Bài viết trình bày ứng dụng kỹ thuật giải trình tự để xác định đột biến điểm của gen APC ở bệnh nhân mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình.
Trang 1XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN ĐIỂM CỦA GEN APC Ở BỆNH NHÂN
MẮC BỆNH ĐA POLYP TUYẾN GIA ĐÌNH
Nguyễn Thị Băng Sương*, Bùi Chí Viết*, Nguyễn Trung Tín * , Đoàn Duy Khánh**, Võ Đức Hiếu***,
Phạm Xuân Dũng***, Lê Minh Khôi*, Nguyễn Hoàng Bắc*
TÓM TẮT
Mở đầu: Đa polyp tuyến gia đình là bệnh di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường, nguyên nhân gây bệnh
được xác định chủ yếu do đột biến gen APC nằm trên nhiễm sắc thể số 5 Đột biến chủ yếu của gen APC là đột biến điểm Nếu không được phát hiện và điều trị sớm, 100% bệnh nhân sẽ tiến triển thành ung thư đại trực tràng
Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự để xác định đột biến điểm của gen APC ở bệnh nhân mắc bệnh đa
polyp tuyến gia đình
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 11 bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình
dựa vào các triệu chứng lâm sàng và nội soi phát hiện có polyp đại trực tràng với số lượng polyp > 20 polyp Các bệnh nhân được ly trích DNA và giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa của APC
Kết quả: Phát hiện được 04 bệnh nhân bị đột biến điểm trên gen APC, trong đó có 03 bệnh nhân bị đột biến
chuyển nghĩa (missense) và 01 bệnh nhân bị đột biến thêm 1 nucleotid A
Kết luận: Đã ứng dụng thành công quy trình giải trình tự chẩn đoán đột biến gen APC ở các bệnh nhân
mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình
Từ khóa: Ung thư đại trực tràng, gen APC, đa polyp tuyến gia đình, đột biến điểm, giải trình tự…
ABSTRACT
DETERMINATION OF POINT MUTATION
IN APC GENE CAUSING FAMILY ADENOMATOUS POLYPOSIS
Nguyen Thi Bang Suong, Bui Chi Viet, Nguyen Trung Tin, Doan Duy Khanh, Vo Duc Hieu,
Pham Xuan Dung, Le Minh Khoi, Nguyen Hoang Bac
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 19 - No 5 - 2015: 176 - 182
Introduction: Familial adenomatous polyposis (FAP) is an autosomal-dominant disease caused by
mutations in the adenomatous polyposis coli (APC) gene locating on chromosome 5 Mutations in the APC gene
is mainly point mutations Unless detected and treated early, 100% of patients will progress to colorectal cancer
Objective: Perform sequencing techniques to identify mutations in APC gene from Family adenomatous
polyposis patients
Patients and Methods: Blood samples were obtained from 11 patients who were diagnosed to have Family
adenomatous polyposis based on clinical symptoms and endoscopic results of more than 20 colorectal polyps DNA were extracted and the entire APC gene were sequenced to analyzed mutations
Results: Among 11 patients analyzed, we identified 04 patients showed APC mutations, including 03
missense mutation, and 1 poly A inserted mutation
* Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh *** Bệnh viện Ung Bướu TP.HCM
** Khoa Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TPHCM
Tác giả liên lạc: PGS TS Nguyễn thị Băng Sương ĐT: 0913281386 Email: suongnguyenmd@gmail.com
Trang 2Conclusion: Successfully establish sequence procedure to identify APC gene mutations dcausing family
adenomatous polyposis
Keywords: Colorectal cancer, APC gene, family adenomatous polyposis, point mutations, sequencing…
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư đại trực tràng là bệnh lý ác tính phổ
biến với khoảng 655.000 người chết trên thế giới
mỗi năm Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc ung thư đại trực
