Bài viết nhấn mạnh tầm quan trọng của việc ứng dụng kỹ thuật Array-CGH trong việc chẩn đoán, xác định nguyên nhân, tầm soát sớm các bất thường về di truyền góp phần vào việc tham vấn, điều trị, hỗ trợ cho bệnh nhân và gia đình bệnh nhân.
Trang 1ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ARRAY-CGH TRONG CHẨN ĐOÁN LÂM SÀNG CÁC BẤT THƯỜNG VỀ DI TRUYỀN : HỘI CHỨNG VI MẤT/NHÂN ĐOẠN NHIỄM SẮC THỂ TRÊN BỆNH NHÂN CHẬM PHÁT TRIỂN TÂM THẦN
VẬN ĐỘNG VÀ/HOẶC ĐA DỊ TẬT BẨM SINH
Huỳnh Minh Tuấn*, Trần Công Toại*
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Trên 50% bệnh nhân chậm phát triển tâm thần vận động, đa dị tật bẩm sinh có xét nghiệm di
truyền thường qui âm tính Array-CGH dựa trên sự lai phân tử ADN bệnh nhân và chứng trên hệ thống vi lưới ADN, góp phần chẩn đoán 10-20% các hội chứng di truyền liên quan đến các vi đột biến nhiễm sắc thể
Phương pháp: Ứng dụng kỹ thuật Array-CGH trong chẩn đoán các vi đột biến nhiễm sắc thể trên bệnh
nhân chậm phát triển tâm thần vận động và/hoặc đa dị tật bẩm sinh
Kết quả: Array-CGH góp phần chẩn đoán các vi đột biến nhiễm sắc thể thường gặp : hội chứng vi
mất/nhân đoạn 15q11.2, vi mất/nhân đoạn16p11.2, Charcot-Marie-Tooth, Di Georges/vi nhân đoạn 22q11.2, hội chứng Sotos/vi nhân đoạn 5q35
Kết luận: Sau cùng, chúng tôi nhấn mạnh tầm quan trọng của việc ứng dụng kỹ thuật Array-CGH trong
việc chẩn đoán, xác định nguyên nhân, tầm soát sớm các bất thường về di truyền góp phần vào việc tham vấn, điều trị, hỗ trợ cho bệnh nhân và gia đình bệnh nhân
Từ khóa: Array-CGH, vi đột biến nhiễm sắc thể, chậm phát triển tâm thần vận động, đa dị tật bẩm sinh
ABSTRACT
APPLICATION OF ARRAY-CGH (COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION) IN ROUTINE CLINICAL DIAGNOSIS OF GENETIC DISORDERS: MICRODELETION OR MICRODUPLICATION SYNDROME IN PATIENTS WITH NEURODEVELOPMENTAL DELAY AND/OR MULTIPLE
CONGENITAL ABNORMALITIES
Huynh Minh Tuan, Tran Cong Toai
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No 2 - 2016: 111 - 123
Introduction: More than 50% patients with neurodevelopmental delay and/or multiple congenital
abnormalities have the negative results on routine chromosomal analysis Array-CGH is based on the molecular hybridization of DNA from a reference sample and DNA from a test or patient sample on DNA probes that are spotted onto the slide This technique helps to improve the diagnostic yield in 10-20% patients carrying cryptic chromosomal aberrations
Methods: Application of Array-CGH for routine diagnosis of cryptic chromosomal imbalances in patients
with developmental delay and/or congenital abnormalities having normal routine cytogenetic testing
Results: This approach offers the higher diagnostic yield of cryptic chromosomal imbalances (15-20%) such
