Bài viết trình bày việc xác định đặc điểm đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA trong carcinôm tuyến đại-trực tràng tại bệnh viện Ung bướu Cần Thơ.
Trang 1ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN KRAS, NRAS, BRAF VÀ PIK3CA
TRONG CARCINÔM TUYẾN ĐẠI TRỰC TRÀNG TẠI BỆNH VIỆN UNG BƯỚU CẦN THƠ
Nguyễn Hồng Phong*, Nguyễn Thanh Tuấn Minh*, Huỳnh Quyết Thắng*, Hoàng Anh Vũ**,
Ngô Quốc Đạt**, Mai Văn Nhã*, Võ Văn Kha*, Hồ Long Hiển*
TÓM TẮT
Mục tiêu: Xác định đặc điểm đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA trong carcinôm tuyến đại-trực
tràng tại bệnh viện Ung bướu Cần Thơ
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Mô tả cắt ngang 50 trường hợp carcinôm tuyến đại-trực tràng
được chẩn đoán và điều trị tại bệnh viện Ung bướu Cần Thơ Giải trình tự chuỗi DNA gen KRAS (exon 2), NRAS (exon 2, 3), BRAF (exon 15) và PIK3CA (exon 9, 20) để xác định đột biến và mối liên quan với một số đặc điểm lâm sàng, giải phẫu bệnh
Kết quả: Trong 50 trường hợp khảo sát gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA chúng tôi ghi nhận tỉ lệ đột biến
lần lượt là KRAS(34%), NRAS (0%), BRAF ( 2%) và PIK3CA (6%) Tất cả đều là đột biến điểm Tỷ lệ đột biến gen KRAS tại codon 12 và 13 là 26% Chỉ có 1 trường hợp đột biến ở codon 10 Đột biến gen KRAS thường gặp ở trực tràng (26%) hơn so với đại tràng (8%) với P=0,022 Các đặc điểm bệnh học khác như giới, loại mô học, độ
mô học, giai đoạn TNM không có liên hệ với đột biến gen KRAS Đột biến gen PIK3CA thường gặp ở nhóm bệnh nhân < 50 tuổi (6%) và nữ (6%) cao hơn so với nhóm bệnh nhân ≥ 50 tuổi (0%) và nữ (0%) với P=0,042 và P = 0,036
Kết luận: Tỷ lệ đột biến gen KRAS trên bệnh nhân carcinôm tuyến đại-trực tràng tại bệnh viện Ung bướu
Cần Thơ là 35,42% Đột biến gen KRAS có liên quan với vị trí u Đột biến PIK3CA liên quan với tuổi, giới tính Chưa ghi nhân đột biến NRAS Có 1 trường hợp đột biến BRAF dạng K601E cũng là một trong số các dạng đột biến gây hoạt hóa quá mức hoạt động của protein BRAF
Từ khoá: đột biến KRAS, đột biến BRAF, carcinôm tuyến đại-trực tràng
ABSTRACT
CHARACTERISTICS OF KRAS AND BRAF MUTATIONS
IN COLORECTAL ADENOCARCINOMAS IN CAN THO ONCOLOGY HOSPITAL
Nguyen Hong Phong, Nguyen Thanh Tuan Minh, Huynh Quyet Thang, Hoang Anh Vu,
Ngo Quoc Đat, Mai Van Nha, Vo Van Kha, Ho Long Hien
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 19 - No 5 - 2015: 171 - 178
Aim: To determine the characteristics of KRAS,NRAS,BRAF and PIK3CA gene mutations in colorectal
adenocarcinomas in Can Tho Oncology Hospital
Material and method: A cross- sectional study included 50 cases of colorectal adenocarcinoma were
diagnosed and treated at Can Tho Oncology Hospital KRAS and BRAF mutations were identified by direct DNA sequencing