tràng là 7,5/100.000 dân Nghiên cứu của
Nguyễn Thị Diệp Anh cho thấy ở Việt Nam, tỷ lệ
mắc ung thư đại trực tràng đứng hàng thứ hai
sau ung thư dạ dày và ung thư gan(6) Theo các
nghiên cứu, bệnh ung thư đại trực tràng liên
quan mật thiết với bệnh đa polyp tuyến gia đình
(Familial adenomatous polyposis-FAP) Các
nghiên cứu ước tính khoảng 20-30% các ung thư
đại trực tràng có tiền sử gia đình Khoảng 3-4%
ung thư đại trực tràng bắt nguồn từ thể không
polyp di truyền, trong khi đó 15% ung thư đại
trực tràng là do bệnh đa polyp tuyến gia đình
Mặc dù chiếm tỷ lệ không lớn nhưng FAP đóng
vai trò rất quan trọng vì đây là bệnh có khả năng
di truyền cao(1,3)
Đa polyp tuyến gia đình là bệnh di truyền
trội trên nhiễm sắc thể thường Ở Mỹ, bệnh FAP
có tần suất 1/10.000 – 1/6000, ở Việt Nam hiện
chưa có thống kê cụ thể về tỷ lệ mắc bệnh FAP
Trên lâm sàng, bệnh đặc trưng bởi sự hiện diện
rất nhiều polyp tuyến ở đại tràng, thường trên
100 polyp (khoảng 100-2000 polyp) Chúng có
thể gây chảy máu và xuất hiện máu ở trong
phân Nếu bệnh tiến triển ác tính sẽ gây sụt cân,
di căn vào gan hoặc nơi khác FAP có thể xuất
hiện với các triệu chứng khác như phì đại lớp
biểu mô sắc tố võng mạc, u nang quai hàm, u
nang mỡ hoặc khối u xương lành tính Theo
Sheng và các tác giả, 100% bệnh nhân FAP
không được điều trị sẽ dẫn đến ung thư đại
tràng ở tuổi 35-40(10) Cần phát hiện sớm các
polyp tiền ung thư và cắt bỏ chúng trước khi trở
thành ác tính Bệnh nhân đã bị polyp tuyến
tràng kiểm tra sau 3 đến 5 năm Có thể kết hợp các thuốc dự phòng ung thư như aspirin, vitamin D, cycloxygenose,…
Nguyên nhân gây nên FAP được xác định là
do đột biến gen APC (adenomatous polyposis
coli) ở dòng tế bào mầm, có 85% bệnh nhân thể nặng và 30-60% bệnh nhân thể nhẹ mang đột
biến gen APC Gen APC nằm trên nhánh dài của
nhiễm sắc thể số 5, cấu trúc gồm 18 exon, tuy nhiên vùng gen mã hóa bắt đầu từ exon 4 đến exon 18 nên thông thường các nghiên cứu chỉ khảo sát đột biến gen APC từ exon 4 đến exon
18 Các đột biến nhỏ của gen APC chiếm khoảng 60-70% bệnh nhân FAP Đột biến này thường tạo
bộ ba kết thúc (stop codon), làm quá trình dịch
mã kết thúc sớm và tổng hợp nên protein bị cắt cụt, làm mất chức năng ức chế sự tăng sinh tế bào của protein APC, hậu quả gây nên bệnh FAP
và sẽ tiến triển đến ung thư nếu không được chẩn đoán sớm và điều trị tích cực Mặc dù có nhiều phương pháp phát hiện đột biến nhỏ của gen APC nhưng giải trình tự trực tiếp toàn bộ chiều dài gen là phương pháp hiệu quả và chính xác nhất (2) Ở Việt Nam, việc nghiên cứu đột biến gen APC ở bệnh nhân FAP vẫn còn rất hạn chế Năm 2012 tác giả Nguyễn Phương Anh đã phân tích gen APC cho một số gia đình bệnh nhân FAP, tuy nhiên tác giả chỉ phân tích exon
15 của gen(6), trong khi đó đột biến rải rác khắp chiều dài đoạn gen Để tránh bỏ sót tổn thương, cần xây dựng quy trình phân tích toàn bộ đoạn gen APC để xác định đột biến Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài này với mục
tiêu: “Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự để xác định đột biến điểm của gen APC ở bệnh nhân mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình”
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Trang 3chứng lâm sàng và nội soi phát hiện có polyp đại
trực tràng với số lượng polyp đại trực tràng > 20
polyp
Phương pháp nghiên cứu
Ly trích DNA từ máu ngoại vi
Các bệnh nhân được lấy 2ml máu tĩnh mạch,
chống đông bằng EDTA và được ly trích DNA
bằng kit Qiagen Sau ly trích, tiến hành đo quang
để kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA,
chỉ những mẫu DNA đạt chất lượng mới tiến
hành các bước phân tích tiếp theo
Thực hiện phản ứng PCR
Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu để khuếch
đại toàn bộ chiều dài gen APC Trình tự các
cặp mồi và chu trình luân nhiệt đã được chuẩn hóa Sau khi thực hiện phản ứng PCR, tiến hành điện di sản phẩm khuếch đại trên gel agarose 1,5%, chỉ những đoạn khuếch đại có vạch đồng nhất, bờ đều, sắc gọn mới được sử dụng để giải trình tự gen
Thực hiện phản ứng giải trình tự
Tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR, thực hiện phản ứng cycle sequence và tinh sạch sản phẩm khuếch đại Sau đó điện di trên máy ABI
3500 Sử dụng phần mềm chuyên dụng để phân tích kết quả giải trình tự và xác định đột biến gen APC Trình tự chuẩn của gen APC mang mã số NG_008481
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả của bệnh nhân FAP 01
Kết quả giải trình tự exon 14
Hình 1 Kết quả giải trình tự exon 14 của gen APC ở bệnh nhân FAP 01
Nhận xét:
Tại vị trí c.1458 trình tự nucleotid của
Genbank là T, trong khi đó vị trí này ở bệnh
nhân xuất hiện hai đỉnh ứng với hai allele, một
allele có trình tự T và 1 allele có trình tự
nucleotid C Kiểm tra bằng phần mềm SNP Check cho thấy đây là một SNP (single nucleotide polymorphism) chứ không phải là đột biến
Trang 4Kết quả giải trình tự exon 18
Hình 2 Kết quả giải trình tự exon 18 của gen APC ở bệnh nhân FAP 01
Nhận xét
Tại vị trí c.6691 trình tự nucleotid của
genbank là A, trong khi đó vị trí này ở bệnh
nhân xuất hiện hai đỉnh ứng với hai allele, một
allele có trình tự A và 1 allele có trình tự
nucleotid T Sự thay đổi A thành T làm thay đổi acid amin tại codon 2231 từ Isoleucin thành Phenylalanin, như vậy làm thay đổi cấu trúc của protein do gen APC tổng hợp nên
Kết quả bệnh nhân FAP 06
Đột biến thêm thêm A
Trang 5Nhận xét: Có sự chèn thêm 1 nucleotid A
trong vùng c.4661-c.4666, do vậy kết quả giải
trình tự ở mồi xuôi xuất hiện sóng đôi từ vị trí
c.4667 (hình FAP06_18G-F) Trong khi đó ở đoạn
gen khuếch đại bằng mồi ngược, sóng đôi xuất
hiện từ vị trí c.4660 Đột biến này làm xuất hiện
mã kết thúc (TGA) tại codon 1558 Đột biến đã được Gismondi công bố trên tạp chí Human Mutation vào năm 1997
Kết quả của bệnh nhân FAP 09
Hình 4 Kết quả phân tích gen APC của bệnh nhân FAP 09
Nhận xét: Tại vị trí c.1165, trình tự nucleotid
của genbank là A, trong khi đó vị trí này ở bệnh
nhân FAP 09 xuất hiện hai đỉnh ứng với hai
allele, một allele có trình tự A và 1 allele có trình
tự nucleotid T Sự thay đổi A thành T làm thay
đổi acid amin tại codon 389 từ Asparagin thành Tyrosin, như vậy làm thay đổi cấu trúc của protein do gen APC tổng hợp nên Đột biến đã
được Chen SP công bố trên tạp chí Am J Clin Oncol vào năm 2009
Kết quả của bệnh nhân FAP 11
Hình 5 Kết quả phân tích gen APC của bệnh nhân FAP 11
Trang 6Nhận xét: Tại vị trí c.4367, trình tự nucleotid
của genbank là A, trong khi đó vị trí này ở bệnh
nhân FAP 11 xuất hiện hai đỉnh ứng với hai
allele, một allele có trình tự A và 1 allele có trình
tự nucleotid C Sự thay đổi A thành T làm thay
đổi acid amin tại codon 1456 từ Lysin thành
Threonin, như vậy làm thay đổi cấu trúc của
protein do gen APC tổng hợp nên
BÀN LUẬN
Đột biến gen từ lâu đã được xác định là một
trong những nguyên nhân gây bệnh quan trọng,
đặc biệt là các bệnh lý di truyền Đây là những
tổn thương xảy ra sớm nhất trong bộ gen người
và dưới tác dụng của cơ chế điều hòa gen cùng
với sự tương tác của các phân tử nội bào hay sự
