Hội chứng đa polyp tuyến gia đình (Familial adenomatous polyposis-FAP) là bệnh di truyền đặc trưng bởi sự hiện diện rất nhiều polyp tuyến ở đại tràng, thường trên 100 polyp. Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự xác định các SNP ở gen APC trên bệnh nhân FAP.
Trang 1XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTIDE (SNP) CỦA GEN APC
Ở BỆNH NHÂN MẮC BỆNH ĐA POLYP TUYẾN GIA ĐÌNH
Nguyễn Thị Băng Sương* , **, Nguyễn Hữu Huy**, Lê Minh Khôi * , **, Nguyễn Trung Tín* , **,
Nguyễn Hoàng Bắc* , **
TÓM TẮT
Mở đầu: Hội chứng đa polyp tuyến gia đình (Familial adenomatous polyposis-FAP) là bệnh di truyền đặc
trưng bởi sự hiện diện rất nhiều polyp tuyến ở đại tràng, thường trên 100 polyp Theo Sheng và cộng sự, 100% bệnh nhân FAP không được điều trị sẽ dẫn đến ung thư đại tràng ở tuổi 35-40 Nguyên nhân gây nên FAP được xác định là do đột biến gen APC Các đa hình ở gen APC nhạy cảm với ung thu Tuy nhiên mối liên hệ giữa các
đa hình gen APC và nguy cơ ung thư đại trực tràng vẫn chưa được biết rõ
Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự xác định các SNP ở gen APC trên bệnh nhân FAP
Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: 63 bệnh nhân có triệu chứng đa polyp tham gia nghiên cứu Chúng tôi sử dụng kỹ thuật giải trình tự để phát hiện SNP ở gen APC
Kết quả: Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tìm thấy 10 SNP ở gen APC Trong đó 7/10 SNP không làm
thay đổi acid amin nên các SNP này không làm thay đổi kiểu hình Tuy nhiên, có 3 SNP có ảnh hưởng làm thay đổi acid amin đó là SNP rs201764637 (p.Arg106His), SNP rs459552 (p.Val1822Asp) và SNP rs534228737
(p.Ile2231Phe) Trong số đó, SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe) có nguy cơ cao gây ung thư đại trực tràng
Kết luận: Chúng tôi phát hiện 3 SNP làm thay đổi acid amin đó là SNP rs201764637 (p.Arg106His), SNP
rs459552 (p.Val1822Asp) và SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe) Vai trò của các SNP này cần được làm rõ qua các nghiên cứu tiếp theo
Từ khoá: FAP, gen APC, SNP, giải trình tự
ABSTRACT
MOLECULAR DIAGNOSIS OF FAMILIAL ADENOMATOUS POLYPOSIS (FAP)
Nguyen Thi Bang Suong, Nguyen Huu Huy, Le Minh Khoi, Nguyen Trung Tin, Nguyen Hoang Bac
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 21 - No 3 - 2017: 115 - 119
Background: Familial adenomatous polyposis-FAP is an inherited disorder characterized by the presence lot
of adenomatous polyps in the colon, usually over 100 polyps According to Sheng et al, 100% of patients with untreated FAP will lead to colon cancer at the age of 35-40 FAP is caused by germline mutations in APC genes Adenomatous polyposis coli (APC) gene polymorphisms are believed to contribute to tumor susceptibility However, the association between single-nucleotide polymorphisms (SNP) in the APC gene and colorectal cancer (CRC) susceptibility remains unknown
Objective: Applying sequencing methods to detect SNPs of APC gene in FAP patients
Materials and Methods: 63 polyposis patients were recruited in the research We use the sequencing
method to detect SNPs in APC genes
Results: In this study, we found 10 SNPs in the APC gene 7 of 10 SNPs do not change the amino acid
* Đại học Y Dược TP.HCM, ** Bệnh viện Đại học Y Dược TPHCM
Tác giả liên lạc: TS.BS Nguyễn Thị Băng Sương ĐT:0914007038 Email: suongnguyenmd@gmail.com