Results: Among the 50 colorectal cancer patients, we detected 17 (34%) mutations in the KRAS, NRAS
*Bệnh viện Ung Bướu Cần Thơ ** Đại học Y dược TP HCM
Trang 2(0%), BRAF 1(2%) and PIK3CA 3(6%), all of which were point mutations Mutation frequencies at codon 12 and codon 13 were 26% Only one patient harbored a point mutation at codon 10 The KRAS mutation frequency was significantly higher in the rectum than in the colon (26% vs 8%, P=0.022).Other clinicopathological features, such as gender, histological type and grade, TNM stage, showed no positive relationship with KRAS gene mutations The PIK3CA mutation frequency was significantly higher in the <50yrs patients or female than in the group ≥50yrs (6% vs 0%) with P=0.042; P=-0.036 respectively
Conclusion: The KRAS mutation rates of colorectal adenocarcinoma patients in Can Tho Oncology Hospital
was 34% KRAS mutation was associated with tumor location PIK3CA mutation was associated with age and gender In 50 cases, none of NRAS mutaions detected
Key words: KRAS mutation, BRAF mutation, colorectal adenocarcinoma
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư đại-trực tràng là một trong
những bệnh ác tính phổ biến nhất trên thế giới
và Việt Nam Trong những năm gần đây, tỉ lệ
mắc và tử vong do ung thư đại-trực tràng ngày
càng tăng(17)
Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR)
đóng vai trò quan trọng trong tăng sinh và
biệt hóa của tế bào bình thường Tuy nhiên sự
hoạt hóa EGFR rất thường gặp trong ung thư
đại-trực tràng, và thông qua đường dẫn
truyền tín hiệu Ras/Raf/MAP/MEK/ERK dẫn
đến tăng sinh tế bào, di căn, thoát khỏi
apoptosis, tăng sinh mạch máu(14) Cetuximab
và panitumumab, là các kháng thể đơn dòng
ngăn chặn hoạt động của EGFR đã được FDA
cho phép sử dụng trong ung thư đại-trực
tràng tiến xa và được NCCN đưa vào phác đồ
điều trị ung thư đại-trực tràng có di căn(32)
Trong ung thư đại-trực tràng, tỉ lệ đột biến
gen KRAS khoảng 35-45%(1,6,44), và đột biến gen
BRAF khoảng 4-15%(6,11,39).Đột biến KRAS, BRAF
gây hoạt hóa đường truyền tín hiệu hạ lưu của
EGFR(45), dẫn đến không đáp ứng với liệu pháp
kháng EGFR(1,11,22) Do đó khảo sát đột biến gen
KRAS, BRAF có vai trò trong tiên lượng và lựa
chọn bệnh nhân để sử dụng thuốc kháng EGFR
Tại Việt Nam, trong những năm gần đây, với
sự phát triển của sinh học phân tử, đã có một số
công trình nghiên cứu về đột biến gen KRAS
trên ung thư đại-trực tràng, với tỉ lệ đột biến
khoảng 35-40% Tạ Thành Văn (2011), trong xây
dựng qui trình xác định đột biến gen KRAS, phát hiện 4/10 mẫu có đột biến gen KRAS(41) Kết quả nghiên cứu 10 mẫu mô ung thư đường tiêu hóa của Hồ Hữu Thọ (2011), phát hiện 4 mẫu có đột