as recurrent microdeletion or microduplication 15q11.2 syndrome, microdeletion or microduplication 16p11.2 syndrome, Charcot-Marie-Tooth, Di Georges or microduplication 22q11.2 syndrome, Sotos syndrome or microduplication 5q35 in patients with global developmental delay, cognitive impairment and multiple
* Bộ Môn Mô - Phôi - Di Truyền.Trường Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch
Tác giả liên lạc: PGS TS BS Trần Công Toại ĐT: 0838683007 Email: toaiphd@yahoo.com
Trang 2congenital abnormalities
Conclusion: We finally highlight the importance of the use of Array-CGH in clinical diagnostic setting
and screening of cryptic chromosomal imbalances in patients at high risk of genomic disorders contributing to genetic counseling, disease treatment as well as family support for patients with orphan diseases
Keywords: Array-CGH, Submicroscopic Rearrangements, Developmental Delay, Multiple Congenital
Abnormalities
GIỚI THIỆU TỔNG QUAN
Bệnh lý chậm phát triển tâm thần vận động
và/hoặc đa dị tật bẩm sinh là một trong số các
bệnh lý di truyền thường gặp, tần suất khoảng
3% dân số chung Bệnh lý chậm phát triển tâm
thần được định nghĩa khi thông số đánh giá IQ
thấp hơn 70, mất khả năng thích nghi với hoàn
cảnh môi trường và các triệu chứng thường
xuất hiện trước 18 tuổi Nguyên nhân di truyền
chiếm khoảng 10 đến 20% trong tất cả các
nguyên nhân gây chậm phát triển và/hoặc đa dị
tật bẩm sinh Nguyên nhân gây chậm phát triển
tâm thần thường gặp nhất là trisomie 21 hay hội
chứng Down, các bất thường về cấu trúc nhiễm
sắc thể (chuyển đoạn, nhân đoạn, đảo đoạn, )
và các bệnh lý di truyền đơn gen Đa phần các
gen liên quan đến quá trình hình thành, phát
triển, hoạt động của synapse thần kinh, tính linh
hoạt của bộ xương tế bào, dẫn truyền xung thần
kinh, điều hòa quá trình sao mã của gen, điều
hòa cấu trúc của nhiễm sắc chất
Hình 1: Các cơ chế chính và tác động của các protein
liên quan đến chậm phát triển tâm thần vận động tại
synapse thần kinh :
1 Dưới tác động của các kích thích dẫn truyền thần kinh, khe tiền synapse phóng thích các chất dẫn truyền thần kinh vào khe synapse
2 Các thụ thể sau synapse sẽ tiếp nhận chất dẫn truyền thần kinh gây mở các kênh calci, giải
mã và tổng hợp protein
Các quá trình khác liên quan đến tính bền vững synapse và hình thành trí nhớ bao gồm :
3 Tái tổ chức bộ xương tế bào
4 Hoạt hóa các đường dẫn truyền tính hiệu
5 Điều hòa quá trình sao mã của gen (van Bokhoven, 2011)
Chậm phát triển tâm thần vận động thường
có biểu hiện đa dạng về kiểu hình, do tác động của các yếu tố biến đổi khác như các biến đổi alleles (allèles modificateurs), các đột biến tế bào sinh dưỡng, biến đổi về di truyền ngoài ADN (epigenetics) và các yếu tố môi trường
