Bài viết trình bày quy trình SCD với thao tác đơn giản, thời gian thực hiện ngắn, có tiềm năng ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị vô sinh nam cũng như mở ra các hướng nghiên cứu về phân mảnh DNA tinh trùng tại Việt Nam.
Trang 1XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHẢO SÁT SỰ PHÂN TÁN NHIỄM SẮC CHẤT
CỦA TINH TRÙNG (SPERM CHROMATIN DISPERSION - SCD)
DÙNG TRONG ĐÁNH GIÁ PHÂN MẢNH DNA TINH TRÙNG NGƯỜI
Nguyễn Trương Thái Hà*, Nguyễn Thị Thúy An*, Mã Phạm Quế Mai*, Phạm Nguyễn Thảo Trang*,
Hồ Mạnh Tường*
TÓM TẮT
Mục tiêu: Xây dựng quy trình đánh giá phân mảnh DNA tinh trùng
Đối tượng: 70 mẫu tinh dịch của tình nguyện viên nam tuổi từ 18 - 40
Phương pháp nghiên cứu: Các bước xây dựng quy trình gồm khảo sát: mật độ tinh trùng làm tiêu bản,
thành phần dung dịch ly giải, thời gian ly giải và điều kiện biến tính trước ly giải Mẫu tinh dịch xử lý H 2 O 2 2% làm chứng dương Hiệu quả của quy trình sẽ được đối chứng với kết quả từ bộ thuốc thử Halosperm ® G2
Kết quả: Quy trình khảo sát sự phân tán nhiễm sắc chất tinh trùng (Sperm Chromatin Dispersion – SCD)
thực hiện với mật độ tinh trùng dùng làm tiêu bản là 10 6 tinh trùng/ml, sử dụng dung dịch biến tính là HCl 0.08N, một dung dịch ly giải gồm Tris 0.4M, DTT 0.4mM, NaCl 1.5M, SDS 1%, EDTA 50mM, pH 7.5, thuốc nhuộm là DAPI 2µg/ml Hiệu quả của quy trình cho kết quả tương quan dương mạnh (r = 0.97, p < 0.01) khi chạy thống kê SPSS ver.16 với bộ thuốc thử thương mại Halosperm ®
Kết luận: Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình SCD với thao tác đơn giản, thời gian thực hiện
ngắn, có tiềm năng ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị vô sinh nam cũng như mở ra các hướng nghiên cứu về phân mảnh DNA tinh trùng tại Việt Nam
Từ khóa: Halosperm, hỗ trợ sinh sản, SCD, phân mảnh DNA tinh trùng, vô sinh nam
SUMMARY
ESTABLISHING THE PROCEDURE SPERM CHROMATIN DISPERSION (SCD)
FOR DETERMINATION OF HUMAN SPERM DNA FRAGMENTATION
Nguyen Truong Thai Ha, Nguyen Thi Thuy An, Ma Pham Que Mai, Pham Nguyen Thao Trang,
Ho Manh Tuong * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 20 - No 5 - 2016: 82 - 87
Objective: Establish the procedure for determination of human sperm DNA fragmentation
Subjects: 70 semens from male volunteers in ages 18 - 40
Methods: The experiments were surveyed such as the optimal semen dilution for templates, semen dilution,
the concentration of the components in the lysis solution and conditions for human sperm DNA treatment The
H 2 O 2 2% treated semen was used as positive control In addition, DFI was evaluated by both of the established procedure and the halo sperm G2 kit in order to assess correlation between two methods
Result: It is shown that the optimal sperm concentration is 10 6 sperm/ml Samples should be treated in the denaturing solution HCl 0.08N before using lysis solution (Tris 0.4 M, DTT 0.4mM, NaCl 1.5 M, SDS 1 %, EDTA 50 mM, pH 7.5) Sperm DNA was stained by fluorescence dye DAPI 2 µg/ml And DFI can be analyzed