biến gen KRAS(19) Hoàng Anh Vũ (2013), nghiên
cứu 173 ca, phát hiện 62 ca đột biến KRAS
(35,8%)(19) Chưa có công trình nghiên cứu nào
thực hiện khảo sát đột biến gen BRAF trên ung thư đại-trực tràng
Nghiên cứu này nhằm xác định một số đặc
điểm đột biến của gen KRAS và BRAF trên bệnh
nhân ung thư đại-trực tràng tại bệnh viện Ung bướu Cần Thơ
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu
50 bệnh nhân carcinôm tuyến đại-trực tràng tại bệnh viện Ung bướu Cần Thơ
Phương pháp nghiên cứu
Mô tả cắt ngang
Các bước tiến hành
Ghi nhận thông tin lâm sàng bao gồm vị trí
u, số lượng u, kích thước u, tình trạng di căn Bệnh phẩm được cố định bằng formol đệm trung tính, ghi nhận thông tin đại thể (dạng sùi, loét, thâm nhiễm hoặc kết hợp)
Trên lam HE, ghi nhận loại mô học, độ mô học theo WHO(8) và giai đoạn TNM(1)
Giải trình tự gen
Thu hoạch tế bào từ mô vùi nến
Vùng mô u được đánh dấu trên lam nhuộm
Trang 3HE và đối chiếu với các lam bệnh phẩm chưa
nhuộm, sau đó chúng tôi cạo vùng mô u tương
ứng trên lam chưa nhuộm
Tách chiết genomic DNA bằng bộ kit
Promega
Khuếch đại các exon bằng PCR
Gen BRAF được khuếch đại exon 15 bằng
PCR, gen KRAS được khuếch đại exon 2 bằng
COLD-PCR Trình tự các đoạn mồi được sử
dụng trong Bảng 1 Chu kỳ luân nhiệt được thực
hiện trên máy GeneAmp® PCR system 9700
(Applied Biosystems, Mỹ) Sản phẩm PCR được
phát hiện bằng điện di, sau đó được tinh sạch
bằng QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen, Mỹ)
Bảng 1: Các đoạn mồi của gen KRAS và BRAF
KRAS
Mồi xuôi:
5’-AAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3’
Mồi ngược:
5’-CAAAGAATGGTCCTGCACCAG-3
BRAF
Mồi xuôi:
5’-TGAAGACCTCACAGTAAAAATAGG-3’
Mồi ngược:
5’-TCCAGACAACTGTTCAAACTGAT-3
Thực hiện giải trình tự chuỗi DNA
Sản phẩm PCR đã được tinh sạch sẽ được
thực hiện phản ứng cycle sequencing với BigDye
Terminator Version 3.1 từ Applied Biosystems,
theo 1 chiều mỗi exon Trình tự DNA được đọc
bằng máy ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied
Biosystems, Mỹ)
Kết quả được phân tích bằng phần mềm
SeqScape, so sánh với trình tự tham chiếu của
KRAS và BRAF để chẩn đoán tình trạng đột biến
của các exon Quy trình chẩn đoán đột biến gen
được thực hiện tại Trung tâm Y Sinh học Phân
tử, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Các số liệu
được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS 16.0
KẾT QUẢ
Đặc điểm bệnh học của lô nghiên cứu
Một số đặc điểm chung của lô nghiên cứu
được tóm tắt trong bảng 2
Bảng 2: Đặc điểm bệnh của lô nghiên cứu
Đặc điểm Số lượng (%)
Tuổi : < 50 tuổi ≥ 50 tuổi
18 (36) 32(64) Giới: Nam
Nữ
29 (58)
21 (42)
Vị trí u: Đại tràng Trực tràng
23 (46)
27 (54) CEA: Tăng
Không tăng
28 (56)
22 (44)