Các gen bị đột biến liên quan đến quá trình phát triển của hệ thần kinh, có thể di truyền theo kiểu lặn, di truyền trội và/hoặc đa yếu tố Ngoài ra, chậm phát triển tâm thần vận động và/hoặc đa dị tật bẩm sinh thường đi kèm với các hội chứng di truyền trong đó mức độ biểu hiện kiểu hình, triệu chứng lâm sàng và các khiếm khuyết bẩm sinh phụ thuộc số lượng gen khiếm khuyết trong đột biến (hội chứng vi mất đoạn nhiễm sắc thể) và các yếu tố biến đổi tác động
Hội chứng vi mất đoạn nhiễm sắc thể bao gồm tất cả các đột biến về di truyền mà kỹ thuật
di truyền tế bào thường qui không thể phát hiện được(<5Mb) Các đột biến này còn được gọi là
CNV (Copy Number Variations), tức là những
biến đổi về bản sao, các CNVs này thường có kích thước từ 1 kbp đến vài Mbs, phân tán rải
Trang 3rác trên toàn bộ gen và cũng góp phần vào việc
xác định sự đa dạng kiểu hình Sự phát triển của
khoa học kỹ thuật di truyền Y khoa cùng với sự
ra đời của kỹ thuật Array-CGH đã góp phần
vào việc phân loại và xác định các CNVs : CNV
lành tính, VOUS (Variations Of Unknown
Clinical Significance) và CNV bệnh lý Các hội
chứng di truyền thường đi kèm với các CNV
bệnh lý hay vi mất đoạn nhiễm sắc thể thường
gặp nhất là vi mất đoạn (microdeletion) và vi
nhân đoạn (microduplication) Các CNVs được
tạo ra do cơ chế NAHR (Non Allelic
Homologous Recombination) từ các duplicon
của các nhiễm sắc thễ tương đồng (crossing-over)
Mục tiêu nghiên cứu xác định một số ứng dụng Array-CGH và tầm quan trọng của kỹ thuật trong chẩn đoán bệnh lý di truyền vi mất đoạn và hoặc nhân đoạn
Kỹ Thuật Array-CGH
Lai phân tử trên hệ thống vi lưới ADN là một kỹ thuật lai kết hợp ADN bệnh nhân và ADN chứng trên hệ thống vi lưới ADN Đầu tiên, ADN bệnh nhân và ADN chứng (control)
sẽ được cắt bằng các enzyme giới hạn AluI và
RsaI để có được các đoạn ADN có kích thước từ
200 đến 500 bp
Hình 2: 4 bước chính của kỹ thuật Array-CGH bao gồm đánh dấu ADN bệnh nhân và chứng bằng Cya5 và
Cya3, lai ADN đánh dấu, đo lường kết quả huỳnh quang bằng scanner và phân tích kết quả
ADN tiêu hóa sẽ được đánh đấu bằng Cya5
(tín hiệu màu đỏ) cho bệnh nhân và Cya3 (tín
hiệu màu xanh) cho chứng ADN đánh dấu
Cya5 và Cya3 sẽ được tinh sạch trước khi tiến hành lai trên lam (hệ thống đoạn mồi ADN) và lam sẽ được scan để phát hiện tín hiệu Cya5 và Cya3 Kết quả cuối cùng sẽ được phân tích bằng
Trang 4phần mềm chuyên biệt Cytogenomics Agilent
và kết quả phân tích dựa trên log 2
MỘT SỐ KẾT QUẢ TRÌNH BÀY
CASE-REPORTS
Hội chứng vi mất đoạn 16p11.2
Bệnh cảnh lâm sàng
Bệnh nhân nam, sinh ngày 13/11/2008, đến
khám tại khoa di truyền vì chậm phát triển về
ngôn ngữ (ngôn ngữ diễn đạt và tiếp nhận), tiền
