Đại cương về trữ lạnh tinh trùng của người

Thụ tinh trong ống nghiệm là một bước tiến lớn trong điều trị vô sinh. Nếu bệnh nhân vô tinh bế tắc thất bại khi thực hiện thụ tinh ống nghiệm hoặc muốn có con lần thứ hai thì phải thực hiện tiểu phẫu để lấy tinh trùng từ mào tinh tinh hay tinh hoàn, đặt ra vấn đề cần lưu trữ tinh trùng.

ĐẠI CƯƠNG VỀ TRỮ LẠNH TINH TRÙNG CỦA NGƯỜI

Mai Bá Tiến Dũng*

TÓM TẮT

Thụ tinh trong ống nghiệm là một bước tiến lớn trong điều trị vô sinh Nếu bệnh nhân vô tinh bế tắc thất bại khi thực hiện thụ tinh ống nghiệm hoặc muốn có con lần thứ hai thì phải thực hiện tiểu phẫu để lấy tinh trùng từ mào tinh tinh hay tinh hoàn, đặt ra vấn đề cần lưu trữ tinh trùng Các chỉ định trữ lạnh tinh trùng bao gồm những bệnh nhân mong muốn có con trước khi can thiệp hay xạ trị khối u vùng chậu, trước can thiệp phẫu thuật trên cổ bàng quang, ung thư tinh hoàn, các bệnh nội khoa diễn tiến ảnh hưởng đến quá trình sản xuất tinh trùng, trích tinh trùng khi thực hiện phẫu thuật đường dẫn tinh Lựa chọn và tối ưu hóa quy trình trữ lạnh sâu tinh trùng rất cần thiết để giảm những tổn thương của tinh trùng, cải thiện tỷ lệ có thai khi thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm Không có sự khác biệt về tỷ lệ có thai, chất lượng phôi, tỷ lệ có thai lâm sàng giữa hai nhóm bệnh nhân thụ tinh trong ống nghiệm với tinh trùng tươi và tinh trùng trữ lạnh Cần thiết lập quy trình để hạn chế rủi ro và tăng tính an toàn trong quy trình trữ lạnh tinh trùng

Từ khóa: tinh trùng, trữ lạnh tinh trùng, quy trình trữ lạnh tinh trùng

ABSTRACT

CRYOPRESERVATION OF HUMAN SPERMATOZOA

In vitro fertilization is a big step in treatment male infertility In case, the patient with obstruction azoospermia fails to perform in vitro fertilization or wants to have a second child, then minor surgery to aspiration sperm from the epididymis or testicle, poses a problem of sperm storage Indications for cryopreservation of human

spermatozoa include patients wishing to have children before intervention or radiotherapy for pelvic tumors, prior

to surgical intervention on bladder neck, testicular cancer, internal medical conditions enjoy the process of sperm production, sperm extraction when performing a surgical procedure on the sperm Selection and optimization of cryopreservation of human spermatozoa procedures are essential to reduce sperm damage, improve pregnancy rates when in vitro fertilization is performed There was no difference in pregnancy rate, embryo quality, clinical pregnancy rate between two in vitro fertilized patients with fresh sperm and frozen sperm Procedures need to be established to limit risks and increase safety in sperm storage

Keywords: human sperm, cryopreservation of human spermatozoa, procedure of cryopreservation of human

spermatozoa

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo Tổ Chức Y Tế Thế Giới (WHO)(20) một

cặp vợ chồng sau 12 tháng có quan hệ tình dục

bình thường, không áp dụng bất kỳ biện pháp

tránh thai mà không có thai được xếp vào nhóm

vô sinh Vô sinh chiếm tỷ lệ trung bình 15%

trong cộng đồng Ước tính có khoảng 30% các

trường hợp vô sinh có nguyên nhân chính từ

người đàn ông và 30% - 40% có liên quan đến cả

vợ lẫn chồng

Năm 1998 tại Việt Nam, Khoa Hiếm muộn – Bệnh viện Từ Dũ đã thực hiện thành công thụ tinh trong ống nghiệm với tinh trùng trong tinh dịch(10) Tuy nhiên nếu bệnh nhân thất bại khi thực hiện thụ tinh ống nghiệm hoặc thực muốn

có con lần thứ hai thì phải thực hiện tiểu phẫu để lấy tinh trùng từ mào tinh tinh hay tinh hoàn Năm 1776, Lazaro Spallanzamin(9,16) đã báo cáo một trường hợp trữ lạnh tinh trùng bằng tuyết Tuy nhiên đến năm 1866, Montegazza(9) đã