CA 19.9: Tăng
Không tăng
8 (16)
42 (84) Loại mô học: Carcinôm tuyến
Carcinôm tuyến chế nhầy hoặc dạng tế bào nhẫn
40 (80)
10 (20)
Độ mô học: Độ 1
Độ 2
Độ 3
11 (22)
26 (52)
13 (26) Giai đoạn TNM: Giai đoạn I
Giai đoạn II Giai đoạn III Giai đoạn IV
9 (18)
19 (38)
16 (32)
6 (12)
Đặc điểm đột biến gen KRAS
Trong 50 trường hợp nghiên cứu, chúng tôi phát hiện 17 trường hợp có đột biến (34%), tất cả đều là đột biến điểm Đột biến chủ yếu xảy ra ở codon 12 với 13 trường hợp chiếm 26%, tiếp theo
là codon 13 với 3 trường hợp chiếm 6%, 1 trường hợp đột biến ở codon 10 (2%) Trong số đột biến
KRAS có 1 trường hợp đột biến ở cả 2 codon 12,
13 và 1 trường hợp có 2 dạng đột biến điểm ở cùng codon 12
Trong nghiên cứu này, chúng tôi ghi nhận 6 loại đột biến điểm trên exon 2 bao gồm Gly10Glu, Gly12Asp, Gly12Ser, Gly12Val, Gly13Asp, Gly13Ser
Các đột biến có tần suất cao nhất là Gly12Asp, Gly12Val và Gly12Ser với số lượng lần lượt là 5, 5, và 4 trường hợp
Bảng 3: Kết quả các loại đột biến KRAS
Loại đột biến Số lượng
Trang 4Loại đột biến Số lượng
Mối liên quan giữa đột biến gen KRAS và
các đặc điểm bệnh học
Bảng 4 tóm tắt mối liên quan giữa đột biến
gen KRAS và một số đặc điểm bệnh học của ung
thư đại-trực tràng gồm nhóm tuổi, giới tính,
CEA, CA 19.9, vị trí u, loại mô học, độ mô học và
giai đoạn TNM Mối liên quan giữa đột biến
KRAS và một số đặc điểm lâm sàng được kiểm
định bằng phép kiểm χ2
Bảng 4: Mối liên quan giữa đột biến KRAS và một số
đặc điểm bệnh học
Đặc điểm
KRAS
không đột biến (%)
KRAS
đột biến (%)
Tổng (%)
Giá trị P
Tuổi: < 50 tuổi
≥ 50 tuổi
13 (26)
20 (40)
5 (10)
12 (24)
18 (36)
32 (64) 0,486 Giới: Nam
Nữ
18 (36)
15 (30)
11(22)
6 (12)
29 (58)
22 (42) 0,490
Vị trí u: Đại tràng
Trực tràng
19 (38)
14 (28)
4 (8)
13 (26)
23 (46)
27 (54) 0,022 CEA huyết thanh
Không tăng
Tăng 16 (32) 17 (34) 11 (22)6 (12) 22 (44) 28 (56)
0,373
CA 19.9 huyết thanh
Không tăng
Tăng 28 (56) 5 (10) 14(28) 3 (6) 42 (84) 8 (16)
0,820
Loại mô học
Carcinôm tuyến
Carcinôm tuyến chế
nhầy hoặc dạng tế
bào nhẫn
27 (54)
6 (12)
13 (26)
4 (8)
40 (80)
10 (20) 0,654
Độ mô học: Độ thấp
Độ cao
24 (48)
9 (18)
13 (26)
4 (8)
37 (74)
13 (26) 0,775 Giai đoạn TNM
Giai đoạn I
Giai đoạn II
Giai đoạn III
Giai đoạn IV
3 (6)
15 (30)
11 (22)
4 (8)
6 (12)
4 (8)
5 (10)
2 (4)
9 (18)
19 (38)
16 (32)
6 (12) 0,124
Nghiên cứu này chưa ghi nhận mối liên
quan giữa tình trạng đột biến KRAS với các đặc
điểm bệnh học - lâm sàng như: tuổi, giới, CEA
huyết thanh, CA 19.9 huyết thanh, loại mô học,
độ mô học, giai đoạn TNM Đột biến KRAS
thường gặp ở trực tràng (13/27 - 48,1%) hơn so với đại tràng (4/23 - 17,4%)
Đột biến gen NRAS
Khảo sát đột biến NRAS trên exon 2 và 3
nhưng chúng tôi chưa ghi nhận được trường hợp đột biến nào