căn bản thân bao gồm trước sinh, sau sinh và
tiền căn gia đình không phát hiện bất thường,
kết quả nhiễm sắc thể đồ ở độ phân giải 550
bandes cho kết quả bình thường : 46,XY Bệnh
nhân được đề nghị cho thực hiện kỹ thuật
Array-CGH với kết quả arr[hg19]
16p11.2(29,673,954-30,198,600)x1 Đột biến vi
mất đoạn với kích thước tối thiểu là 524 kbp bao
gồm 28 gen
Vi mất đoạn nhiễm sắc thể 16p11.2 là một
trong những hội chứng di truyền vi mất đoạn
thường gặp trong di truyền, tần suất 1/2000 và
chiếm 0,5% nguyên nhân ở bệnh nhân tự kỷ
ASD (Autistic Spectrum Disorders) (Zufferey et
al.,2012) Bệnh nhân vi mất đoạn 16p11.2
BP4-BP5 thường mang đột biến mất đoạn có kích
thước khoảng 600 kbp bao gồm 28 gen : SPN,
QPRT, C16orf54, ZG16, KIF22, MAZ, PRRT2,
PAGR1, MVP, CDIPT, CDIPT-AS1, SEZ6L2,
ASPHD1, KCTD13, TMEM219, TAOK2,
HIRIP3, INO80E, DOC2A, C16orf92, FAM57B,
ALDOA, PPP4C, YPEL3, TBX6, GDPD3,
MAPK3, CORO1A Tất cả các bệnh nhân mang
đột biến vi mất đoạn 16p11.2 thường có biểu
hiện chậm phát triển tâm thần vận động, đặc biệt là chậm phát triển ngôn ngữ, thiểu năng trí
tuệ, béo phì, động kinh (gen PRRT2), dị tật bẩm sinh (gen TBX6 bất thường về cột sống) và rối
loạn về tính cách Vi mất đoạn 16p11.2 có thể là đột biến mới xuất hiện hay di truyền từ cha mẹ với độ thâm nhập không hoàn toàn và biểu hiện kiểu hình đa dạng (modifying factors) (Shinawi
et al., 2010)
Hình 3 : Kết quả Array-CGH với vi mất đoạn
16p11.2, kích thước tối thiểu 524 kbp, 30 đoạn dò bị
lệch trái, log 2 ratio =-0.7 arr[hg19]
16p11.2(29,673,954-30,198,600)x1
Trang 5Hình 4 : Vi mất đoạn 16p11.2, tối thiểu 524 kbp, bao gồm 28 gen và điểm gãy thường gặp nhất tại hai đoạn dò
(Probe A_14_P200817 Agilent, giới hạn trên) tại gen SPN và đoạn dò (Probe A_14_P124319 Agilent, giới hạn dưới) tại gen CORO1A
Hội chứng vi mất đoạn/vi nhân đoạn
15q11.2 BP1-BP2
Bệnh cảnh lâm sàng
Bệnh nhân nam, sinh ngày 24/04/2009, đến
khám khoa di truyền vì chậm phát triển ngôn
ngữ Tiền căn bản thân và gia đình không phát
hiện bất thường, kết quả nhiễm sắc thể đồ
46,XY Bệnh nhân được thực hiện kỹ thuật
Array-CGH và kết quả cho thấy vi mất đoạn
15q11.2 kích thước tối thiểu 395 kbp bao gồm 4
gen chính trong vi mất đoạn 15q11.2 NIPA1,
NIPA2, CYFIP1 và TUBGCP5 Kết quả
Array-CGH: arr[hg19]
15q11.2(22,784,523-23,179,948)x1, log2ratio = -0.7
Nhiễm sắc thể 15q chứa đựng các duplicon
BP1-BP5, trao đổi đoạn chéo không tương đồng
NAHR BP1-BP3 gây đột biến vi mất đoạn
15q11.2q13 và gây ra hội chứng Prader-Willi và
hội chứng Angelman
Hình 5 : Vi mất đoạn 15q11.2 BP1-BP2, kích thước
tối thiểu 359 kbp, 14 đoạn dò bị lệch, log 2 ratio =-0.7
Hội chứng vi mất đoạn 15q11.2 thường do
trao đổi chéo không tương đồng BP1-BP2,
Trang 6gây mất đoạn hay nhân đoạn với kích thước