* Khoa Nam học – BV Bình Dân Thành Phố Hồ Chí Minh

đưa ra vấn đề bệnh nhân có thể có con với tinh

trùng của mình được lưu giữ Năm 1953, người

phụ nữ đầu tiên thụ thai với tinh trùng trữ lạnh,

điều này chứng minh tinh trùng sau khi rã đông

thì vẫn có khả năng thụ thai và mang thai tự

nhiên(1,9)

Phương pháp trữ lạnh tinh trùng bằng nitơ

lỏng ở nhiệt độ - 1960C được giới thiệu lần đầu

vào năm 1963 và được xem là phương pháp

chuẩn Vào năm 1970 việc thành lập ngân hàng

tinh trùng từ người hiến tặng tinh trùng và các

cặp vợ chồng vô sinh đã trở nên phổ biến(12)

Trữ lạnh tinh trùng để thực hiện thụ tinh

trong ống nghiệm là một hoạt động quan trọng

của nhiều trung tâm điều trị hiếm muộn(21)

CHỈ ĐỊNH THỰC HIỆN TRỮ LẠNH

TINH TRÙNG (7)

Trước khi hóa trị hay xạ trị vùng chậu Đối

với trường hợp trước dậy thì có thể thực hiện

phẫu thuật trích tinh trùng tinh hoàn để trữ

lạnh(11)

Trước các phẫu thuật có ảnh hưởng đến khả

năng sinh sản (phẫu thuật cổ bàng quang ở nam

giới trẻ, ung thư tinh hoàn, trước thủ thuật triệt

sản hay chuyển giới)

Bệnh nhân có chất lượng tinh trùng có thể

diễn tiến đến tình trạng vô tinh do bị ảnh hưởng

điều trị các bệnh lý như: u tuyến yên, ung thư

thanh quản, suy thận, tiểu đường không kiểm

soát, xơ cứng bì

Những trường hợp chỉ xuất tinh được khi sử

dụng thiết bị cấy điện cực

Sau khi điều trị suy sinh dục, bệnh nhân có

xuất tinh từng đợt

Bệnh nhân vô tinh không bế tắc, sau điều trị

có tinh trùng hoặc sau thủ thuật trích tinh trùng

tinh hoàn

Trong quá trình thực hiện phẫu thuật nối

ODT sau triệt sản hay nối ODT - MT có thể lấy

tinh trùng để trữ lạnh

Bệnh nhân hiến tặng tinh trùng

CÁC BIẾN ĐỔI CỦA TINH TRÙNG KHI THỰC HIỆN QUÁ TRÌNH TRỮ LẠNH TINH TRÙNG

Nguyên tắc của trữ lạnh tinh trùng là làm giảm nhiệt độ của môi trường chứa mẫu tế bào hay mẫu mô xuống nhiệt độ rất thấp, thường là 77K (độ Kelvin) hoặc -1960C (nitơ lỏng) Ở nhiệt

độ thấp này, hầu hết các hoạt động sinh học bên trong tế bào bao gồm các phản ứng sinh hóa và hoạt động trao đổi chất bị ngừng lại Nhờ đó, tế bào sống ở dạng tiềm sinh (không phát triển) và được bảo quản trong thời gian rất dài Trong quá trình trữ lạnh và rã đông tinh trùng, một số thay đổi trong môi trường chứa tế bào và cả trong bản thân tế bào có thể ảnh hưởng đến cấu trúc, chức năng, sự toàn vẹn và khả năng sống của tinh trùng sau rã đông

Tương tự những loại tế bào khác, tinh trùng cũng bị ảnh hưởng bởi ba dạng tổn thương chính xảy ra ở những khoảng nhiệt độ khác nhau trong suốt quá trình đông lạnh và rã đông Trong khoảng nhiệt độ 150C đến -50C, nhiệt độ lạnh là yếu tố chính gây tổn thương tế bào, do làm phá hủy những giọt lipid trong bào tương

và các cấu trúc vi ống (bao gồm thoi vô sắc) Từ

-50C đến -800C, sự hình thành tinh thể đá nội bào

và ngoại bào là nguyên nhân chính gây tổn thương tế bào Tổn thương này được xem là nguy hiểm nhất đối với các loại tế bào được trữ lạnh sâu nói chung, và đối với tinh trùng nói riêng Ở nhiệt độ từ -500C đến -1500C, sự phá vỡ màng bào tương là những tổn thương phải trải qua trong giai đoạn này

