 95oC cho 4 phút; và được theo sau bởi 40 chu kỳ gồm 3 bước: 95oC trong 30 giây, nhiệt độ bắt cặp (Ta) trong 30 giây, 72oC trong

1 phút; 1 bước kéo dài cuối cùng tại 72oC trong

10 phút Bảng 1 dưới đây thể hiện nhiệt độ bắt cặp (Ta) của mỗi phản ứng khuếch đại

Bảng 1 Trình tự của 2 cặp mồi và nhiệt độ bắt cặp (Ta) được dùng để khuếch đại 3 phân đoạn gen G6PD đồng

thời để phục vụ cho việc giải trình tự

Tên của Primer Trình tự của primers (5’-3’) Chiều dài của sản phẩm PCR Tm Ta

Outer Forward 5’- ATCTTCCACCAGCAGTGCAAGC-3’

Chứng nội: 750 bp Alen G: 530 bp Alen T: 265 bp

69,7oC

64oC Outer Reverse 5’- GTAGGTGCCCTCATACTGGAAC-3’ 70,0oC

Inner Forward 5’- GTCCCCTCAGCGACGAGCTTCT-3’ 72,0oC

Inner Reverse 5’- GGTGAAAATACGCCAGGCCTTAC-3’ 68,1oC

Hình 3: Sản phẩm PCR được phân tích trên gel 3 vạch biểu thị cho kiểu gen dị hợp tử (GT), 2 vạch cho kiểu gen

đồng hợp tử (GG hoặc TT)

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số 5 * 2015

Sau đó, sản phẩm PCR được kiểm tra bằng

điện di trên 1,5% agarose gel có chứa Ethidium

Bromide và kích thước của những sản phẩm

PCR mong muốn là 750bp cho đoạn tham chiếu

chuẩn, 530bp cho đoạn khuếch đại có alen G và

265bp cho đoạn khuếch đại có alen T sẽ được

đọc dưới tia tử ngoại Kết quả chỉ được đọc nếu

có băng chứng nội hiển thị

Sự hiện diện của 3 vạch trên gel cho thấy

kiểu gen dị hợp tử (GT) và 2 vạch cho thấy kiểu

gen đồng hợp tử (GG hoặc TT) (Hình 3)

Đánh giá hiệu quả hai phương pháp

Để so sánh độ đặc hiệu và độ chính xác giữa

ARMS thông thường và Tetra-ARMS, quy trình

PCR đã tối ưu hoá được áp dụng cho

Tetra-ARMS trên 30 mẫu G6PD bệnh, sau đó kết quả

kiểu gen các mẫu Tetra-ARMS sẽ được đem so

sánh với cùng những mẫu đó đã thực hiện bằng

phương pháp ARMS(8) Những mẫu không trùng

khớp về kiểu gen sẽ được đem giải trình tự DNA

để có thể kết luận về độ chính xác giữa hai

phương pháp Dùng hai mồi ngoài xuôi và

ngược trong bộ bốn mồi của Tetra-ARMS để

phục vụ cho việc giải trình tự gen (Outer

forward và outer reverse, với kích thước sản

phẩm là 750bp) Phản ứng giải trình tự sử dụng

bộ Kit “ABI prism BigDye Terminator cycle

sequencing ready reaction” và tiến hành trên hệ

thống 3130xl Genetic Analyzer (Applied

Biosystems, France)

Kết quả của quá trình giải trình tự được

phân tích bằng phần mềm SeqScape v2.5 Trình

tự của ba phân đoạn gen được so sánh với trình

tự của gen G6PD trên Ensemble (số Accession

No.ENSG00000160211) để xác định các đột biến

KẾT QUẢ

Xác định kiểu gen

Quy trình Tetra-ARMS PCR đã tối ưu hoá

được áp dụng trên 30 mẫu bệnh G6PD, dùng 3

mẫu đã biết kiểu gen YG, YT và GT làm đối

chứng dương để xác định 2 alen của đột biến

Canton

Hình 4: Kết quả xác định kiểu gen ở một số mẫu bằng

phương pháp Tetra-ARMS Vạch trên cùng là vạch chứng nội ở 750bp Vạch ở giữa(530bp) và vạch dưới cùng (265bp) là hai vạch biểu thị cho alen G và alen T của đột biến Canton

