Mục đích của đề tài Xác định tác nhân và khảo sát hiệu lực một số loại thuốc hoá học trong phòng trừ thối nhũn trái thanh long (Hylocereus Undatus L.) nhằm xác định tác nhân gây bệnh thối trái thanh long và khảo nghiệm một số loại thuốc hóa học phòng trừ bệnh.
Trang 1XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN VÀ KHẢO SÁT HIỆU LỰC MỘT SỐ LOẠI THUỐC HOÁ HỌC TRONG PHÒNG
TRỪ THỐI NHŨN TRÁI THANH LONG
Trang 2Nội dung báo cáo
Phần 1: Mở đầu
Phần 2: Vật liệu và phương pháp thí nghiệm Phần 3: Kết quả
Phần 4: Kết luận và đề nghị
Trang 3Phần 1: Mở đầu
1 Đặt vấn đề
Thanh long đem lại hiệu quả kinh tế cao và nâng cao thu nhập đáng kể
cho nông dân ở các vùng trồng
Thời gian gần đây, trong thực tế sản xuất đã xuất hiện một loại dịch hại
mới gây ảnh hưởng không nhỏ cho cây thanh long, đó là bệnh thốinhũn trái thanh long
Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn trên đề tài “Xác định tác nhân và khảo
sát hiệu lực một số loại thuốc hoá học trong phòng trừ bệnh thối nhũn trái thanh long (Hylocereus undatus L.)” được thực hiện.
Trang 4Mục đích và yêu cầu
2 Mục đích
➢ Xác định tác nhân gây bệnh thối trái thanh long và khảo
nghiệm một số loại thuốc hóa học phòng trừ bệnh
3 Yêu cầu
➢ Xác định và phân lập tác nhân gây bệnh thối nhũn trái
➢ Khảo nghiệm tìm ra loại thuốc phòng trị bệnh thối nhũn trái
hiệu quả
Trang 5Phần 2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
1 Thời gian và địa điểm thực hiện
2 Vật liệu
3 Phương pháp
Trang 6Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian:
tháng 07 năm 2011.
Địa điểm thực hiện:
tại Quơn Long – Chợ Gạo – Tiền Giang.
hiện tại Viện Cây Ăn Quả Miền Nam.
Trang 7Vật liệu
• Phân lập, nuôi cấy: đĩa petri, môi trường nuôi cấy PDA và NA, giấy thấm, tủ cấy…
bình phun, kim tiêm y tế, bông y tế, kéo…
hiển vi, lam, lamen, đèn cồn….
Trang 8Phương pháp
1 Phân lập, nuôi cấy
2 Giám định tác nhân nấm
3 Giám định tác nhân vi khuẩn
4 Kiểm chứng tác nhân thông qua quy trình Koch
Trang 91 Phân lập, nuôi cấy
Trang 10Giám định tác nhân nấm
➢Nấm sau khi được phân lập và giữ mẫu trên môi trường PDA
để quan sát và giám định
Phương pháp giám định:
➢Được thực hiện theo tài liệu của Clements (1973)
➢Quan sát tơ nấm, hạch nấm, bào tử … bằng kính hiển vi.