Tinh trùng người chịu được một biên độ làm lạnh và làm ấm nhất định Chúng không dễ dàng bị tổn hại bởi quá trình làm lạnh nhanh ban đầu (sốc lạnh) Nguyên nhân có thể là do màng

tế bào tinh trùng là màng lipid kép, cấu tạo từ các a-xít béo không bão hòa nên tính lỏng cao(3) Ngoài ra, chúng có sức chịu đựng cao hơn các loại tế bào khác đối với các thương tổn gây ra từ quá trình đông lạnh là do lượng nước trong nội bào ít hơn (khoảng 50%)

Trong quá trình rã đông, những dạng tổn

thương đối với tế bào cũng xảy ra tương tự như

trong quá trình đông lạnh nhưng theo trình tự

ngược lại Trong đó, quan trọng nhất là khả năng

tái kết tinh (recrystallization), mà hậu quả là sự

xuất hiện trở lại của các tinh thể đá nội bào khi

nhiệt độ tăng trên -1200C Do đó, trong quá trình

rã đông, đa số các tác giả đều cho rằng cần phải

vượt qua giai đoạn này một cách nhanh chóng

để hạn chế việc gây thêm tổn thương cho tế bào

Các biện pháp để hạn chế tổn thương cho

phôi và làm tăng tỷ lệ sống của phôi sau rã đông

cũng dựa trên hai yếu tố chính là sử dụng chất

bảo quản đông lạnh (cryoprotectant agents -

CPA) và điều khiển tốc độ đông lạnh – rã đông

Sự hoạt động kết hợp của hai hay nhiều loại

CPA (có khả năng thẩm thấu và không có khả

năng thẩm thấu) giúp hạn chế được sự hình

thành tinh thể đá nội bào, ổn định cấu trúc tế bào

và màng tế bào trong quá trình hạ nhiệt độ(4)

CÁC PHƯƠNG PHÁP TRỮ LẠNH TINH

TRÙNG

Một chu trình đông lạnh sâu - rã đông bao

gồm các công đoạn chính như (1) tiếp xúc với

môi trường có chất bảo quản, (2) hạ nhiệt độ, (3)

lưu trữ, (4) rã đông và (5) loại bỏ chất bảo quản

để đưa tế bào về điều kiện sinh lý(12) Dựa vào

nồng độ chất bảo quản đựơc sử dụng và tốc độ

hạ nhiệt trong quá trình đông lạnh, về mặt kĩ

thuật, người ta thường chia trữ đông phôi làm

hai nhóm là hạ nhiệt độ chậm (slow – freezing)

và thủy tinh hóa (vitrification)

Hạ nhiệt độ chậm (slow – freezing)

Hạ nhiệt độ chậm còn được gọi là phương

pháp trữ đông có kiểm soát tốc độ làm lạnh

(controlled-rate freezing) Phương pháp này

được Whittingham giới thiệu đầu tiên vào

những năm đầu thập niên 70 trên mô trình

phôi chuột Em bé đầu tiên từ phôi người trữ

đông trên thế giới ra đời bằng phương pháp

này được ghi nhận và năm 1983 Trong

phương pháp hạ nhiệt độ chậm, mẫu tế bào

được làm lạnh với tốc độ hạ nhiệt độ chậm

(1-30C/phút) từ nhiệt độ sinh lý xuống nhiệt độ rất thấp (khoảng -800C) trước khi đưa mẫu vào lưu trữ trong ni-tơ lỏng(19)

Hạ nhiệt độ nhanh

Trong kỹ thuật hạ nhiệt độ nhanh hay còn gọi là thủy tinh hóa, mẫu tế bào được cho thẳng vào ni-tơ lỏng ngay sau khi được cho trao đổi với chất bảo quản mà không qua giai đoạn hạ nhiệt

độ từ từ Em bé đầu tiên trên thế giới ra đời bằng

kỹ thuật này được báo cáo vào năm 2002(8)