on fluorescence microscopy at 40X The strong positive correlation was observed to both of the improved SCD test and Halosperm kit (r=0.97, P<0.01)
Conclusion: It is believed that the improved SCD test could be applied in male infertility diagnosis as well as
in research on human sperm DNA fragmentation in Viet Nam due to its advantages as simple, suitable cost and
* Trung tâm Nghiên cứu Di truyền và Sức khỏe Sinh sản (CGRH), Khoa Y, Đại học Quốc Gia TP.HCM
Trang 2short duration
Key word: ART, Halosperm, male infertility, SCD, sperm DNA fragmentation
ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo nghiên cứu của Schoor và cộng
sự(15), tỷ lệ vô sinh ở các cặp đôi trong độ tuổi
sinh sản là 15 – 20% và ngày càng gia tăng
Do đó, việc phát triển các phương pháp chẩn
đoán vô sinh trong hỗ trợ sinh sản là một
nhiệm vụ rất cần thiết Cho đến nay, phương
pháp chẩn đoán vô sinh nam chủ yếu dựa
trên kết quả tinh dịch đồ theo tiêu chuẩn của
Tổ chức Y tế Thế Giới – WHO 2010 Tuy
nhiên vẫn tồn tại nhiều trường hợp bệnh
nhân bị vô sinh với các chỉ số tinh dịch đồ
nằm trong giới hạn bình thường(17) Các
nghiên cứu gần đây cho thấy phân mảnh
DNA tinh trùng là một trong những nguyên
nhân gây vô sinh(1,15) Nhiều phương pháp
đánh giá sự phân mảnh DNA tinh trùng
người đã ra đời, góp phần không nhỏ vào
việc chẩn đoán và điều trị vô sinh như
phương pháp khảo sát cấu trúc chromatin
tinh trùng – SCSA (Sperm chromatin
structural assay)(4,5) , điện di tế bào đơn –
COMET(3,14), sử dụng chất nhuộm
chromomycin-A3 – CMA3(13), dịch mã đứt
gãy tại chỗ (in situ nick translation assay)(2)…
Trong các phương pháp này, phương pháp
khảo sát sự phân tán nhiễm sắc chất của tinh
trùng - SCD (sperm chromatin dispersion) là
phương pháp có nhiều ưu điểm như đơn
giản, hiệu quả cao và thời gian thực hiện
ngắn(11) Bên cạnh đó, SCD còn có thể kết hợp
với nhiều phương pháp khác như lai huỳnh
quang tại chỗ - FISH (Fluorescent insitu
hybridization) hoặc bổ sung các kháng thể
đặc hiệu để chẩn đoán các bất thường di
truyền ở tinh trùng(7,6,8) Phương pháp SCD
cũng đã được cải tiến thành bộ thuốc thử
thương mại Halosperm®G2(6) với các thành
phần hóa chất pha sẵn, thao tác tiến hành
đơn giản, tuy nhiên giá thành ở Việt Nam lại
khá cao (1.5 triệu đồng/1 xét nghiệm), không
phù hợp để trở thành một chẩn đoán thường quy cho các bệnh nhân vô sinh nam Vì vậy, chúng tôi chọn quy trình SCD với mục tiêu xây dựng và cải tiến quy trình chẩn đoán phân mảnh DNA tinh trùng người phù hợp với điều kiện Việt Nam để trở thành một công cụ xét nghiệm góp phần chẩn đoán và điều trị vô sinh trong hỗ trợ sinh sản
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu
70 mẫu tinh dịch từ các tình nguyện viên tham gia nghiên cứu, thu nhận bằng phương pháp thủ dâm tại phòng thí nghiệm của Trung tâm nghiên cứu Di truyền và Sức khỏe Sinh sản (CGRH), Khoa Y, Đại học Quốc Gia thành phố
