Bài thuyết trình Ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất thuốc bảo vệ thực vật trình bày về những kiến thức về thuốc trừ sâu sinh học Biopesticides, các virus côn trùng thuộc họ Baculoviridae, ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất thuốc bảo vệ thực vật,... Mời các bạn cùng tham khảo nội dung bài thuyết trình để nắm bắt nội dung chi tiết.
Trang 1Tr ườ ng Đ i H c Nông ạ ọ
Trang 3Có 2 h ướ ng ng d ng công ngh sinh h c phân t trong v n đ ứ ụ ệ ọ ử ấ ề
t o gi ng và s n xu t thu c tr sâu sinh h c: ạ ố ả ấ ố ừ ọ
C t phân l p và tái t h p các gien s n xu t protein k t tinh ắ ậ ổ ợ ả ấ ế
( n i đ c t ) c a B.thuringiensis và plasmid c a E.coli và s n xu t ộ ộ ố ủ ủ ả ấ
theo phương pháp CNSH
S n xu t Baculovirus theo phả ấ ương pháp nuôi c y t bào. Đ tăng ấ ế ể
cường tính gây b nh c a baculovirus, gi m th i gian nung b nh và ệ ủ ả ờ ệ
gây ch t nhanh công trùng, ngế ười ta tái t h p gien s n xu t n c ổ ợ ả ấ ọ
đ c c a ong, nh n vào virus baculovirus và s n xu t theo l i CNSH.ộ ủ ệ ả ấ ố
Trang 4 Các lo i vi khu n Bacillus thạ ẩ ường sinh trưởng, phân chia m nh và ạ
khi môi trường nghèo ch t dinh dấ ưỡng, chúng hình thành bào t ử
1.Vi khu n Bacillus ẩ
thuringgiensis làm thu c tr sâu ố ừ
sinh h c ọ
Bào t là m t d ng quá đ c a s sinh s n, đử ộ ạ ộ ủ ự ả ược hình thành trong
đi u ki n b t l i c a môi trề ệ ấ ợ ủ ường và có tính kháng v i ngo i c nh khá ớ ạ ả
cao
Các lo i Bacillus trong quá trình hình thành có s n xu t m t ạ ả ấ ộ
lo i protein nào đó, r t đ c đ i v i các loài VSV khác.ạ ấ ộ ố ớ
Ph ươ ng Pháp Th c Hi n ự ệ
Trang 7Có 2 ch ng Bacillus thunringiensis đáng quan tâm ủ
Bacillus thurigiensis var.israelensis: lo i này gây b nh cho ạ ệ
h u h t côn trùng hút máu nh mu i, ve, bét,…đ ầ ế ư ổ ượ c coi là vector truy n b nh ng ề ệ ở ườ i và đ ng v t ộ ậ
Bacillus thurigiensis var.tenebrionis phát hi n năm ệ
1983, có tác d ng gây b nh v i các loài b gây thi t h i ụ ệ ớ ọ ệ ạ
l n v i khoai tây ớ ớ
Trang 8var.israelensis Bacillus thurigiensis
var.tenebrionis
Trang 9Tinh th protein n i bào ( n i đ c t $ ) và gien ể ộ ộ ộ ố
Cry
Tinh th proteun có th là d ng hình bình hành, ể ể ạ
nhi u góc c nh ho c hình kh i đa chi u.ề ạ ặ ố ề
Tinh th protein c a Bacillus thuringiensis để ủ ược
hình thành trong khi nha bào hóa ( sporulation )
Nha bào:m t d ng ti m sinh c a các lo i ộ ạ ề ủ ạ
vi khu n trong h Bacillus ẩ ọ
Tinh th protein để ược mang trong nha bào là
m t ti n đ c t ( protoxin )ộ ề ộ ố
Trang 10 Tinh th protein hình bình hành bao g m 2 lo i ể ồ ạ