Trang 2sequence of a protein so there is no significant change in phenotype However, there are 3 SNPs that change amino acid: SNP rs201764637 (p.Arg106His), SNP rs459552 (p.Val1822Asp) and SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe) Among them, SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe) is associated with a high risk of colorectal cancer
Conclusion: We detected three SNPs that change amino acid: SNP rs201764637 (p.Arg106His), SNP
rs459552 (p.Val1822Asp) and SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe) Their role should be clarified through further research
Key words: FAP, APC gene, SNP, sequencing
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh đa polyp tuyến gia đình (hereditary
familial adenomatous polyposis: FAP) là một
bệnh rối loạn di truyền trội( 6 ) Đa polyp tuyến gia
đình được đặc trưng bởi sự phát sinh hàng trăm
đến hàng ngàn polyp trong đại trực tràng, hầu
hết là ở tuổi vị thành niên( 6,7 ) Triệu chứng đầu
tiên của FAP là tiêu chảy và có máu trong
phân(6) Bệnh xảy ra với tần suất là 1/8300 trẻ sinh
ra và sống(2) và có nguy cơ cao dẫn đến ung thư
đại trực tràng, gần 100% bệnh nhân bị K hóa
trước 40 tuổi nếu không được điều trị sớm( 1 )
Bệnh có liên quan mật thiết đến những đột
biến dòng mầm của gen ức chế khối u APC
(tumor - supressor adenomatous polyposis
coligen: APC) nằm tại vị trí 5q21-q22( 4,6 ) Gen
APC là một gen ức chế khối u cổ điển dài 14000
nucleotid, có cấu trúc gồm 15 exon, gen mã hóa
ra phân tử mRNA dài 8972 bp, sản phẩm dịch
mã dài 2843 acid amin Các nghiên cứu trên thế
giới đã tìm thấy khoảng 300 đột biến khác nhau
trên gen APC gây bệnh FAP( 2 Trong những năm
gần đây, nhiều nghiên cứu đã xác định tầm quan
trọng của các đa hình đơn nucleotide (single
nucleotide polymorphisms – SNP) bên cạnh đột
biến ở các gen liên quan đến ung thư đại trực
tràng Một số SNP đóng vai trò trong sự phát
triển của ung thư đại trực tràng do tác động của
nó đến chức năng các gen điều hòa hoạt động
của tế bào
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu đột biến gen
APC ở bệnh nhân FAP vẫn còn rất hạn chế Năm
2012 tác giả Nguyễn Phương Anh đã phân tích
gen APC cho một số gia đình bệnh nhân FAP và
đã phát hiện các đột biến gây bệnh ở exon 15 của
gen APC tuy nhiên các SNP ở gen APC vẫn chưa
được báo cáo(3,2).Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài này với mục tiêu: “Xác định
đa hình đơn nucleotide (SNP) gen APC ở bệnh nhân mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình”
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu
Đây là bệnh hiếm gặp, tỷ lệ mắc bệnh khoảng 1/10.000-1/6000, trong thời gian 2 năm nghiên cứu, chúng tôi thực hiện nghiên cứu trên
63 bệnh nhân mắc bệnh đa polyp gia đình
Phương pháp nghiên cứu
Kỹ thuật tách chiết DNA từ máu ngoại vi
Máu ngoại vi khi thu nhận được giữ trong
ống chống đông bằng EDTA nắp xanh dương và được ly trích trong vòng 24 giờ Sử dụng bộ kit QiAamp DNA blood mini kit của hãng Qiagen – Đức để ly trích DNA
Sản phẩm ly trích được tiến hành kiểm tra
độ nguyên vẹn của mạch bằng phương pháp điện di trên gel agarose 3%, đo nồng độ và độ tinh sạch bằng máy NanoDrop 2000 Chỉ những mẫu tách chiết đạt độ tinh sạch với tỷ số A260/A280 trong khoảng 1,8-2,0 mới tiếp tục được sử dụng cho các thí nghiệm sau
Kỹ thuật khuếch đại các exon của gen APC