Trang 11Giám định tác nhân vi khuẩn
- Dựa vào hình dạng, phản ứng khi nhuộm gram, hình dạng khuẩn lạc…
- Dựa vào các phản ứng sinh hóa định danh cho từng loài vi khuẩn riêng biệt như: khử citrate, phân hủy tinh bột,
catalase….theo tài liệu của N.S.Schaad (1988)
Trang 12Kiểm chứng tác nhân thông qua quy trình Koch
Mục đích: kiểm chứng lại tác nhân gây bệnh
Địa điểm: tại trại thực nghiệm – Viện Cây Ăn Quả Miền Nam
Phương pháp:
● Chủng riêng từng loại vi khuẩn được pha sẵn ở nồng độ 3,6.10-6
cfu/ml
● Dùng ống tiêm y tế hút 1ml dung dịch chứa vi khuẩn và tiêm vào
20 nụ dưới 10 ngày tuổi và trái non mới rút râu
● Bao nụ và trái lại để tránh nhiễm tác nhân bên ngoài
Trang 13Phản ứng sinh hóa
1 Thủy phân tinh bột
2 Phản ứng Catalase
3 Khả năng phân giải citrate
4 Khả năng gây thối nhũn khoai tây
Trang 14Thủy phân tinh bột
Vật liệu: môi trường tinh bột, ống nghiệm chứa nước cất khử trùng,, vi khuẩn cấy trên môi trường NA, giấy thấm được cắt sẵn hấp khử trùng (đường kính 0.5cm), dung dịch Lugol Iodine
Phương pháp
Hòa khoanh khuẩn ty vào ống nghiệm nước cất, lắc đều
Cho giấy thấm vào ống nghiệm chứa dịch khuẩn, vớt ra và cấy vào đĩa môi trường tinh bột đã chuẩn bị sẵn, ủ 5 trong 5 ngày
Dùng pipett rút 5ml Lugol Iodine cho vào vừa ngập đĩa petri và quan sát.Kết quả: dương tính nếu khuẩn lạc không bắt màu, âm tính khi khuẩn lạc
có màu nâu
Trang 15Phản ứng Catalase
- Vi khuẩn được nuôi từ 18 -24 giờ trên môi trường NA
- Dùng que cấy dích khuẩn lạc của vi khuẩn đặt lên lam kính
- Cho một giọt hydrogen peroxide 3% (H2O2) vào khối vi khuẩn
và quan sát
- Kết quả: có sủi bọt khí chứng tỏ phản ứng catalase dương tính
và ngược lại
Trang 16Khả năng phân giải citrate
Vật liệu: môi trường Simmon’s Citrate Agar, ống nghiệm…
Phương pháp:
● Môi trường được chuẩn bị sẵn đổ vào ống nghiệm và hấp khử trùng
● Sau khi cấy vi khuẩn, đặt các ống nghiệm ở điều kiện nhiệt độ phòng
và quan sát kết quả sau 4 ngày
● Kết quả được quan sát thông qua sự thay đổi màu, nếu phản ứng
dương tính thì màu sắc của môi trường sẽ chuyển sang màu xanh da trời và ngược lại (màu xanh lá cây)
Trang 17Khả năng gây thối nhũn khoai tây
Thí nghiệm được thực hiện trong phòng thí nghiệm
Phương pháp
- Khoai tây được rửa sạch sau đó cắt ra từng mảnh dày khoảng 7 – 8 mm
- Đặt mảnh khoai tây vào đĩa petri được giữ ẩm bằng mảnh giấy thấm vô trùng có thấm ướt bằng nước cất vô trùng
- Dùng dao mổ vô trùng tạo một rảnh sâu khoảng 3 – 4 mm và chủng vi khuẩn vào rảnh được tạo đó, quan sát kết quả sau 24 giờ
Trang 186 Khảo sát hiệu quả của một số loại
thuốc hoá học ở điều kiện in vitro
Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, có 3 lần lậplại, mỗi lần lập lại tối thiểu 3 đĩa, nồng độ thuốc theo khuyếncáo của nhà sản xuất
Trang 19Các loại thuốc dùng trong thí nghiệm
Không xử lý thuốcĐối chứng
3.6.10-6 cfu/mlBacillus
10gr/8LNorshield 86,2WP
8gr/8LKasuran 47WP
15gr/16LPoner 40T
30gr/8LAvalon 8WP
10ml/10LDitacin 8L
10gr/10LStarner 20WP
Nồng độ xử lýNghiệm thức
Trang 20Chỉ tiêu theo dõi:
➢Đo đường kính vùng vô khuẩn.
➢Phân cấp khả năng kháng thuốc theo thang đánh giá của Paige
và ctv (1988)
Trang 21Bảng phân cấp khả năng kháng thuốc theo thang đánh giá của Paige và ctv (1998)
> 16 mm4
11 -15 mm3
6 -10 mm2
1 -5 mm1
0 mm0
Đường kính vùng vô khuẩn (mm)Cấp
Trang 227 Nghiên cứu hiệu quả quản lý tổng hợp bệnh
bằng một số loại thuốc ở điều kiện ngoài đồng
- Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên, 09 nghiệmthức, 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 trụ thanh long
- Nồng độ xử lý thuốc theo khuyến cáo của nhà sản xuất, phun 4 lần mỗilần cách nhau 4 ngày khi bông trái 8 – 10 ngày tuổi
- Lấy chỉ tiêu trên mỗi trụ thanh long theo 4 hướng khác nhau, mỗi trụtheo dõi 10 bông trái
Trang 23Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: tỷ lệ bệnh và hiệu quả giảm bệnh.