protein ti n đ c t : m t lo i có phân t l ề ộ ố ộ ạ ử ượ ng 135
Kda, 2 lo i có phân t l ạ ử ượ ng 140 Kda. T t c đ u đ c ấ ả ề ặ
hi u gây đ c cho côn trùng trong l p Lepidoptera ệ ộ ớ
Tinh th hình kh i ch ch a duy nh t m t protoxin có ể ố ỉ ứ ấ ộ
phân t l ử ượ ng 65 Kda và đ c hi u gây đ c cho c ặ ệ ộ ả
Lepidoptera v Diptera ả
Trang 11Có 4 nhóm gien Cry s n xu t các lo i tinh th protein ả ấ ạ ể
CryI s n xu t tin th protein đ c hi u gây b nh cho l p ả ấ ể ặ ệ ệ ớ
Trang 12Th c ch t gien Cry không n m trong h gien ự ấ ằ ệ
c a Bacillus thuringiensis mà là do các lo i ủ ạ
plasmid c a Bacillus thuringiensis c u mang ủ ư
Lo i plasmid 67.000 nucleotide ch a gien CryI s n xu t lo i protoxin ạ ứ ả ấ ạ
135Kda và lo i plasmid này có th dùng đ chuy n n p qua l i trong ạ ể ể ể ạ ạ
các ch ng Bacillus thuringiensis .ủ
Lo i plasmid 174.000 nucleotide có 2 gien CryI và CryII, s n xu t ạ ả ấ
protoxin 140 Kda, và 65 Kda. Lo i plasmid này ch thích ng riêng ạ ỉ ứ
cho ch ng Bacillus thuringiensis typ HD1.ủ
Trang 13Khi mem protease trong h tiêu hóa c a côn trùng ệ ủ
phân c t r i thành các ti u ph n khác nhau ắ ờ ể ầ
Ti u ph n protein có tính đ c v i côn trùng ch có phân ể ầ ộ ớ ỉ
t lử ượng 60 – 70 Kda. Đó là ph n ho t tính, các ph n ầ ạ ầ
khác ch có ch c năng làm n n và b o v đó là phàn k t ỉ ứ ề ả ệ ế
tinh
Trang 14Tái t h p gien Cry Công ngh sinh h c s n xu t tinh ổ ợ ệ ọ ả ấ
th protein di t công trùng ể ệ
Ch ng Bacillus thuringiensis cung c p ngu n gien Cry đủ ấ ồ ược
dùng hi n nay là Bacillus thuringiensis aizawai typ IPL 7, s n xu t ệ ả ấ
2 protoxin: 130 KDa và 135 KDa .
Khi 2 gien Cry ch u trách nhi m s n xu t 2 lo i protoxin này ị ệ ả ấ ạ
được tái t h p vào plasmid c a E.coli thì trong t bào E.coli các ổ ợ ủ ế
tinh th protein c a protoxin để ủ ượ ảc s n xu t và thu đấ ược g n ầ
nh nguyên ch t.ư ấ
Trang 15Bacillus thuringiensis aizawai typ IPL 7
Trang 161.Tái T H p ổ ợ
Gen
Công ngh sinh h c s n xu t n i đ c t delta c a Bacillus ệ ọ ả ấ ộ ộ ố ủ
thuringiensis s d ng k thu t tái t h p gien ữ ụ ỹ ậ ổ ợ
Các gien Cry đ c hi u v i nhóm ặ ệ ớ
Lepidoptera c a Bacillus ủ
thuringiensis đượ ắc c t và phân
l p r i n i vào plasmid c a E.coliậ ồ ố ủ
+ Gien Cry đượ ấ ừc l y t Bacillus thuringiensis var.berliner chuy n ễ
n p vào E.coli, cho s n ph m protoxin ký hi u Bt2.ạ ả ẩ ệ
+ Tái t h p gien Cry t Bacillus thuringiensis var.aizawai typ HDổ ợ ừ
68 vào E.coli cho s n ph m Bt3.ả ẩ
Trang 172.Chuy n protoxin thành toxin ể
Protoxin thành ph m sau khi đ ẩ ượ c x lý b ng mem trypxin, ữ ằ
s chuy n thành toxin ẽ ễ