tương tác tế bào mà biểu hiện thành các thể bệnh
nặng, nhẹ khác nhau Đột biến gen có thể đã tồn
tại trong cơ thể người bệnh nhưng cũng có thể là
mới phát sinh trong cuộc sống hàng ngày dưới
tác động của nạn ô nhiễm môi trường, tình trạng
sử dụng các thực phẩm được bảo quản bằng các
hóa chất độc hại,… Trong những năm gần đây ở
Việt Nam, đã có nhiều công trình nghiên cứu xác
định đột biến gen trong các bệnh lý di truyền và
đã đưa ra các quy trình chẩn đoán ở bệnh nhân
cũng như việc phát hiện người lành mang gen
bệnh Điều này có ý nghĩa thực tiễn cao, giúp
làm giảm tỷ lệ bệnh di truyền cũng như sự lan
truyền gen bệnh trong cộng đồng Đối với bệnh
đa polyp tuyến gia đình, tác giả Nguyễn Phương
Anh đã tiến hành nghiên cứu xác định đột biến
trên exon 15 của gen APC ở bệnh nhân ung thư
đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình cũng
như phát hiện đột biến gen ở người nhà của
bệnh nhân(5) Một trong những biến chứng của
bệnh đa polyp tuyến gia đình là khả năng tiến
triển thành ung thư đại trực tràng (UTĐTT)- đây
là bệnh di truyền thường gặp trong ung thư
đường tiêu hoá Ngày nay tỷ lệ bệnh nhân mắc
bệnh UTĐTT trên toàn thế giới tăng lên Ở Việt
sau ung thư dạ dày và ung thư gan(9) Năm 2006, Nguyễn Văn Hiếu tiến hành nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và giải phẫu bệnh của ung thư đại trực tràng tại bệnh viện K và đưa ra kết luận: việc phát hiện ung thư đại trực tràng ở giai đoạn sớm (giai đoạn Dukes A) góp phần nâng cao hiệu quả điều trị(8)
Các nghiên cứu khẳng đình đa polyp tuyến gia đình nếu không được phát hiện sớm và điều trị kịp thời thì 100% bệnh nhân sẽ tiến triển thành ung thư đại trực tràng(4) Việc chẩn đoán đột biến gen APC ở các bệnh nhân mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình là cơ sở cho việc chẩn đoán người lành mang gen bệnh cũng như giúp phát hiện sớm đột biến ở các thành viên khác trong gia đình, có thể các thành viên này đã xuất hiện triệu chứng lâm sàng hoặc chưa Như vậy sẽ đưa
ra được phương thức điều trị thích hợp, giảm biến chứng ung thư đại trực tràng ở các đối tượng mắc bệnh Có hai dạng đột biến gen APC phổ biến ở bệnh nhân FAP là đột biến điểm (chiếm 60-70%) và đột biến mất đoạn (chiếm 10-15%) Để phát hiện đột biến điểm, chúng tôi đã xây dựng quy trình giải trình tự các đoạn exon
và vùng nối exon-intron của gen APC
Ở bệnh nhân FAP 01, khi giải trình tự exon
14 chúng tôi phát hiện tại vị trí c.1458 trình tự nucleotid của genbank là T, trong khi đó vị trí này ở bệnh nhân xuất hiện hai đỉnh ứng với hai allele, một allele có trình tự T và 1 allele có trình
tự nucleotid C Kiểm tra bằng các phần mềm kiểm tra SNP, chúng tôi phát hiện đây là một SNP chứ không phải là đột biến Điều này có nghĩa khi phân tích vị trí này trong cộng đồng, một số người bình thường xuất hiện nucleotid T tại vị trí này, trong khi đó một số cá thể bình thường khác lại xuất hiện nucleotid C (tần suất > 1%) Như vậy một trong những vấn đề quan trọng của giải trình tự là vấn đề phân tích các khác thường tại 1 hoặc nhiều nucleotid, cần xác định xem đây là SNP hay là đột biến điểm gây
Trang 7tích các bất thường quan sát được ở các bệnh
nhân FAP
Khi khảo sát exon 18 của bệnh nhân FAP 1,
Tại vị trí c.6691 trình tự nucleotid của genbank là
A, trong khi đó vị trí này ở bệnh nhân xuất hiện
hai đỉnh ứng với hai allele, một allele có trình tự
A và 1 allele có trình tự nucleotid T Sử dụng các
phần mềm kiểm tra SNP, chúng tôi nhận thấy
đây không phải là SNP và bất thường này có khả
năng gây bệnh rất cao Sự thay đổi A thành T