Đột biến gen BRAF
Qua khảo sát đột biến gen BRAF trong 50
trường hợp, chúng tôi ghi nhận 1 trường hợp đột
biến BRAF ở codon 601 (K601E) Đây là trường
hợp bệnh nhân nam, 51 tuổi, được chẩn đoán ung thư đại tràng tái phát sau phẩu thuật triệt để
và hóa trị 48 tháng
Đột biến gen PIK3CA
Trong 50 trường hợp khảo sát đột biến
PIK3CA ở exon 9 và exon 20, chúng tôi ghi nhận được 3 trường hợp đột biến PIK3CA; trong đó có
2 trường hợp ở exon 20 (4%) và 1 trường hợp đột biến ở exon 9 (2%) Có mối liên quan có ý nghĩa
thống kê giữa tình trạng đột biến PIK3CA với
tuổi, giới và chưa ghi nhận mối liên liên quan với các đặc điểm như: vị trí u, CEA huyết thanh, CA 19.9 huyết thanh, loại mô học, độ mô học, giai đoạn TNM
Bảng 5: Mối liên quan giữa đột biến PIK3CA và một
số đặc điểm bệnh học
Đặc điểm PIK3CA
không đột biến (%)
PIK3CA
đột biến (%)
Tổng (%)
Giá trị P
Tuổi: < 50 tuổi ≥ 50 tuổi
15 (30)
32 (64)
3 (6)
0 (0)
18 (36)
32 (64) 0,042 Giới: Nam
Nữ
29 (58)
18 (36)
0(0)
3 (6)
29 (58)
21 (42) 0,036
Vị trí u: Đại tràng Trực tràng
21 (42)
26 (52)
2 (4)
1 (2)
23 (46)
27 (54) 0,459 CEA huyết thanh
Không tăng Tăng 20 (40) 27 (54) 2 (4) 1 (2) 22 (44) 28 (56)
0,415
CA 19.9 huyết thanh Không tăng Tăng 39 (78) 8 (16) 3(6) 0 (0) 42 (84) 8 (16)
0,436
Trang 5Đặc điểm PIK3CA
không đột biến (%)
PIK3CA
đột biến (%)
Tổng (%)
Giá trị P
Loại mô học
Carcinôm tuyến
Carcinôm tuyến chế
nhầy hoặc dạng tế
bào nhẫn
37 (74)
10 (20)
3 (6)
0 (0)
40 (80)
10 (20) 0,372
Độ mô học: Độ thấp
Độ cao
34 (68)
13 (26)
3 (6)
0 (0)
37 (74)
13 (26) 0,290 Giai đoạn TNM
Giai đoạn I
Giai đoạn II
Giai đoạn III
Giai đoạn IV
9 (18)
17 (34)
15 (30)
6 (12)
0 (0)
2 (4)
1 (2)
0 (0)
9 (18)
19 (38)
16 (32)
6 (12) 0,648
BÀN LUẬN
Đột biến gen KRAS
Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định
được 17 trường hợp đột biến KRAS trên tổng số
48 bệnh nhân (35,42%) Đột biến gen KRAS xảy
ra khá thường xuyên ở ung thư đại-trực tràng
khoảng 35-45%(1,12,16,34,44) Hoàng Anh Vũ đã báo
cáo kết quả đột biến gen KRAS trên 173 ca ung
thư đại-trực tràng tại TP Hồ Chí Minh là
35,8%(21) Tỉ lệ đột biến gen KRAS trong nghiên
cứu này cũng phù hợp với tần suất đột biến của
gen KRAS trong ung thư đại-trực tràng
Có nhiều nghiên cứu khảo sát mối liên quan
giữa đột biến gen KRAS và một số yếu tố bệnh
học nhưng kết quả vẫn còn bàn cãi Shen
(2011)(40) Gil Ferreira(16) đã báo cáo mối liên quan
giữa đột biến gen KRAS và giới tính với tỉ lệ đột
biến ở nữ cao hơn nam, Elkof (2103)(13) đã báo cáo
sự liên hệ giữa tỉ lệ đột biến gen KRAS cao hơn
với vị trí u ở đại tràng phải và giai đoạn bệnh trễ
Watanabe (2013)(46) đã cho thấy mối liên quan
giữa tỉ lệ đột biến gen KRAS cao hơn ở bệnh
nhân nữ, tăng theo tuổi, và vị trí đại tràng phải