Mem Trypxin gi ng nh các lo i mem phân c t protein có ố ư ạ ắ
trong ru t côn trùng, đã c t protoxin cho m t ti u ph n ộ ắ ộ ể ầ
kho ng 60Kda có ho t tính gây đ c ả ạ ộ
Lo i mem trypxin và các thành ph n khác, chúng ta thu ạ ầ
đ ượ c đ c t tinh khi t ộ ố ế
Trang 183. Chu n đ đ c t ẩ ộ ộ ố
Chu n đ đ c t ( toxin titration ): t c là tìm li u l ẩ ộ ộ ố ứ ề ượ ng thích
h p c a m t lo i đ c t đ gây nhi m m t lo i côn trùng ợ ủ ộ ạ ộ ố ể ễ ộ ạ
nh t đ nh ấ ị
Có 2 lo i u trùng đ ạ ấ ượ ữ ụ c s d ng đ chu n đ đ c t : ể ẩ ộ ộ ố
- Ấ u trùng sâu cu n thu c lá ( Manduca sexta ) ố ố
- u trùng b Ấ ướ m tr ng ( Pieris brassicae ) ắ
Trang 19u trùng sâu cu n thu c
lá ( Manduca sexta)
Trang 20u trùng b m
tr ng ( Pieris ắ
brassicae )
Trang 21- Đ c t đ ộ ố ượ c hòa thành các n ng đ khác nhau, ồ ộ
th m vào th c ăn và cho chúng ăn trong giai đo n ấ ứ ạ
phát tri n t u trùng thành nh ng ể ừ ấ ộ
- Sau khi tính toán đ ượ ượ c l ng đ c t gây ch t 50% ộ ố ế
u trùng chu n đ , t đó ta có thông s c n thi t
đ s d ng đ c t ch ng côn trùng phá ho i mùa ể ữ ụ ộ ố ố ạ
màng.
Trang 22 Chi m trên 60% t ng s gây b nh cho côn trùngế ổ ố ệ
Chúng hoàn toàn không gây nhi m và gây b nh cho ngễ ệ ười,
đ ng v t, k c th c v t. ộ ậ ể ả ự ậ
Trang 24u trùng nhi m baculovirus theo đ ng th c
ăn
Khi đã vào h tiêu hóa, virus xâm nh p vào các t bào bi u mô và ệ ậ ế ể
th c hi n chu k nhân lên c a mình.ự ệ ỳ ủ
Trong các t bào b nhi m, trề ị ễ ước h t AND c a virus th c hi n s ế ủ ự ệ ự
nhân lên c a mình theo c ch b xung, thủ ơ ế ổ ường là 1224h sau khi b ị
nhi m.ễ
Trong vòng 2472 h ti p theo các lo i protein c n thi t đc t ng h p ế ạ ầ ế ổ ợ
sau cùng là protein v b c ỏ ọ polyhedrin
Trang 25Hi n nay có m t s lo i baculovirus đang đ ệ ộ ố ạ ượ c ngiên c u s d ng làm thu c tr sâu sinh h c ứ ử ụ ố ừ ọ
AcMNPV ( Autographa californica Multiple Nuclear Polyhedrosis Virus )
HzSNPV ( Helicoverpa zea Single Multiple Nuclear Polyhedrosis Virus )
OpMNPV ( Orgyia pseudotsugata Multiple Nuclear Polyhedrosis Virus )
LdMNPV ( Lymantria dispar Multiple Nuclear Polyhedrosis Virus )
Trang 26 Polyhedrin có tác d ng b o v virus v i môi trụ ả ệ ớ ường ngo i c nh, ạ ả
nh ng so v i lo i protein khác c a virus, thì lo i polyhedrin này không ư ớ ạ ủ ạ
th c s c n thi t cho l m trong chu k nhân lên c a virus.ự ự ầ ế ắ ỳ ủ
Protomer c a polyhedrin là m t protomer m nh. L i d ng đ c tính ủ ộ ạ ợ ụ ặ
này, người ta đã thi t k baculovirus làm lo i virus vector bi u th gen ế ế ạ ể ị
ngo i lai ( expression vector ).ạ
Hi n nay lo i AcMNPV đc thi t k v i m c đích đó. Ngệ ạ ế ế ớ ụ ười ta c t bõ ắ