Hồ Chí Minh Tiêu chuẩn mẫu: có mật độ tối thiểu 107 tinh trùng/ml theo tiêu chuẩn đánh giá mật độ của Tổ chức Y Tế Thế Giới (WHO 2010); thu nhận từ các tình nguyện viên nam trong độ tuổi sinh sản từ 18 – 40 tuổi, không có triệu chứng vô tinh, không mắc các bệnh truyền nhiễm, bệnh hiểm nghèo, bệnh nam khoa, kiêng xuất tinh từ 2-7 ngày
Hình 1: Phân loại phân mảnh tinh trùng, hình ảnh
của Halosperm (a) và SCD (b)
Phương pháp nghiên cứu
Dựa trên quy trình tham khảo của
Trang 3Fernández và cộng sự(7,6), chúng tôi xây dựng
và cải tiến quy trình SCD theo điều kiện ở Việt
Nam, với các thí nghiệm: độ pha loãng tinh
dịch, nồng độ các thành phần trong dung dịch
ly giải, thời gian ly giải và điều kiện biến tính
trước ly giải, mỗi nghiệm thức tiến hành lặp lại
đồng thời trên 3 mẫu tinh dịch đại diện cho 3
nhóm phân mảnh tinh trùng: (1) Không phân
mảnh: DFI <15%, (2) Phân mảnh mức độ nhẹ:
DFI 15 – 30%, (3) Phân mảnh nặng: >30%(11)
được đánh giá bằng bộ thuốc thử thương mại
Halosperm® G2 (Halotech DNA, Madrid,
Spain), bộ thuốc thử được phát triển dựa theo
nguyên tắc và quy trình thực hiện của phương
pháp SCD của Férnandez và cộng sự năm
2005(6) Cách đánh giá DFI: Phân tích kết quả
của tối thiểu 200 tế bào trên kính hiển vi huỳnh
quang Olympus BX-53, Nhật, độ phóng đại
40X, kết quả hình ảnh được phân tích bằng
chương trình phân tích hình ảnh Image J, đo độ
rộng vòng sáng quanh đầu tinh trùng (r) và
đường kính nhỏ nhất của đầu tinh trùng (d)
Phân loại như sau: r ≥ d: halo lớn (hình 1-1a, b),
1/3d ≤ r < d: halo trung bình (hình 1-2a, b), r <
1/3d: halo nhỏ (hình 1-3a, b), r = 0: không có
halo (hình 1-4a, b), thoái hóa (degradation):
không có halo và bắt màu yếu (hình 1-5a, b)
Trong đó, trường hợp 1, 2 là những tinh trùng
không bị phân mảnh DNA và trường hợp 3, 4,
5 là những tinh trùng bị phân mảnh DNA Chỉ
số phân mảnh DNA tinh trùng (DNA
Fragmentation Index – DFI) được xác định dựa
vào công thức sau: DFI = (Số tinh trùng bị phân
mảnh DNA/ tổng số tinh trùng đếm được) x
100% Ngoài điều kiện khảo sát, các bước tiến
hành thực hiện theo quy trình tham khảo Mẫu
tinh dịch tươi được xử lý H2O2 2%, ủ trong tối
trong 10 phút dùng làm chứng dương để đánh
giá khả năng ly giải (H2O2 là tác nhân oxy hóa
làm cho DNA tinh trùng bị phân mảnh, sau xử
lý DFI ≈100%, toàn bộ tinh trùng không có halo
hay chỉ có halo nhỏ) Mẫu bị âm tính giả khi
DFI của chứng dương nhỏ hơn 90%, mẫu bị
dương tính giả khi có DFI cao hơn DFI của
Halosperm ở cả 3 nhóm
Xác định nồng độ pha loãng tinh dịch
Pha loãng tinh dịch trong dung dịch PBS về mật độ 105 tinh trùng/ml, 106 tinh trùng/ml và
107 tinh trùng/ml Mẫu sau pha loãng được trộn trong agarose có điểm đông thấp (low melting agarose) 1% theo tỷ lệ 25 µl mẫu với 50 µl gel rồi trải toàn bộ lên lam kính Đậy phiến kính 24
x 60 mm Ghi nhận số lượng tinh trùng trung bình thu được trên 1 vi trường trên vật kính 40X của kính hiển vi huỳnh quang Olympus