Hình 4 cho thấy kết quả xác định kiểu gen của một số mẫu tiêu biểu của hai phương pháp Các vạch điện di đều rõ nét, đúng kích thước, không có sản phẩm phụ không đặc hiệu Điều

đó chứng tỏ các cặp mồi được sử dụng là đặc hiệu và các điều kiện của phản ứng PCR đã được tối ưu hóa

Bảng 2: Bảng thống kê số mẫu giống/khác nhau và

tần số của mẫu không khớp trên tổng số

YG GG YT TT GT

ARMS PCR 14 0 11 0 5 Tetra-ARMS PCR 14 4 11 0 1 Kết quả trùng khớp 26/30 86,67% Kết quả không trùng khớp 4/30 13,33%

Sau khi phân tích có 4 mẫu khác và 26 mẫu giống nhau về kiểu gen giữa hai phương pháp Như vậy 13,33% là các mẫu khác kiểu gen trên tổng số 30 mẫu bệnh (Bảng 2)

Đánh giá hiệu quả của Tetra-ARMS PCR

Bốn mẫu của Tetra-ARMS cho thấy kết quả khác với ARMS được giải trình tự để kiểm tra kiểu gen chính xác và rút ra kết luận cuối cùng ARMS PCR hiển thị bốn mẫu này có kiểu gen dị hợp tử (GT), trong khi đó, kết quả của T-ARMS PCR đọc được trên gel là đồng hợp tử (GG) cho

cả bốn mẫu

Hình sắc ký trình tự DNA rất rõ ràng, không

bị nhiễu và đã khẳng định rằng kết quả hoàn toàn phù hợp với kết quả của Tetra-ARMS Chỉ

có một đỉnh màu đen đại diện cho các nucleotide

G xuất hiện tại vị trí điểm đột biến hiển thị trên

hình Điều này có nghĩa rằng chỉ có các

nucleotide G có mặt tại vị trí đó, vì thế nó có kiểu

gen GG Do đó, kết quả T-ARMS PCR là chính

xác 100% với kết quả giải trình tự DNA (hình 4)

Hình 4: Kết quả giải trình tự

Ngoài ra, độ nhạy và độ đặc hiệu của hai

phương pháp cũng được tính toán theo thống kê

của mẫu có mang alen bệnh, không mang alen

bệnh và tổng số từng loại Mặc dù ARMS thông

thường và Tetra-ARMS có cùng chỉ số độ nhạy

(1,0), nhưng độ đặc hiệu của ARMS chỉ đạt 0,778

trong khi T-ARMS lại tiếp tục đạt chỉ số tối đa là

1,0 (bảng 3) Như vậy có thể chắc chắn rằng độ

đặc hiệu của phương pháp Tetra-ARMS cao hơn

so với ARMS truyền thống và đủ độ tin cậy để

phát triển xa hơn trong tương lai

Bảng 3: Bảng thống kê các mẫu bệnh/không bệnh,

tổng số từng loại, chỉ số nhạy và đặc hiệu của ARMS

và Tetra-ARMS

THẢO LUẬN

Với mục tiêu tầm soát đột biến Canton xuất

hiện trên gen G6PD trong quần thể người

Kinh-Việt Nam, trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ

thực hiện trên những bệnh nhân thiếu men G6PD mà không tiến hành trên nhóm chứng (những người khỏe mạnh) Nguyên nhân của việc này là vì theo nhiều nghiên cứu trước đây thì đột biến gen là nguyên nhân gây bệnh thiếu men G6PD, do đó việc khảo sát trên nhóm bệnh

sẽ làm tăng xác suất bắt gặp các đột biến hơn so với nhóm đối chứng Nhằm góp phần hoàn chỉnh cơ sở dữ liệu về đột biến G6PD trên quần thể người Kinh tại thành phố Hồ Chí Minh và phát triển một phương pháp chẩn đoán bệnh hiệu quả mà tiết kiệm và nhanh chóng hơn so với các phương pháp truyền thống khác, nghiên cứu này tập trung vào việc tối ưu hoá quy trình PCR của Tetra-ARMS và xác thực độ đặc hiệu cũng như tính chính xác của kỹ thuật này đối với đột biến Canton (G1376T)