khoảng 500 kbp bao gồm 4 gen chính bảo tồn
cao qua các loài : NIPA1, NIPA2, CYFIP1 và
TUBGCP5 Các gen này có mức biểu hiện cao
ở hệ thần kinh và có vai trò quan trọng trong
sự phát triển của hệ thần kinh trung ương
Bệnh nhân mang vi mất đoạn 15q11.2 thường
đa dạng về mặt kiểu hình bao gồm : chậm
phát triển tâm thần vận động và trí tuệ, chậm
phát triển ngôn ngữ, bất thường về hình thái học, bất thường về tính cách và mang các di tật bẩm sinh khác Các đột biến có thể là đột biến mới xảy ra hay di truyền từ cha mẹ có kiểu hình bình thường hay mang triệu chứng lâm sàng Đột biến vi mất đoạn 15q11.2 thường có độ thâm nhập giảm và biểu hiện
đa dạng về mặt kiểu hình (Burnside et al.,
2010)
Hình 6 : Vi mất đoạn 15q11.2 bao gồm 4 gen : NIPA1, NIPA2, CYFIP1 và TUBGCP5
Bệnh lý thần kinh ngoại biên có tính di
truyền Charcot-Marie-Tooth type 1A :
Bệnh cảnh lâm sàng
Bệnh nhân nữ, sinh ngày 11/01/2004 Bệnh
nhân đến khám khoa di truyền vì rối loạn học
tập và thiểu năng trí tuệ nhẹ Khám lâm sàng
nghi ngờ bệnh lý thần kinh ngoại biên Tiền căn
gia đình cha mẹ chậm phát triển trí tuệ, anh trai
bệnh nhân chậm phát triển tâm thần vận động
Tiền căn trước sinh : Bệnh nhân sinh thường,
cân nặng lúc sinh 2,85 kgs, chiều dài khi sinh 50
cm, vòng đầu 34 cm, chỉ số Apgar ở 1 phút và 5
phút là 10 Bệnh nhân biểu hiện chậm phát triển
sớm : biết ngồi ở lúc 1 tuổi, biết đi lúc 2 tuổi, biết
kiểm soát đi tiểu về đêm từ lúc 3 tuổi Bệnh nhân cũng có những biểu hiện chậm phát triển
về ngôn ngữ Khám lâm sàng 18/05/2015, cân nặng 39,2 kgs, cao 149 cm, vòng đầu 53,5 cm Khám thần kinh vận động, bệnh nhân không có khả năng đi bằng gót chân, bàn chân lỏm hai bên, ngón chân gập, điểm tựa trọng lực chủ yếu với điểm tựa lên xương bàn chân Giảm trương lực cơ và tăng độ đàn hồi chi trên, mất phản xạ gân xương chi dưới không kèm hội chứng ngoại tháp Gù cột sống thắt lưng phải, bệnh nhân than phiền mệt, mỏi cơ và dị cảm tứ chi Xét nghiệm EEG bình thường Nhiễm sắc thể đồ cho kết quả 46,XX và Array-CGH cho kết quả
Trang 7arr[hg19] 17p12(14,111,772-15,442,066)x3, 21
đoạn dò lệch phải, log2ratio = +0.54
Charcot Marie Tooth type 1A là bệnh lý
thần kinh ngoại biên thường gặp nhất với biểu
hiện lâm sàng là yếu và mỏi các cơ xa, teo cơ,
yếu và mất dần chức năng các cơ ở xa nổi bật
với dấu hiệu bàn chân rơi khi bước Mất phản
xạ gân xương thường xảy ra ở chi dưới thường
nhất là phản xạ gân gót Achille, biến dạng bàn
chân, biến dạng và gù vẹo cột sống Các dấu hiệu thần kinh và dấu hiệu ngoài thần kinh thường đi kèm như run giật tay, điếc, hội chứng ngoại tháp, liệt cơ hoành, liệt dây thanh âm, bất thường đồng tử, teo thần kinh thị và tăng nhãn áp Điện sinh lý giúp chẩn đoán xác định với
sự kéo dài dẫn truyền thần kinh vận động (Birouk N, 2009)