Nguyên lý của kỹ thuật này được dựa trên tốc độ làm lạnh cực nhanh, do đó thể tích môi trường còn lại xung quanh phôi trước khi đông lạnh phải ở mức tối thiểu để mẫu tế bào nhanh chóng đạt nhiệt độ mong muốn Khi cần sử

dụng phôi sẽ được rã đông

Lựa chọn phương pháp trữ lạnh sâu tinh trùng

Khảo sát cho thấy không có sự khác biệt về cấu trúc mô cũng như sức sống của tinh trùng người sau trữ lạnh – rã đông bằng hai phác đồ trữ lạnh chậm và thủy tinh hóa tối ưu cho áp dụng trữ lạnh sâu tinh trùng

Việc áp dụng phương pháp hạ nhiệt chậm hay thủy tinh hóa phụ thuộc vào điều kiện làm việc, môi trường cũng như kinh nghiệm của người thực hiện(7)

ĐÁNH GIÁ CÁC CHỈ SỐ VỀ MẬT ĐỘ VÀ CHẤT LƯỢNG TINH TRÙNG TRƯỚC TRỮ LẠNH SÂU TINH TRÙNG, SAU RÃ ĐÔNG TINH TRÙNG TRỮ LẠNH SÂU

Mật độ tinh trùng

Mật độ tinh trùng trong quá trình thực hiện trữ lạnh sâu tinh trùng cũng như quá trình rã đông cần thực hiện soi dưới kính hiển vi có độ phóng đại 100 và 400 lần với ánh sáng phản pha, theo hướng dẩn của Tổ Chức Y Thế Giới về đánh giá tinh dịch đồ của người(21)

Có thể đánh giá mật độ trên buồng đếm Neubauer hoặc buồng đếm Makler tùy vào điều kiện của từng cơ sở Khi sử dụng buồng đếm Neubauer cải tiến đã đưa ra cách pha loãng, tính

toán hệ số pha loãng, đếm buồng đếm và tính

toán sai số một cách tỉ mỉ theo hướng dẫn

Độ di động của tinh trùng

Đánh giá độ di động bằng cách khảo sát sự

di động tự nhiên của tinh trùng, sau đó tính tỉ lệ

giữa tinh trùng trong cùng thể tích và được thể

hiện bằng phần trăm Hướng dẫn thực hiện xét

nghiệm tinh dịch đồ người của Tổ Chức Y Tế

Thế Giới đưa ra tiêu chuẩn đánh giá sự di động

của tinh trùng chỉ còn 03 loại: di động tiến tới

(PR), di động không tiến tới (NP), không di động

(IM) Điều đó sẽ dễ dàng phân loại tinh trùng

hơn, mang tính khách quan hơn(21)

Đánh giá tỷ lệ sống của tinh trùng

Sử dụng phương pháp nhuộm

Eosin-Nigrosin Tinh trùng chết bắt màu đỏ của eosin,

tinh trùng sống không bắt màu đỏ của eosin

Qua đánh giá tỷ lệ sống của tinh trùng, có

thể tìm ra mẫu đó có tinh trùng sống hay không

và tiến hành tác chọn lựa tinh trùng còn sống để

thực hiện tiêm tinh trùng vào bào tương trứng

thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm(20)

Sử dụng xét nghiệm đánh giá sự phân mảnh

của DNA tinh trùng

Phân mảnh DNA là một trong những bất

thường di truyền của tinh trùng, chiếm 20% các

trường hợp vô sinh nam Bất thường này ảnh

hưởng đến khả năng thụ tinh của tinh trùng Xét

nghiệm này có vai trò quan trọng trong việc

chẩn đoán và đưa ra hướng điều trị vô sinh nam

Mối liên quan giữa tổn thương DNA của

tinh trùng với khả năng thụ tinh của tinh trùng

với trứng đã được xác lập(14)

Nam giới có độ phân mảnh của DNA tinh

trùng (DFI) < 15% sẽ có khả năng thụ thai bình

thường, DFI từ 15 – 30% thì tỷ lệ thụ thai tự

nhiên giảm mạnh nhưng vẫn có tỉ lệ thành công

cao ở các biện pháp hỗ trợ sinh sản như IVF, IUI;

còn DFI > 30% thì ngay cả khi có các biện pháp

hỗ trợ sinh sản cũng có tỉ lệ thành công rất thấp

Tuy nhiên, tỷ lệ thụ thai thành công tăng lên

đáng kể ở nhóm bệnh nhân giảm được DFI từ

mức trên 30% xuống dưới mức 30%(14)