Nghiên cứu này được tiến hành để điều tra

độ đặc hiệu và độ chính xác của phương pháp Tetra-ARMS-PCR so với ARMS PCR thông thường dựa trên kết quả kiểm lại bằng giải trình

tự DNA - một phương pháp tiêu chuẩn trong việc xác định đột biến Trong số 30 mẫu đã biết kiểu gen bằng ARMS từ nghiên cứu trước đó(8), chỉ có bốn mẫu có kết quả mâu thuẫn giữa ARMS thường và Tetra-ARMS được quan sát Tất cả các kết quả không khớp đều mang kiểu gen dị hợp tử dưới sự phát hiện của ARMS PCR, nhưng phương pháp truyền thống này đã không chẩn đoán một cách chính xác dù chỉ một trong

số bốn mẫu vì khi so sánh với sắc ký đồ của trình

tự DNA, kết quả đúng phải là kiểu gen đồng hợp tử

Nguyên tắc của phản ứng trong ARMS-PCR

là dựa trên tính đặc hiệu của mồi trong phản ứng PCR Để xác định một đột biến điểm, cần phải thiết kế 3 mồi Trong đó một mồi được sử dụng chung cho cả mẫu bình thường và mẫu có đột biến, có thể là mồi xuôi hoặc mồi ngược Hai mồi còn lại có trình tự giống nhau, trừ vị trí nucleotide ở đầu tận cùng 3’ Mồi bình thường

có trình tự nucleotide ở đầu tận cùng 3’ bổ sung với trình tự DNA của người bình thường Mỗi đột biến có nucleotide ở đầu tận cùng 3’ bổ sung

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số 5 * 2015

với trình tự DNA của người có loại đột biến

điểm đó Theo nguyên tắc này, mồi bình thường

chỉ khuếch đại đoạn DNA của người bình

thường mà không khuếch đại đoạn DNA của

người có đột biến; và ngược lại mồi đột biến chỉ

khuếch đại đoạn DNA của người có đột biến mà

không khuếch đại đoạn DNA của người bình

thường Như vậy, phương pháp này chỉ thành

công khi chúng ta thiết kế được mồi đặc hiệu

hoàn toàn với DNA đích ở đầu 3’ Do đó, kết quả

xác định kiểu gen có sai sót chắc chắn là vì mồi

đột biến không hoàn toàn hoạt động hiệu quả

cho alen đột biến Mặc dù ARMS PCR vẫn có thể

hiệu chỉnh thêm các nucleotide gần đầu 3’ của

mồi nhưng sẽ tốn thời gian và không đảm bảo có

thể phân biệt chính xác kiểu gene đồng hợp hay

dị hợp tử

Nhìn từ kết quả thực tế, ARMS PCR cho thấy

cả bốn kiểu gen dị hợp tử trong khi tất cả chúng

phải là đồng hợp tử Điều này đã cho thấy độ

đặc hiệu của ARMS thấp hơn so với Tetra-ARMS

– kỹ thuật xác định chính xác bốn kiểu đồng hợp

tử từ bốn mẫu không khớp kết quả Rõ ràng

phương pháp ARMS thông thường có độ chính

xác và độ tin cậy thấp hơn so với Tetra-ARMS,

đặc biệt khi xác minh các trường hợp có kiểu gen

đồng hợp

Như vậy, có thể nhận thấy phương pháp

Tetra-ARMS có sự vuợt trội hơn so với phương

pháp ARMS thông thường Trong phạm vi

nghiên cứu của đề tài trên 30 trẻ sơ sinh, khi so

sánh với kết quả của ARMS và kiểm tra lại bằng

giải trình tự gen trực tiếp thì kết quả hoàn toàn

trùng khớp và chính xác Đó là minh chứng rõ

ràng nhất cho độ tin cậy của phương pháp

Tetra-ARMS Vì vậy mà Tetra-ARMS ngày càng được

áp dụng rộng rãi không chỉ trong các lab mà còn

trên thực tế lâm sàng, không chỉ trong xác định

đột biến điểm gây thiếu men G6PD mà còn

trong các bệnh như β - thalassemia, xác định tính

đa hình của HLA, apoprotein E trong bệnh

Alzeimer

Từ đó, phương hướng của chúng tôi trong

những nghiên cứu tiếp theo là thiết kế các cặp

mồi tương ứng với các vị trí đột biến điểm khác trên gen G6PD gây thiếu men enzyme G6PD Với thời gian ngắn để đạt được kết quả, sẽ rất thuận lợi cho bệnh nhân và người nhà khi có nhu cầu xác định đột biến gây bệnh, sàng lọc trước sinh, chẩn đoán sàng lọc sau sinh, tư vấn