Dùng phương pháp PCR khuếch đại 15 đoạn
exon của gen APC bằng máy Gene Amp PCR
System 9700 (USA)
Thành phần của phản ứng PCR gồm 20 μl chứa các thành phần: DNA khuôn; 0,2 mmol/L dNTP; 1,5 mmol/L Mg++; 0,1-0,2 μmol/L primer
và 1-1,5 đơn vị Taq polymerase
Trang 3Chu trình nhiệt của phản ứng như sau: Đầu
tiên là giai đoạn biến tính ở 94°C trong 5 phút,
tiếp theo là 35-40 chu kỳ gồm biến tính ở 94°C
trong 30 giây; gắn mồi ở 60°C trong 30 giây và
bước kéo dài 72°C trong 30 giây, cuối cùng là giai
đoạn hoàn chỉnh ở 72°C trong 5 phút và bảo
quản tạm thời sản phẩm PCR ở 4°C
Kết quả PCR sau đó được kiểm chứng bằng
phương pháp điện di trên gel agarose 1,5%
Kỹ thuật giải trình tự gen
Thực hiện phản ứng cycle sequencing với
BigDye version 3.1 của công ty Applied
Biosystems, theo 2 chiều xuôi và ngược, giải
trình tự DNA bằng máy sequencer ABI 3500
Phân tích kết quả giải trình tự
Kết quả giải trình tự được phân tích bằng
phần mềm CLC Main Workbench 5 và so sánh
với trình tự gen APC chuẩn có mã trình tự tham
chiếu trên NCBI là NG_008481.4
Xử lý thống kê
Số liệu thống kê được phân tích và xử lý bằng phần mềm SPSS 19.0
KẾT QUẢ - BÀN LUẬN
Đặc điểm nhóm nghiên cứu Bảng 1 Phân bố theo giới và tuổi của bệnh nhân
giới
Từ 30 - 60 25 39,7 19 30,1 44 69,8
Nhận xét: Trong nhóm nghiên cứu thì
nhóm các bệnh nhân từ 30 đến 60 tuổi chiếm
đa số (69,8%), độ tuổi trung bình của bệnh nhân trong nhóm nghiên cứu là 43,9 Tỷ lệ bệnh nhân nam tham gia nghiên cứu là 63,5%
và nữ chiếm 36,5%
Kết quả thống kê các SNP trên gen APC
Bảng 2 Thống kê các SNP trên gen APC
biến
Nucleotide bị thay đổi
Nhận xét: Chúng tôi đã tìm thấy 10 SNP ở
gen APC, trong đó 7/10 SNP không làm thay đổi
acid amin, các SNP này không có ý nghĩa về mặt
lâm sàng vì không ảnh hưởng đến cấu trúc
protein Tuy nhiên, có 3 SNP có ảnh hưởng làm
thay đổi acid amin đó là SNP rs201764637
(p.Arg106His), SNP rs459552 (p.Val1822Asp) và
SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe)
Kiểm tra trên cơ sở dữ liệu 1000genomes (http://browser.1000genomes.org/), khi giải trình tự 99 người dân tộc Kinh ở Việt Nam thì không phát hiện hai SNP rs201764637 (p.Arg106His) và SNP rs534228737
(p.Val1822Asp) thì có 13 người dị hợp và 2 người đồng hợp Điều này cho thấy SNP rs459552 (p.Val1822Asp) phổ biến trong quần
Trang 4thể người Việt Nam nên không phải là SNP
gây bệnh Tuy nhiên theo nghiên cứu
Guerreiro vào năm 2017 cho thấy SNP
rs459552 (p.Val1822Asp) có liên quan đến
khẩu phần ăn và nguy cơ ung thư trực tràng
cụ thể những người có mang allen đột biến sẽ
có nguy cơ mắc ung thư đại trực tràng cao hơn
nếu ăn khẩu phần ăn nhiều cholesterol, ít chất
xơ và canxi so với người có kiểu gen bình
thường có khẩu phần ăn tương tự( 3 ) Điều này
cho thấy các SNP có tương tác nhất định đối
với nguy cơ ung thư đại trực tràng
Khi tiếp tục hồi cứu kết quả giải trình tự 2503
người trên toàn thế giới thì thống kê của
1000genomes cho thấy chỉ có 2 trường hợp dị
hợp tử tương ứng với SNP rs201764637
(p.Arg106His) và 2 trường hợp dị hợp tử đối với
SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe) Điều này chứng
tỏ 2 SNP này có tỉ lệ rất thấp
Theo cơ sở dữ liệu ClinVar thì SNP
rs201764637 (p.Arg106His) đã được Johnston
báo cáo từ năm 2012( 3 ) và không có ý nghĩa rõ
ràng về mặt lâm sàng Theo tiêu chuẩn phân