BX – 53 tại mỗi nồng độ pha loãng tương ứng
Xác định nồng độ các chất trong dung dịch ly giải
Theo quy trình của Fernández(7,6) và một số quy trình khác(11,12) nồng độ các chất trong dung dịch ly giải có sự thay đổi là DTT trong dung dịch ly giải 1 và NaCl trong dung dịch ly giải 2, nồng độ Tris 0.4M, SDS 1%, EDTA 50mM không có sự thay đổi nên chúng tôi khảo sát để tìm ra nồng độ DTT và NaCl tối ưu
Nồng độ DTT trong dung dịch ly giải 1
Theo một số quy trình SCD cải tiến của các nghiên cứu khác(10,12) và cả Fernández cũng cho rằng nồng độ DTT trong dung dịch ly giải từ 0,1 mM đến 2 M(9) Mặt khác, chi phí DTT khi mua ở Việt Nam quá cao, đây là thành phần khiến cho giá thành của xét nghiệm SCD cao,
do đó nồng độ DTT được khảo sát ở mức thấp nhất là 0.2 mM, 0.4 mM, 0.6 mM, 0.8 mM
Nồng độ NaCl trong dung dịch ly giải 2
Tham khảo nồng độ NaCl một số quy trình khác(9,10), thực hiện khảo sát khoảng nồng độ từ
1 M đến 2 M, với nồng độ thực hiện 1 M, 1.5 M,
2 M
Cải tiến dung dịch ly giải
Nhận thấy 2 dung dịch ly giải trong quy trình tham khảo: dung dịch 1 (L1) Tris 0.4 M, DTT 0.8 M, SDS 1%, EDTA 50 mM, pH 7.5, dung dịch 2 (L2) Tris 0.4 M, NaCl 2 M, SDS 1%
pH 7.5 có các thành phần Tris 0.4 M, SDS 1% tương tự và tác dụng tương tự, đồng thời tham
Trang 4khảo quy trình SCD cải tiến khác chỉ có một
dung dịch ly giải(9,10,12) nên chúng tôi tiến hành
cải tiến dung dịch ly giải và thực hiện các loạt
thí nghiệm so sánh hiệu quả ly giải: (1) Xử lý
tinh trùng trong cả 2 dung dịch ly giải 1 và 2
theo như quy trình tham khảo, ký hiệu L1L2;
(2) tinh trùng chỉ được xử lý trong dung dịch ly
giải 1, ký hiệu là L1; (3) tinh trùng chỉ được xử
lý trong dung dịch ly giải 2, ký hiệu là L2; (4)
tinh trùng xử lý trong dung dịch ly giải 2 có bổ
sung DTT 0.4 mM và EDTA 50 mM trong 30
phút, ký hiệu L2DTT
Khảo sát thời gian ngâm ly giải
Đánh giá hiệu quả ly giải khi ngâm dung
dịch ly giải trong 10 phút, 20 phút, 30 phút
Khảo sát điều kiện biến tính trước ly giải
Đánh giá sự cần thiết ngâm dung dịch biến
tính trước ly giải Tiến hành so sánh hiệu quả ly
giải khi không thực hiện và thực hiện ngâm
dung dịch biến tính HCl 0.08 N trước khi ngâm
dung dịch ly giải
Kiểm tra hiệu quả quy trình cải tiến
Thực hiện đánh giá tương quan theo ý nghĩa thống kê tỷ lệ phân mảnh DNA tinh trùng – DFI xác định bằng quy trình SCD cải tiến và bộ thuốc thử thương mại Halosperm®
G2 trên cỡ mẫu là 50 mẫu tinh dịch ở cả 3 nhóm mức độ phân mảnh bằng phần mềm thống kê SPSS ver16
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Xác định nồng độ pha loãng tinh dịch
Chọn mật độ 106 tinh trùng/ml, vì trung bình có 12 - 20 tinh trùng/vi trường phù hợp để quan sát và phân tích kết quả tối thiểu 400 tinh trùng/mẫu ở vật kính 40X trên kính hiển vi huỳnh quang (mật độ 105 tinh trùng/ml chỉ có 2 – 5 tinh trùng/vi trường gây khó khăn khi đếm tối thiểu 400 tinh trùng), không có hiện tượng tinh trùng chồng lên nhau (mật độ 107 tinh trùng/ml có trên 50 tinh trùng/vi trường, tinh trùng có hiện tượng chồng lên nhau dễ gây sai lệch đánh giá kết quả) (Hình 2)