hoàn toàn gen polyhedrin nh ng v n gi protomer c a nó. Thay vào ư ẫ ữ ủ
đó, người ta đã n i m t chu n MCS ( multiple cuting site = vùng c t ố ộ ổ ắ
c a các enzym h n ch ) đ làm vùng ti p nh n gen ngo i lai.ủ ạ ế ể ế ậ ạ
Trang 28Đ i v i baculovirus t nhiên ố ớ ự
Không gây đ c đ i v i ng ộ ố ớ ườ i và đ ng ộ
v t ậ
Thay th đc 1 s thu c tr sâu đ c t n d ế ố ố ừ ộ ồ ư
trên s n ph m, gây h i cho đ i t ả ẩ ạ ố ượ ng tiêu
thụ
Trong đi u cho phép ngề ười ta khuy n khích dùng thu c tr ế ố ừ
sâu sinh h c đ c bi t là baculovirus vì chúng an toàn h n, d ọ ặ ệ ơ ễ
s n xu t và giá thành ch p nh n đả ấ ấ ậ ược
Hi n nay có 2 lo i đc s d nng ệ ạ ử ụ
Anh Neodiprion sertifer MNPV và Panolis MNPV
Trang 30Tên gen được tái t ổ
h pợ Tác d ng ụ Thời gian gây chết
giảmHocmon bài ti t ế
Trang 31Có hai hướng chọn lọc các loại gen gây độc của côn trùng rồi tái tổ hợp vào baculovirus
Chọn các gen thuộc nhóm sản xuất độc tố
Có hi u l c th t s , gi m th i gian ệ ự ậ ự ả ờ
gây ch t đ i v i côn trùng nh ng ế ố ớ ư
th c t xét v hi u qu kinh t ch a ự ế ề ệ ả ế ư
l n l m.ớ ắ Gen AaIT được tái tổ hợp vào
baculovirus tái t h p. Th i gian g y ổ ợ ờ ấ
ch t t lúc nhi m ch còn 2 ngày.ế ừ ễ ỉ
Trang 32Tái tổ hợp gen sản xuất hợp chất sinh
học.
Có th nói gen đi u hòa hormon bài ti t ( diuretin hormone ) khi đc ể ề ế
tái t h p vào baculovirus có tác d ng g y ch t côn trùng nhanh, ổ ợ ụ ấ ế
hi u qu và ph r ng.ệ ả ổ ộ
Có nhi u lo i côn trùng b nhi m baculovirus tái t h p này h n là ề ạ ị ễ ổ ợ ơ
baculovirus tái t h p gen toxin, b i l toxin thổ ợ ở ẽ ường có tác d ng đ c ụ ặ
hi u cho t ng l p côn trùng nh t đ nh.ệ ừ ớ ấ ị
M t hộ ướng khác là t n d ng hormon sinh trậ ụ ưởng JHE ( Juvenile
hormone esterase ). Côn trùng thường qua nhi u giai đo n phát tri n và ề ạ ể
l t xác. ộ
N u u trùng b nhi m baculovirus tái t h p ch gen JHE, thì ế ấ ị ễ ổ ợ ứ
hormine này s làm r i lo n quá trình sinh trẽ ố ạ ưởng, đình tr tiêu hóa và ệ
gây ch t.ế
Trang 33K t Qu Th c Hi n ế ả ự ệ
Ngày nay đ c t di t côn trùng c a Bt s n b ng công ngh sinh h c ộ ố ệ ủ ả ằ ệ ọ
và k thu t tái t h p gen đc s d ng r ng rãi di t các côn trùng sau:ỹ ậ ổ ợ ử ụ ộ ệ
Loài b ướ m tr ng, sâu b p c i trông lĩnh v c tr ng rau ắ ắ ả ự ồ
Loài sâu cu n b p c i, gây h i b p c i, rau, đ u ố ắ ả ạ ắ ả ậ
Loài sâu bông trông c ng nghi p tr ng sâu bông ộ ệ ồ
Loài sâu thu c lá trông công nghi p tr ng thu c lá ố ệ ồ ố
B khoai tây trông công nghi p tr ng khoai tây ọ ệ ồ
Các loài sâu phá ho i 1 s cây r ng ạ ố ừ
u trùng mu i ch ng b nh s t rét, s t xu t huy t.