cao hơn so với đại tràng trái và trực tràng Qua
48 trường hợp trong nghiên cứu này, chúng tôi
chỉ ghi nhận đột biến KRAS thường gặp ở trực
tràng hơn so với đại tràng Có lẽ do mẫu nghiên
cứu của chúng tôi khá ít nên không thể phát hiện
các mối liên quan khác Tuy nhiên, Phipps(36)
nghiên cứu 1989 ca ung thư đại-trực tràng và
không ghi nhận mối liên quan nào giữa tuổi, giới, vị trí u, loại mô học, độ mô học, giai đoạn
bệnh với đột biến gen KRAS Zlobec(48) nghiên cứu 392 ca cũng ghi nhận kết quả tương tự
Các đột biến KRAS thường gặp nhất là
G12D, G12V, G13D, G12C, G12A, G12S, G12R,
và G13S, trong đó đột biến G12D là thường gặp nhất với tần suất khoảng 10-15%, tiếp theo là G12V và G13D với tần suất gần 10%(16, 34, 40) Tại Việt Nam, Hoàng Anh Vũ đã báo cáo 7 dạng đột
biến KRAS trên ung thư đại-trực tràng gồm
G12D, G12V, G12S, G12A, G12C, G13D, G13S(21) Trong nghiên cứu này chúng tôi ghi nhận 5 dạng đột biến trên codon 12 và 13 gồm G12D, G12V, G12S, G13D, G13S với tần suất tương đồng so với các nghiên cứu trước tại Việt Nam và trên thế giới Ngoài ra, trong nghiên cứu này, chúng tôi ghi nhận 1 trường hợp đột biến rất hiếm gặp trên codon 10 là G10E, cơ sở dữ liệu COSMIC chỉ mới ghi nhận 1 trường hợp(16), và chúng tôi chưa thấy có nghiên cứu nào báo cáo về dạng đột biến này Trường hợp này, chúng tôi đã thực hiện PCR và giải trình tự lần thứ 2 để xác định chẩn đoán
Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy rằng bệnh nhân có đột biến KRAS không đáp ứng với cetuximab hoặc panitumumab(13,22,25,44) nên
đột biến KRAS là yếu tố dự báo quan trọng
của sự không đáp ứng với thuốc kháng EGFR
Do đó, tất cả bệnh nhân ung thư đại-trực tràng
có đột biến KRAS ở codon 12 hoặc 13 đều
không điều trị thuốc kháng EGFR De Roock (2010)(5) khảo sát 579 bệnh nhân ung thư đại-trực tràng kháng hóa trị và được điều trị với cetuximab, đã nhận thấy bệnh nhân có đột
biến KRAS G13D (n=22) có thời gian sống còn
toàn bộ (7,6 tháng so với 5,7 tháng, P=0,005) và thời gian bệnh không tiến triển (4 tháng so với 1,9 tháng, P=0,004) dài hơn so với bệnh nhân
có các đột biến KRAS khác, bệnh nhân có đột biến KRAS G13D chỉ chăm sóc tích cực có tiên
lượng xấu hơn bệnh nhân có các loại đột biến
KRAS khác Do đột biến gen KRAS G13D khá
phổ biến, chỉ sau đột biến G12D và G12V nên
Trang 6kết quả nghiên cứu của De Roock rất đáng
lưu ý Tejpar (2012)(42) cho thấy bệnh nhân có
đột biến KRAS G13D sử dụng cetuximab kèm
hóa trị có thời gian bệnh không tiến triển dài
hơn so với nhóm chỉ hóa trị đơn thuần (7,4 so
với 6 tháng, P=0,039), tuy nhiên khi so sánh
với các bệnh nhân có đột biến KRAS khác thì
không có khác biệt Bando (2012)(2) trong một
nghiên cứu ở Nhật cũng cho thấy cetuximab