Hình 2: Hình chụp vi trường từ camera trên kính hiển vi huỳnh quang độ phóng đại 40X của mẫu nhuộm DAPI
có nồng độ tinh dịch lần lượt là 10 7 tinh trùng/ml , 10 6 tinh trùng/ml , 10 5 tinh trùng/ml
Xác định nồng độ các chất trong dung dịch
ly giải
Khảo sát nồng độ DTT tối ưu 0.2 mM, 0.4
mM, 0.6 mM, 0.8 Mm
Xét chứng dương: ở nồng độ 0.2 mM, 0.4
mM và 0.6 mM các mẫu đều cho kết quả DFI
100%, nồng độ 0.8mM các mẫu bị âm tính giả
vì chỉ cho kết quả DFI < 50% Xét kết quả DFI
của các mẫu: ở nồng độ 0.2 mM kết quả từ quy
trình SCD của mẫu bị dương tính giả, tỷ lệ DFI
>50% ở cả 3 nhóm DFI Ở nồng độ 0.4 mM và 0.6 mM kết quả DFI của mẫu tương đương với Halosperm ở 3 nhóm DFI Chọn nồng độ DTT
0.4 mM để tiết kiệm hóa chất
Khảo sát nồng độ NaCl tối ưu 1M, 1.5M, 2M
Xét chứng dương: ở cả ba nồng độ tất cả các mẫu đều cho kết quả DFI 100% Xét kết quả DFI của các mẫu: ở nồng độ NaCl 1 M kết quả
Trang 5từ quy trình SCD của mẫu bị dương tính giả, tỷ
lệ DFI >50% ở cả 3 nhóm DFI, nồng độ 1.5 M và
2 M các mẫu đều cho kết quả tương đương
giữa quy trình SCD và Haosperm Để tiết kiệm
hóa chất chọn nồng độ NaCl tối ưu là 1.5 M
Cải tiến dung dịch ly giải
Xét chứng dương: cả 4 nghiệm thức đều
cho kết quả DFI 100% Xét kết quả DFI của các
mẫu: ở mẫu chỉ sử dụng L1 hoặc L2 nhận thấy
mẫu không ly giải, 100% tinh trùng không có
halo, hình thái đầu không nở to Mẫu ly giải
L1L2 và L2DTT trong 30 phút cho kết quả DFI
tương đương Halosperm Vậy dung dịch
L2DTT có tác dụng tương tự với việc sử dụng 2
dung dịch ly giải, xét về mặt hóa chất và thao
tác thì tiện lợi hơn nên sử dụng dung dịch ly
giải kết hợp cho các bước thí nghiệm tiếp theo
Kiểm tra thời gian ly giải mẫu trong dung
dịch L2DTT
Xét chứng dương: cả 3 thời gian, tất cả các
mẫu đều cho kết quả DFI 100% Xét kết quả
DFI của các mẫu: mẫu thực hiện ly giải với
dung dịch L2DTT 30 phút và 20 phút cho kết
quả DFI tương đương với bộ thuốc thử
Halosperm®, để tiết kiệm thời gian thực hiện
chọn thời gian ngâm ly giải là 20 phút
Khảo sát điều kiện biến tính trước ly giải
Xét chứng dương: mẫu không xử lý biến
tính ngâm trong HCl 0.08 N trong 7 phút và có
xử lý biến tính đều cho kết quả DFI 100% Xét
kết quả DFI của các mẫu: mẫu không xử lý biến
tính bị dương tính giả cho DFI là 100%, mẫu xử
lý biến tính cho kết quả DFI tương đương với
bộ thuốc thử Halosperm® Cần xử lý biến tính
tinh trùng trước ly giải để biến tính DNA tinh
trùng, bộc lộ các đứt gãy
Quy trình SCD cải tiến
Phủ một lớp gel LMA 1% mỏng lên bề mặt
lam kính, để khô ở nhiệt độ phòng Pha loãng
mẫu tinh dịch trong phosphate buffered saline
- PBS đến mật độ 106 tinh trùng/ml Cho 25 µl
tinh dịch pha loãng vào 50µl gel LMA 1% ở