Trang 34- Tái t h p gen s n xu t đ c t c a Bt đ s n xu t b ng con ổ ợ ả ấ ộ ố ủ ể ả ấ ằ
đường CNSH, đã ch đ ng đ có đ c t thành ph m phòng ch ng ủ ộ ể ộ ố ẩ ố
côn trùng
- Cũng b ng KT CNSH phân t , ngằ ử ười ta ti n hành chuy n n p các ế ể ạ
lo i plasmid có mang gen đ c t t các ngu n khác nhau vào các ạ ộ ố ừ ồ
lo i Bt khác nhau trong t nhiên , đ chúng có kh năng s n xu t ạ ự ể ả ả ấ
các lo i đ c t di t côn trùng khác nhau.ạ ộ ố ệ
Baculovirus
Baculovirus tái t h p gen ngo i lai gây đ c cũng nh baculovirus t ổ ợ ạ ộ ư ự
nhiên đượ ảc s n xu t theo phấ ương pháp k thu t gen và CNSH đã góp ỹ ậ
ph n to l n phá ho i côn trùng gây h i mùa màng trên th gi i.ầ ớ ạ ạ ế ớ
Trang 35 Tuy nhiên, người ta lo ng i các gen đ c ( đ c bi t là gen toxin ) ạ ộ ặ ệ
s n xu t toxin nh v y, li n có gây đ c cho các đ i tả ấ ư ậ ệ ộ ố ượng khác
Khía c nh lo ng i nh v y là hoàn toàn có căn c , nh ng chúng ta có ạ ạ ư ậ ứ ư
th yên tâm, vì baculovirus là lo i virus hoàn toàn đ c hi u gây b nh ể ạ ặ ệ ệ
h i cho côn trùng, do v y dù baculovirus đc tái t h p gen s n xu t ạ ậ ổ ợ ả ấ
s n ph m đ c, chúng cũng không gây nhi m đc cho đ ng v t b c cao.ả ẩ ộ ễ ộ ậ ậ
Khi không gây nhi m đc, thì không có quá trình nhân lên, không s n ễ ả
xu t ra các s n ph m protein ngo i lai, trong đó có ch t đ c sinh h c ấ ả ẩ ạ ấ ộ ọ
do gen ngo i lai s n xu t.ạ ả ấ
Trang 36Tài li u tham kh o ệ ả
1. Công Ngh Sinh H c Đ i V i V t Nuôi Và Cây Tr ng GS.Ts Đái Duy Ban_Ths. ệ ọ ố ớ ậ ồ
Lê Thanh Hòa.
2. Công Ngh Sinh H c Trong B o V Th c V t – PGS.Ts Ph m Th Thùyệ ọ ả ệ ự ậ ạ ị
3. Tuy n T p Công Trình Nghiên C u B o V Th c V t 19901995 – Vi n B o ể ậ ứ ả ệ ự ậ ệ ả
V Th c V t.ệ ự ậ
4. Giáo trình công ngh vi sinh v t trong s n xu t nông nghi p và x lý môi ệ ậ ả ấ ệ ử
trường PGS.TS. Nguy n Xuân Thành. ễ
5. Th c Tr ng V S n Xu t Và ng D ng Các Ch Ph m Vi Sinh V t Đ Phòng ự ạ ề ả ấ Ứ ụ ế ẩ ậ ể
Tr D ch H i Cây Tr ng Vi t Nam Trong 20 Năm Qua – PGS.Ts Ph m Th ừ ị ạ ồ ở ệ ạ ị
Thùy.
6. Nghiên c u công ngh s n xu t và s d ng thu c sâu sinh h c (Bt, NPV, n m ứ ệ ả ấ ử ụ ố ọ ấ
Bb, Ma) th h m i tr sâu trong s n xu t rau an toàn PGS.Ts Ph m Th Thùyế ệ ớ ừ ả ấ ạ ị
7 Tuy n t p công trình Nghiên c u chuy n giao khoa h c và công ngh , nhân 40 ể ậ ứ ể ọ ệ
năm thành l p Vi n BVTV –NXB Nông Nghi pậ ệ ệ