di truyền, tư vấn tiền hôn nhân Đồng thời, đối với nghiên cứu trong tương lai, tiến hành thực hiện trên một cỡ mẫu lớn hơn - kiểm tra trên một

số lượng lớn các mẫu sẽ là công việc cần thiết để tìm mối liên quan giữa các đột biến điểm khác với bệnh thiếu men G6PD ở Việt Nam và phát triển tiềm năng của Tetra-ARMS PCR để trở thành một phương pháp chẩn đoán sử dụng rộng rãi trong tương lai

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tối ưu hóa thành công một quy trình cho Tetra-ARMS PCR để tầm soát đột biến Canton - dạng đột biến điểm thay thế nucleotide G ở vị trí 1376 thành T trên cDNA - trong các mẫu DNA của các bệnh nhân thiếu men G6PD ở Việt Nam Phương pháp này vừa tiết kiệm và hiệu quả vì không những tiết kiệm được thời gian và hoá chất, mà kết quả đánh giá phương pháp từ nghiên cứu này cũng giúp cho các cải tiến mới sau này So với các phương pháp khác, đặc biệt ARMS PCR, T-ARMS PCR là một kỹ thuật tiết kiệm thời gian, linh hoạt hơn trong khâu chuẩn bị PCR và hiệu quả trong chi phí Căn cứ vào các kết quả trong nghiên cứu này, nên nghĩ đến việc phát triển Tetra-ARMS trong chẩn đoán trước sinh và tư vấn di truyền, tư vấn tiền hôn nhân Áp dụng phương pháp Tetra-ARMS - PCR trong sàng lọc trẻ sơ sinh để phát hiện bệnh sớm, từ đó có biện pháp dự phòng thích hợp, đặc biệt đối với trẻ

nữ Nếu chỉ đơn thuần đo hoạt tính của enzyme G6PD, chúng ta dễ dàng bỏ sót các trường hợp

nữ dị hợp nhưng có hoạt tính của enzyme G6PD trong giới hạn bình thường

Cảm ơn: Chúng tôi xin chân thành cảm ơn các bác sĩ và

bệnh nhân tại bệnh viện Từ Dũ đã tham gia trong nghiên cứu này Nghiên cứu này được tài trợ bởi Trường Đại học Quốc tế, ĐHQG - HCM trong đề tài mã số T2014-16-BT

TÀI LIỆU THAM KHẢO

the genotype-phenotype association Blood Rev 21(5): p 267-83

dehydrogenase variants including a new variant distributed in Lam

Dong Province in southern Vietnam Acta Med Okayama 61(4):

p 213-9

(G6PD) mutations database: review of the "old" and update of the

new mutations Blood Cells Mol Dis 48(3): p 154-65

The amplification refractory mutation system (ARMS) Nucleic

Acids Res 17(7): p 2503-16

Vietnamese-Kinh deficient patients African Journal of

Biotechnology 12(12): p 1318-1325

deficient Vietnamese Wulfenia Journal 20(11): p 229-249

Vietnamese-Kinh Int J Hum Genet 13(2): p 85-92

of G6PD deficiency: current status and its perpective Acta Medica

Iranica 46(3): p 167-182

dehydrogenase deficiency and malaria: cytochemical detection of

heterozygous G6PD deficiency in women J Histochem Cytochem

57(11): p 1003-11

tests to identify heterozygotes carrying severe or mild G6PD deficiency Clin Biochem 39(2): p 183-6

in northern Vietnam Trop Med Int Health 5(3): p 203-6

function of glucose-6-phosphat dehydrogenase deficiency variants in Chinese population Hum Genet 119: p 463-487

advancements and limitations Human mutation 30(6): p

857-859

dehydrogenase deficiency in erythrocytes: a spectrophotometric assay and a fluorescent spot test compared with a cytochemical method

Clin Chim Acta 168(2): p 129-36

amplification by tetra-primer PCR Nucleic Acids Res 20(5): p

1152

16 Ye S et al (2001) An efficient procedure for genotyping single

nucleotide polymorphisms Nucleic Acids Res 29(17): p E88-8

Ngày nhận bài báo: 25/05/2015 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 09/06/2015 Ngày bài báo được đăng: 05/09/2015