Tỷ lệ bệnh tính theo công thức Viện Bảo Vệ Thực Vật, 1995
Tỷ lệ bệnh (%) = (số trái bệnh / tổng số trái quan sát) x 100
Trang 24Các loại thuốc dùng trong thí nghiệm
theo nông dânĐối chứng
3.6.10-6 cfu/mlBacillus
8gr/8 LKasuran 47WP
15gr/16 LCoc 85WP
15gr/16 LPoner 40T
10ml/10 LBiogreen
20-30gr/8 LAvalon 8WP
10ml/ 10 LDitacin 8L
10gr/10 LStarner 20WP
Nồng độ xử lýNghiệm thức
Trang 258 1 6 8 4 7 3
7 4 5 3 6 2 8 1 9
Chiều biến thiên
Trang 26Phần 3:Kết Quả
1 Phân lập tác nhân gây bệnh
Bảng 3.1: Kết quả phân lập mẫu bệnh ở Tiền Giang và Long An
70,76Nấm
68,46Vk5
10,76Vk4
9,23Vk3
130
15,38Vk2
12,30Vk1
Tỷ lệ (%)Tác nhân
Số lượng mẫu cấy (trái)
Trang 27Kết quả bảng 4.1 cho thấy có 6 tác nhân phân lập được trên mẫu
trái thanh long, trong đó có 5 dòng vi khuẩn và 1 loại nấm
Trong 130 mẫu trái thì nấm chiếm tỷ lệ cao nhất 70,76% và Vk5 68,46% so với các tác nhân còn lại (Vk1, Vk2, Vk3,
Vk4)
Trang 28Kết quả chủng Koch ngoài đồng
0 20
Vk4
20 20
Vk5
0 20
Vk3
0 20
Vk2
0 20
Vk1
Số lượng bông thối
Số lượng bông chủng Tác nhân
Ghi chú: Vk vi khuẩn
Bảng 3.2: Kết quả chủng Koch ngoài đồng
Trang 29Qua bảng 4.2 cho thấy dòng vi khuẩn Vk5 gây thối trên bông
thanh long với tỷ lệ 100% bông đều bị thối chứng tỏ vi khuẩn Vk5 là tác nhân gây thối nhũn đầu trái thanh long Các dòng vi khuẩn còn lại không thấy có hiện tượng thối xảy ra
Trang 302 Kết quả chủng Koch ngoài đồng
Triệu chứng chủng vi khuẩn 5Triệu chứng ngoài đồng
Trang 313 Kết quả phản ứng sinh hóaSau khi cho tế bào vi khuẩn nuôi
24 giờ tuổi lên lam sạch và
nhỏ một giọt H2O2 vào thì có
hiện tượng sủi bọt khí từ khối
vi khuẩn, cho thấy vi khuẩn có
enzym catalase phù hợp với
kết quả của Schaad (1998)
Trang 323 Kết quả phản ứng sinh hóaSau khi nhuộm với dung dịch
Iodine do tinh bột kết tủa với iot
có màu nâu, sự xuất hiện vùng
sáng không có kết tủa tinh bột
với iot chứng tỏ vi khuẩn có khả
năng thủy phân tinh bột
Sau khi nhuộm Lugol
Trang 33Phân giải citrate
Sau 4 ngày cấy trên môi trường
Cimmon’s Citrate Agar dùng
để kiểm tra khả năng sử dụng
citrate cho kết quả dương tính,
kết quả được quan sát thông
qua sự đổi màu môi trường từ
xanh lá sang xanh lục
Sau 4 ngày chủng
Trang 34Thí nghiệm gây thối nhũn khoai tây
Sau 24 giờ chủng vi khuẩn
và quan sát kết quả thấy
có hiện tượng thối đen
xung quanh vùng chủng
vi khuẩn cho thấy vi
khuẩn 5 có khả năng gây
thối nhũn khoai tây
Triệu chứng thối sau 24 giờ chủng
Trang 35Kết quả phản ứng sinh hóa
+ Gây thối nhũn khoai tây
4
+ Khả năng phân hủy citrate
3
+ Khả năng thủy phân tinh bột
2
+ Phản ứng Catalase
1
Ghi chú Đặc điểm
STT
Ghi chú: + phản ứng dương tính, - phản ứng âm
tính
Trang 36Kết quả phản ứng sinh hóaPhản ứng Catalase dương tính phù hợp với kết quả giám định vikhuẩn theo Schadd (1988), Goszcynska (2000).