Hinh 7: Array-CGH cho kết quả nhân đoạn 17q12 kích thước tối thiểu 1,3 Mb và 21 đoạn dò lệch phải của bệnh
Charcot-Marie-Tooth type 1A
Vi mất đoạn 22q11.2 và hội chứng Di
Georges
Bệnh cảnh lâm sàng
Bệnh nhân nam, sinh ngày 23/08/1973
Khám khoa di truyền vì bệnh tim bẩm sinh (tứ
chứng Fallot) và rối loạn tính cách Tiền căn bản
thân bệnh tim bẩm sinh đã phẫu thuật, tiền căn gia đình không phát hiện bất thường Nhiễm sắc thể đồ cho kết quả 46,XY Xét nghiệm Array-CGH cho kết quả như sau : arr[hg19] 22q11.2(18,919,942-20,311,763)x1, 52 đoạn dò lệch trái, log2ratio = -0.9
Trang 8Hình 8 : Nhân đoạn 17p12, 1.3 Mb, bao gồm gen PMP22 gây bệnh lý thần kinh ngoại biên
Charcot-Marie-Tooth type 1A
Hình 9 : Array-CGH cho thấy kết quả vi mất đoạn 22q11.2 của hội chứng Di Georges, kích thước tối thiểu 1.39
Mb
Trang 9Hình 10 : Hội chứng Di Georges vi mất đoạn
22q11.2 bao gồm 43 gen trong đó gen TBX1 có vai
trò quan trọng trong phát triển hệ tim mạch và được
cho là gen chính gây ra di tật tim bẩm sinh trong hội
chứng Di Georges
Hội chứng Sotos và vi mất đoạn 5q35
Bệnh cảnh lâm sàng
Bệnh nhân nam, sinh ngày 31/08/2014 (9
tháng tuổi), đến khám khoa di truyền vì tăng
kích thước vòng đầu (đầu to), tiền căn bệnh tim bẩm sinh đã phẫu thuật Chỉ số cân nặng khám ngày 04/08/2015, cân nặng 8,8 kgs, chiều cao 73
cm và vòng đầu 50.5 cm (+3DS), IRM : Dãn não
thất bên thụ động, dãn não thất ba, không phát hiện tắt nghẽn ống Sylvius Khám lâm sàng bệnh nhân có bất thường về hình thái học, bệnh nhân được làm các xét nghiệm về di truyền, nhiễm sắc thể đồ cho kết quả 46,XY
Hình 11 : Khám lâm sàng bất thường hình thái học trán nhô cao và rộng, épicanthus, tăng khoảng cách giữa hai
mắt, khe mắt ra ngoài và lệch dưới, miệng to mở có dạng hình nón (grande bouche ouverte en chapeau de
gendarme), nhô xương hàm trên (prognathisme maxillaire)
Array-CGH cho kết quả như sau : arr[hg19]
5q35.2q35.3(175,775,326-177,047,120)x1
Trang 10Hình 12 : Array-CGH cho kết quả vi mất đoạn
5q35.2q35.3, 45 đoạn mồi bị lệch, log 2 ratio = -0.9, kích thước 1.27 Mb
Hình 13 : Array-CGH cho kết quả vi mất đoạn 5q35.2q35.3 có chứa gen NSD1, gây hội chứng Sotos với tăng
kích thước vòng đầu, bất thường hình thái học, chậm phát triển tâm thần vận động, đa dị tật bẩm sinh
Hội chứng Sotos là một trong những hội
chứng di truyền đa dị tật bẩm sinh đặc trưng
bởi tăng trưởng nhanh trước và sau sinh, tăng
tuổi xương, chậm phát triển tâm thần vận động,
đa dị tật thường gặp nhất lả dị tật bẩm sinh tim
và bất thường về hình thái học khuôn mặt dài
và hẹp, cằm nhọn, trán nhô và rộng, tăng khoảng cách nhãn cầu, khe mắt lệch ngoài và xuống dưới Bệnh nhân Sotos thường tăng nguy
cơ mắc bệnh ung thư, nhất là bướu quái cùng