37oC trộn đều và nhỏ toàn bộ lên lam kính, đậy phiến kính 24 x 60 mm lên trên để gel dàn đều Đặt lam mẫu vào tủ 4oC trong 5 phút Tháo bỏ phiến kính Ngâm lam mẫu vào dung dịch HCl 0,08N, trong 7 phút ở nhiệt độ phòng Chuyển lam mẫu ngâm vào dung dịch ly giải cải tiến, thành phần: Tris 0.4 M, DTT 0.4 mM, NaCl 1.5
M, SDS 1%, EDTA 50 mM, pH 7.5, trong 20 phút ở 22oC Rửa lam mẫu trong TBE 1X trong
5 phút Lần lượt rửa lam mẫu trong EtOH 70%, 90% và 100% trong 2 phút/lần rửa Để lam kính mẫu khô hoàn toàn ở nhiệt độ phòng, trải đều
100 µl thuốc nhuộm DAPI 2 µg/ml lên lam mẫu, ủ tối trong 20 phút Lắc rửa lam kính mẫu trong TBE 1X, để khô tự nhiên khoảng 20 phút trong tối Phân tích tối thiểu 200 tế bào trên lam mẫu trên kính hiển vi huỳnh quang vật kính 40X, tính DFI theo công thức
Kiểm tra hiệu quả của quy trình SCD mới xây dựng
Đánh giá tương quan kết quả DFI giữa quy trình SCD và bộ thuốc thử Halosperm® cho kết quả tương quan dương mạnh có ý nghĩa thống
kê với r = 0.97, p < 0.001 (Biểu đồ 1)
Biểu đồ 1 Mối tương quan chỉ số DFI giữa quy trình SCD cải tiến và bộ thuốc thử Halosperm
KẾT LUẬN
Nhóm nghiên cứu phân mảnh tinh trùng thuộc trung tâm Nghiên cứu Di truyền và Sức khỏe Sinh sản (CGRH) đã thành công trong việc xây dựng quy trình SCD chẩn đoán phân mảnh DNA tinh trùng người Với các ưu điểm
Trang 6như thao tác đơn giản, thời gian thực hiện
ngắn, chi phí hóa chất thấp (chỉ khoảng 1/5 so
với giá thành nhập khẩu bộ thuốc thử
Halosperm), lại cho hiệu quả tương đương,
quy trình SCD có tiềm năng trở thành một xét
nghiệm thường quy giúp đánh giá phân mảnh
DNA tinh trùng, cùng với tinh dịch đồ góp
phần chẩn đoán và điều trị hiệu quả hơn cho
các bệnh nhân vô sinh nam Bên cạnh đó, hiện
tại ở Việt Nam, các nghiên cứu về phân mảnh
DNA tinh trùng vẫn chưa có nhiều công bố Do
đó, với quy trình SCD cải tiến chúng tôi có thể
mở ra thêm nhiều hướng nghiên cứu về phân
mảnh DNA tinh trùng ứng dụng vào các kỹ
thuật hỗ trợ sinh sản trong nước như IUI, ICSI
hay trữ lạnh, cũng như tìm ra mối tương quan
giữa phân mảnh với tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ phôi
tốt, tỷ lệ sinh sống … góp phần nâng cao tỷ lệ
thành công của các chu trình hỗ trợ sinh sản
cho bệnh nhân vô sinh hiếm muộn
Lời cảm ơn: Chân thành cám ơn ThS BS Hồ Mạnh Tường đã
tạo điều kiện cũng như tìm nguồn tài trợ kinh phí cho việc thực
hiện nghiên cứu Cảm ơn các anh chị em trong Trung tâm
Nghiên cứu Di truyền và Sức khỏe Sinh sản đã hỗ trợ về thời
gian, thiết bị để nghiên cứu được hoàn thành Cám ơn các anh
chị kỹ thuật viên hỗ trợ sinh sản ở các bệnh viện Vạn Hạnh, Mỹ
Đức, An Sinh đã đóng góp các ý kiến chuyên môn trong lĩnh
vực hỗ trợ sinh sản Cảm ơn các bạn tình nguyện viên đã sẵn
sàng tham gia cung cấp nguồn mẫu cho nghiên cứu Và cuối
cùng cảm ơn chị Mai, chị An, bé Trang đã bỏ nhiều thời gian,
công sức cùng tôi thực hiện nghiên cứu này
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Agarwal A, Saleh RA (2002) Role of oxidants in male