HIỆU QUẢ CỦA TRỮ LẠNH TINH TRÙNG

Friedler và cộng sự(5), Ben Rhouma và cộng

sự , Habermann và cộng sự(6) đã báo cáo không

có sự khác biệt về tỷ lệ có thai, chất lượng phôi,

tỷ lệ có thai lâm sàng giữa hai nhóm bệnh nhân thụ tinh trong ống nghiệm với tinh trùng tinh hoàn tươi và tinh trùng tinh hoàn trữ lạnh Cayan và cộng sự(2), Sherman và cộng sự(12), Silber(13) đã báo cáo việc sử dụng tinh trùng mào tinh tươi và trữ lạnh để thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm, kết quả cho thấy không có sự khác biệt về tỷ lệ có thai lâm sàng khi sử dụng tinh trùng trữ lạnh

Năm 2009, Trương Thị Thanh Bình và cs(17)

đã báo cáo kết quả trữ lạnh mô tinh hoàn ở bệnh nhân vô tinh bế tắc, nghiên cứu cho thấy không

có sự khác biệt về chất lượng tinh trùng tinh hoàn tươi và trữ lạnh

Năm 2015, Vũ Thị Bích Loan và cs(18) đã báo cáo tiêm tinh trùng trữ lạnh từ chọc hút mào tinh

để thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm và kết quả không có sự khác biệt sử dụng tinh trùng tươi hay tinh trùng đông lạnh

ĐÁNH GIÁ RỦI RO CỦA KỸ THUẬT TRỮ LẠNH VÀ BẢO QUẢN TINH TRÙNG CỦA NGƯỜI ĐƯỢC TRỮ LẠNH(15)

Khi đánh giá các rủi ro liên quan đến kỹ thuật trữ lạnh và bảo quản tinh trùng, các vấn đề sau đây cần được xem xét

Nguồn mẫu

Tình trạng vật lý của các ống lưu trữ, mẫu tinh dịch và phòng lưu trữ, để giảm nguy cơ mất mẫu do trộm cắp hoặc cháy nổ, hư hỏng các dụng cụ chứa mẫu hoặc cạn kiệt nguồn

ni-tơ lỏng

Sự phù hợp của thiết bị để sử dụng

Hệ thống thùng chứa và vận chuyển nitơ lỏng Thiết bị bảo hộ, an toàn đối với nhân viên Thiết bị bảo vệ cá nhân