làm thay đổi acid amin tại codon 2231 từ
Isoleucin thành Phenylalanin, như vậy làm thay
đổi cấu trúc của protein do gen APC tổng hợp
nên Như vậy chúng tôi kết luận bệnh FAP 01 bị
đột biến điểm tại vị trí c.6691A>T
Tương tự phân tích gen APC của các bệnh
nhân khác chúng tôi phát hiện có 04 bệnh nhân
mang đột biến điểm trong tổng số 11 bệnh nhân
được phân tích Nghiên cứu chỉ là bước đầu
chẩn đoán trên một số bệnh nhân, chúng tôi sẽ
tiếp tục nghiên cứu trên cỡ mẫu lớn hơn để đưa
ra các vị trí đột biến thường gặp ở bệnh nhân
FAP Việt Nam Bên cạnh đó chúng tôi sẽ tiến
hành phân tích kiểu gen của các thành viên khác
trong gia đình của các bệnh nhân phát hiện có
đột biến để xác định nguy cơ mắc bệnh của các
thành viên khác, đồng thời đưa ra lời khuyên di
truyền và có hướng điều trị thích hợp nhằm
giảm nguy cơ ung thư cho các thành viên khác
KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã ứng dụng thành công quy
trình giải trình tự để xác định đột biến điểm của
gen APC trên bệnh nhân mắc bệnh đa polyp
tuyến gia đình, nghiên cứu là tiền đề giúp lĩnh
vực ung thư nói chung là ung thư đại trực tràng
do đa polyp nói riêng ngày càng phát triển, giúp
các bác sĩ lâm sàng chẩn đoán chính xác và điều
trị bệnh
TÀI LIỆU THAM KHẢO:
1 Cao X, Hong Y, Eu KW, Loi C, Cheah PY (2006) Singapore familial adenomatous polyposis (FAP) patients with classical adenomatous polyposis but undetectable APC
mutations have accelerated cancer progression Am J
Gastroenterol 101(12):2810-7
2 Chiang JM, Chen HW, Tang RP, Chen JS, Changchien CR, Hsieh PS, Wang JY (2010) Mutation analysis of the APC gene in Taiwanese FAP families: low incidence of APC germline mutation in a distinct subgroup of FAP families
Familial Cancer 9(2): 117-124
3 Gómez-Fernández N, Castellví-Bel S, Fernández-Rozadilla C, Balaguer F, Muñoz J, Madrigal I, Milà M, Graña B, Vega A, Castells A, Carracedo A, Ruiz-Ponte C (2009) Molecular analysis of the APC and MUTYH genes in Galician and Catalonian FAP families: a different spectrum of
mutations BMC Med Genet 10:57
4 Hosogi H, Nagayama S, Kanamoto N, Yoshizawa A, Suzuki
T, Nakao K, Sakai Y (2009) Biallelic APC inactivation was responsible for functional adrenocortical adenoma in familial adenomatous polyposis with novel germline
mutation of the APC gene: report of a case Jpn J Clin Oncol
39(12):837-46
5 Marra G, Jiricny J (2003) Multiple colorectal adenomas is
their number up? N Engl J Med 348(9):845-7
6 Nguyễn Phương Anh (2011) Nghiên cứu đột biến gen APC ở bệnh ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình Luận án tiến sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội
7 Nguyễn Thị Lụa, Lê Thị Tài, Lê Trần Ngoan (2007) Nghiên cứu thực trạng ung thư dạ dày và giải pháp
phòng bệnh ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam Nghiên cứu
y học, tập 50 (4), tr.130-7
8 Nielsen M, Bik E, Hes FJ, Breuning MH, Vasen HF, Bakker E, Tops CM, Weiss MM (2007) Genotype-phenotype correlations in 19 Dutch cases with APC gene deletions
and a literature review Eur J Hum Genet 15(10):1034-42
9 Powell SM, Zilz N, Beazer B, Bryan Y, Hamilton TM et al (1992) APC mutations occur early during colorectal
tumorigenesis Nature 359: 235-237
10 Sheng JQ, Cui WJ, Fu L, Jin P, Han Y, Li SJ, Fan RY, Li AQ, Zhang MZ, Li SR (2010) APC gene mutations in Chinese
familial adenomatous polyposis patients World J Gastroenterol
16(12):1522-6
Ngày nhận bài báo: 29/8/2015 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 16/9/2015 Ngày bài báo được đăng: 20/10/2015 20/10/2015