infertility: rationale, significance, and treatment Urol Clin
North Am, 29: 817-27
2 Agarwal A, Tsarev I, Erenpresis J, Sharma R (2012) Sperm
chromatin assessment Textbook of Assisted Reproductive
75-95
3 Enciso M, Sarasa J, Agarwal A, Fernandez JL, Gosalvez J
(2009) A two-tailed Comet assay for assessing DNA damage
in spermatozoa Reprod Biomed Online, 18: 609-16
A (2006) Sperm chromatin structure and male fertility:
biological and clinical aspects Asian J Androl, 8: 11-29
structure assay is useful for fertility assessment Methods in
Cell Science, 22: 169 – 189
6 Fernández JL, Muriel L, Goyanes V, Segrelles E, Gosálvez J,
Enciso M, LaFromboise M, De Jonge C (2005) Simple
determination of human sperm DNA fragmentation with an
improved sperm chromatin dispersion test Fertil Steril, 84:
833-842
Alvarez JG (2003) The sperm chromatin dispersion test: a simple method for the determination of sperm DNA
fragmentation J Androl, 24: 59–66
8 García-Peiró A, Martínez-Heredia J, Oliver-Bonet M, Abad
C, Amengual MJ, Navarro J, Jones C, Coward K, Gosálvez J, Benet J (2011) Protamine 1 to protamine 2 ratio correlates with dynamic aspects of DNA fragmentation in human
sperm Fertil Steril, 95: 105–109
determination of DNA fragmentation in animal sperm cell
European patent application, EP1710320A1: 1–30
10 Gutiérrez R, Bécquer P, Pandolfi A, Cuevillas G, Pupo J, Hernández EW, Riverón G, Pereira N, Cuétara E (2007) DNA damage measurement using a modified protocol of
sperm chromatin dispersion test Pharmacologyonline, 1:
14-19
11 Kazim RC, Jeanine TG, Marie L, Christopher JDJ, Douglas
TC (2006) Comparison of Chromatin Assays for DNA
Fragmentation Evaluation in Human Sperm Journal of
Andrology, 27: 1, 53 – 59
12 Li-hong Z,Yi Q,Ke-hua W,Qiuju W, Guozhen T, Lei-guang
W (2010) Measurement of sperm DNA fragmentation using bright-field microscopy: comparison between sperm chromatin dispersion test and terminal uridine nickend
labeling assay Fertility and Sterility, 94: 3, 1027 – 1032
13 Manicardi GC, Bianchi PG, Pantano S, Azzoni P, Bizzaro D, Bianchi U (1995) Presence of endogenous nicks in DNA of ejaculated human spermatozoa and its relationship to
chromomycin A3 accessibility Biol Reprod, 52: 864 - 7
14 Ribas – Maynou, Garcia, Abad (2012) Alkaline and neutral comet assay profiles of sperm DNA damage in clinical
groups Hum Reprod, 27(3): 652 - 8
15 Schoor RA (2002) Prostatitis and male infertility: evidence
and links Curr Urol Rep, 3(4): 324 - 329
16 Tomlinson MJ, White A, Barratt CLR, Bolton AE, Cooke ID (1992) The removal of morphologically abnormal sperm forms by phagocytes: a positive role for seminal leukocytes
Hum Repord, 7(4): 517 - 522
17 Zini A, Kamal K, Phang D, Willis J, Jarvi K (2001a) Biologic variability of sperm DNA denaturation in infertile men
Urology, 58, 258 - 261
Ngày phản biện nhận xét bài báo: 05/09/2016 Ngày bài báo được đăng: 10/10/2016