Hệ thống báo động phát hiện lượng nitơ

lỏng trong hệ thống trữ lạnh xuống thấp

Nguy cơ lây nhiễm chéo

KẾT LUẬN

Trữ lạnh sâu tinh trùng là một lĩnh vực rất

cần thiết trong điều trị vô sinh nam nhất là

những trường hợp vô tinh bế tắc khi can thiệp

ngoại khoa và việc trữ lạnh sâu tinh trùng được

thực hiện đồng thời khi phẫu thuật

Các chỉ định bao gồm những bệnh nhân

mong muốn có con trước khi can thiệp hay xạ trị

khối u vùng chậu, trước can thiệp phẫu thuật

trên cổ bàng quang, ung thư tinh hoàn, các bệnh

nội khoa diễn tiến ảnh hưởng đến quá trình sản

xuất tinh trùng, trích tinh trùng khi thực hiện

phẫu thuật đường dẫn tinh

Lựa chọn và tối ưu hóa quy trình trữ lạnh

sâu tinh trùng rất cần thiết để giảm những tổn

thương của tinh trùng, cải thiện tỷ lệ có thai khi

thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm Quy trình

hạ nhiệt độ trong trữ lạnh tinh trùng đựơc lựa

chọn tùy thuộc điều kiện về trang thiết bị cũng

như kinh nghiệm với tiêu chí ưu thế chất bảo

quản lạnh nồng độ thấp sẽ ít ảnh hưởng đến tế

bào Cần thiết lập quy trình để hạn chế rủi ro và

tính an toàn trong quy trình

TÀI LIỆU THAM KHẢO

frozen human spermatozoa” Nature, 172:767

2 Cayan S, Lee D, Conaghan J, et al (2001) “A comparison of ICSI

outcomes with fresh and cryopreserved epididymal

spermatozoa from the same couples” Human Reproduction,

16(3):495–499

3 Clarke GN; Liu Y; Baker HW (2006) “Recovery of human sperm

motility and ability to interact with the human zona pellucida

after more than 28 years of storage in liquid nitrogen” Fertil

Steril, 86:721-722

4 D'Angelo A and Amso N (2002) “Embryo freezing for

preventing Ovarian Hyperstimulation Syndrome” Cochrane

Database Syst Rev, 2:CD002806

5 Friedler S, Strassburger D, Raziel A, Komarovsky D, Soffer Y

and Ron-El R (1997) “Intracytoplasmic injection of fresh and

cryopreserved testicular spermatozoa in patients with

nonobstructive azoospermia—A comparative study” Fertility

and Sterility, 68(5):892–897

6 Habermann H, Seo R, Cieslak J, Niederberger C, Prins GS and

Ross L (2000) “In vitro fertilization outcomes after

intracytoplasmic sperm injection with fresh or frozenthawed

testicular spermatozoa” Fertility and Sterility, 73(5):955–960

7 Jungwirth A, Diemer T, Kopa T, Krausz C, Minhas S, Tournaye

H (2019) “EAU Guidelines on Male Infertility” European

Association of Urology, pp.31 – 33

8 Liebermann J, Nawroth F, Isachenko V et al (2002) Potential

importance of vitrification in reproductive medicine Biol Reprod,

67(6):1671-80

9 Mahony MC, Morshedi M, Scott RT, De Villiers A and Erasmus

E (1990) “Role of spermatozoa cryopreservation in assisted reproduction” Human Spermatozoa in Assisted Reproduc-tion:

Williams & Wilkins Co., chapt 10, pp.100

10 Nguyễn Thành Như, Phạm Hữu Đương, Nguyễn Ngọc Tiến, Vương Thị Ngọc Lan, Vũ Lê Chuyên, Nguyễn Văn Hiệp (2002)

“Bảy trường hợp trích tinh trùng từ mào tinh và ống dẫn tinh

bằng phẫu thuật để tiêm tinh trùng vào bào tương trứng” Thời

sự y dược học, bộ VII, 4:226-228

11 Picton HM, et al (2015) “A European perspective on testicular tissue cryopreservation for fertility preservation in prepubertal

and adolescent boys” Hum Reprod, 30:2463

12 Sherman JK (1990) “Cryopreservation of human semen” Handbook of the Laboratory Diagnosis and Treatment of In-

fertility Webster Boston: CRC Press, Inc., chapt 13, pp.229

13 Silber SJ, Devroey P, Tournaye H, Van Steirteghem AC (1999)

“Fertilizing capacity of epididymal and testicular sperm using

intracytoplasmic sperm injection (ICSI)” J Formos Med Assoc,

99(6):459-65

14 Smit M, Romijn JC, Wildhagen MF, et al (2010) Decreased Sperm DNA Fragmentation After Surgical Varicocelectomy is

Associated with Increased Pregnancy Rate The Journal of

Urology, 183(1):70 - 274

15 Tedder RS, Zuckerman MA, Goldstone AH, et al (1995)

“Hepatitis B transmission from contaminated cryopreservation

tank” Lancet, 346:137–140

16 Triana V (1980) Artificial insemination and semen banks in Italy In: Human Artificial Insemination and Semen

Preservation Edited by G David and W Price, pp.51, New York:

Plenum

17 Trương Thị Thanh Bình, Nguyễn Thành Như, Nguyễn Thị Mai, Mai Công Minh Tâm, Hồ Mạnh Tường, Nguyễn Ngọc Bích (2009) Trữ lạnh mô tinh hoàn ỡ những trường hợp vô tinh bế

tắc ở nam giới Thời sự Y học, 36:3-6

18 Vũ Thị Bích Loan, Nguyễn Viết Tiến, Vũ Văn Tâm (2015) “Kết quả bước đầu phương pháp tiêm tinh trùng trữ lạnh từ mào

tinh vào bào tương noãn trong điều trị vô sinh nam” Tạp chí

Nghiên Cứu Y Học, 93(1):1 – 7

19 Witt MA (1997) “Sperm banking” in Infertility in the Male, 3ed Edited by LI Lipshultz and SS Howards St Inc, chapt 32,

pp.501 Louis: Mosby- Year Book

20 World Health Organization (2000) WHO Manual for the Standardised Investigation, Diagnosis and Management of the Infertile Male Cambridge: Cambridge University Press

21 World Health Organization (2010) WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen, Fifth edition