Khả năng gây thối nhũn khoai tây ở kết quả thí nghiệm được trìnhbày cũng phù hợp với kết quả của Goszcynska (2000) nói vềkhả năng gây thối nhũn khoai tây trong giám định vi khuẩn
Erwinia sp ở điều kiện phòng thí nghiệm.
Tóm lại: qua kết quả giám định có thể kết luận dòng vi khuẩn Vk5
thuộc chi vi khuẩn Erwinia sp dựa vào một số đặc điểm trên.
Trang 37Nhuộm gram, quan sát hình dạng vi
khuẩn và nấm
Hình : Hình dạng vi khuẩn nhuộm gram Hình : Hình dạng khuẩn lạc của vi
khuẩn
Trang 38Hình Bào tử nấm Rhizopus sp. Hình Nấm Rhizopus nuôi cấy trên
PDA
Trang 394 Kết quả khảo sát hiệu quả một số loại thuốc hoá học ở điều kiện
in vitro
1,72 1,94
0,52 0,66
6,53 a 6,13 a
Đối chứng
7,33 b 7,07 a
6,50 a
5,57 b
Bacillus
5,00 c5,00 b
5,00 b5,00 c
Norshield 86.2WP
5,00 c5,00 b
5,00 b5,00 c
Kasuran 47WP
5,00 c5,00 b
5,00 b5,00 c
Poner 40T
5,00 c5,00 b
5,00 b5,00 c
Avalon 8WP
7,60 a 7,07 a
6,53 a 6,13 a
Ditacin 8L
5,00 c 5,00 b
5,00 b 5,00 c
Trang 40Mức độ kháng của vi khuẩn đối với từng nghiệm thức
22
11
Đối chứng
22
11
Bacillus
00
00
Norshield 86.2WP
00
00
Kasuran 47WP
00
00
Poner 40T
00
00
Avalon 8WP
22
11
Ditacin 8L
00
00
Starner 20WP
1NSC 1NSC
1NSC 1NSC
Phân cấp vòng vô khuẩnNghiệm thức
Trang 415 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của một số loại thuốc hoá học
đến tỷ lệ bông thối
11,81 14,38
Bacillus
15,56 b 9,25 bc
Coc 85WP
18,05 b 0,00 d
Kasuran 47WP
6,86 c 5,28 c
Poner 40T
0,00 d
0,61 d Biogreen
0,00 d
4,66 c Avalon 8WP
0,00 d
5,71 c Ditacin 8L
27,84 a
33,04 a
Starner 20WP
Sau phun lần 4 Sau phun lần 3
Tỷ lệ bông thối (%)
Nghiệm thức
Trang 42Phần 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1 KẾT LUẬN
Trong 6 tác nhân phân lập được trên trái thanh long có 1 dòng vi khuẩn là tác nhân chính và 1 nấm là tác nhân phụ gây bệnh thối nhũn đầu trái thanh long.
Qua giám định theo tài liệu của Clements (1973) thì nấm
phân lập được là nấm Rhizopus sp.
Trang 43KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Vi khuẩn quan sát dưới kính hiển vi khi nhuộm gram có dạng
hình roi, gram âm có tên là Erwinia sp.(Shchaad, 1988 và
Goszcynska, 2000)
Các loại thuốc Ditacin , Avalon và Biogreen có hiệu quả rất tốtlàm giảm tỷ lệ bông thối ở điều kiện ngoài đồng
Trang 45Cám ơn thầy cô và các bạn đã chú ý
theo dõi !