loại Counsyl (2015) thì SNP rs201764637 được xếp loại biến thể chưa có ý nghĩa rõ ràng (variant of uncertain significance - VUS) do chỉ mới có 2 báo cáo về SNP này trên thế giới nên chưa đủ dữ liệu để đánh giá ảnh hưởng của SNP lên kiểu hình bệnh
Theo cơ sở dữ liệu ClinVar thì SNP rs534228737 cũng được xếp loại biến thể chưa có
ý nghĩa rõ ràng Tuy nhiên biến thể này cũng không được tìm thấy khi giải trình tự 6500 người
Mỹ gốc châu Âu và châu Phi trong dự án NHLBI Exome Sequencing Project cho thấy SNP này không phải là một biến thể lành tính thông thường trong những quần thể này Dựa trên thông tin hiện có, chưa thể kết luận SNP rs534228737 là một đột biến gây bệnh hoặc một biến thể lành tính Tuy nhiên đây là SNP thay đổi acid amin p.Ile2231Phe nằm trong vùng cơ bản của protein APC, là vùng có chức năng ổn định và kích thích sự trùng hợp vi ống tham gia trong quá trình phân chia tế bào Cấu trúc của vùng này có tính bảo tồn rất cao
Hình 1 Phân tích Polyphen-2 SNP rs534228737
Phân tích SNP c.6691A>T bằng phần mềm
Polyphen-2 chúng tôi thu được số điểm nguy
cơ của SNP là 0.997, đây là một số điểm rất
cao, chứng tỏ SNP này có thể gây bệnh ở bệnh
nhân Do vậy chúng ta cần theo dõi diễn tiến
lâm sàng ở bệnh nhân cũng như theo dõi báo
cáo cập nhật của các tác giả khác nhau trên thế
giới về SNP này
KẾT LUẬN
Bằng phương pháp giải trình tự, chúng tôi
đã tìm thấy 10 SNP ở gen APC, trong đó 7/10 SNP không làm thay đổi acid amin, các SNP này không có ý nghĩa về mặt lâm sàng vì không ảnh hưởng đến cấu trúc protein Tuy nhiên, có 3 SNP
có ảnh hưởng làm thay đổi acid amin đó là SNP
Trang 5rs201764637 (p.Arg106His), SNP rs459552
(p.Val1822Asp) và SNP rs534228737
(p.Ile2231Phe) Vai trò của các SNP này cần được
làm rõ qua các nghiên cứu tiếp theo
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Guerreiro CS et al (2007), "The D1822V APC polymorphism
interacts with fat, calcium, and fiber intakes in modulating the
risk of colorectal cancer in Portuguese persons", The American
journal of clinical nutrition, 85(6), pp 1592-1597 5
2 Half E, Bercovich D, and Rozen P (2009), "Familial
adenomatous polyposis", Orphanet J Rare Dis, 4(22Jian-Qiu
Sheng, et al (2010), "APC gene mutations in Chinese familial
adenomatous polyposis patients", World J Gastroenterol, 16(12),
pp 1522–1526 2
3 Johnston JJ et al (2012), "Secondary variants in individuals
undergoing exome sequencing: screening of 572 individuals
identifies high-penetrance mutations in cancer-susceptibility
genes", The American Journal of Human Genetics, 91(1), pp
97-108 4
4 Leppert M, et al (1987), "The gene for familial polyposis coli
maps to the long arm of chromosome 5", Science, 238(4832),
pp 1411-3 7
5 Nguyễn Phương Anh, Nguyễn Nghiêm Luật, and Trần Văn Khánh (2010), Nghiên cứu đột biến gene APC ở bệnh ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình, Luận án tiến sỹ y học, Trường đại học Y Hà Nội, Hà Nội 3
6 Plawski A and Slomski R (2009), "APC gene mutations
causing familial adenomatous polyposis in Polish patients", J
Appl Genet, 49(4), pp 407–414 1
7 Poovorawan K, et al (2012), "Colon Cancer Prevention by Detection of APC Gene Mutation in a Family with Attenuated
Familial Adenomatous Polyposis", Asian Pacific J Cancer Prev,
13(10), pp 5101-5104 6
Ngày nhận bài báo: 29/11/2016 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 28/11/2016 Ngày bài báo được đăng: 15/05/2017