có thể kéo dài thời gian bệnh không tiến triển
và thời gian sống còn ở nhóm bệnh nhân đột
biến KRAS G13D (4,1 tháng và 8,5 tháng) so
với nhóm bệnh nhân có các đột biến KRAS
khác (2,1 tháng và 6,8 tháng), tuy nhiên sự
khác biệt không có ý nghĩa thống kê
Đột biến NRAS
Các nghiên cứu trước đây cho thấy tỉ lệ đột
biến NRAS trong khoảng 3-7% Đột biến NRAS
cũng là yếu tố dự đoán đáp ứng rất kém với
cetuximab hoặc panitumumab trong carcinôm
tuyến đại trực tràng di căn(9) và theo NCCN 2015
cũng khuyến cáo chỉ nên sử dụng 2 loại thuốc
trên cho bệnh nhân ung thư đại trực tràng di căn
có KRAS và NRAS không đột biến Nghiên cứu
của chúng tôi chưa ghi nhận được trường hợp
đột biến nào Có thể do cỡ mẫu chưa đủ lớn
Đột biến gen BRAF
Theo COSMIC, tỉ lệ đột biến gen BRAF trong
ung thư đại-trực tràng khoảng 10,7%(5) Nghiên
cứu này ghi nhận tỉ lệ đột biến BRAF là 2%, tỉ lệ
này khá phù hợp với một số nghiên cứu của các
tác giả châu Á như Shen(40) báo cáo tỉ lệ đột biến
chỉ có 1,7%, Chaiyapan, 2013 (0%)(6), Li-Ling H.,
2012 (1,1%)(21), Liou J., 2011 (3,8%)(26). Một số
nghiên cứu trên dân Âu – Mỹ cho thấy tỉ lệ đột
biến BRAF cao hơn như Price T, 2011(10,6%)(37)
Di Nicolantonio, 2008 (10%)(11), Samowitz W.,
2005 (9,5%)(39) Điều này cho thấy có thể đặc điểm
đột biến BRAF trong carcinôm tuyến đại trực
tràng có mang tính chất chủng tộc
Đột biến gen BRAF hầu hết là đột biến điểm
ở codon 600, loại V600E (trên 95%)(6) Nghiên cứu
của chúng tôi ghi nhận được 1 trường hợp đột
biến ở codon 601 (K601E) cũng là một dạng đột biến gây tăng hoạt động chức năng protein BRAF theo nghiên cứu của tác giả Wan(45)
Đột biến BRAF có mối tương quan với u ở
đại tràng phải, giai đoạn TNM trễ, u biệt hóa kém, loại mô học có tiết nhầy Ngoài ra, Yokota(47)
đã xác định đột biến BRAF còn là một yếu tố tiên
lượng độc lập đối với sống còn, liên quan với nguy cơ cao tử vong do ung thư Điều này cũng được Roth(38), Ogino(35), và Farina(15) khẳng định
Đột biến PIK3CA
Nghiên cứu này ghi nhận tỉ lệ đột biến chỉ 6% là khá thấp so với các nghiên cứu trước đây như Zhu K (9,5%) (48), Baldus (21%)(3)
Trong nghiên cứu này ghi nhận tỉ lệ đột biến
PIK3CA ở nhóm bệnh nhân < 50 tuổi (6%) và
nhóm bệnh nhân nữ (6%) cao hơn nhóm bệnh nhân ≥ 50 tuổi và bệnh nhân nam có ý nghĩa thống kê với p lần lượt là 0,042 và 0,036 Điều này vẫn còn bàn cãi do sự đối lập ở các nghiên cứu Thật vậy, nghiên cứu trên 1093 bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến đại trực tràng, tác giả Day ghi nhận độ tuổi trung bình của nhóm có
đột biến PIK3CA (72,1 ± 11,1) cao hơn so với
nhóm không đột biến (69,1 ± 11,5), sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p = 0,007(8) Một số nghiên cứu khác cũng cho thấy độ tuổi trung bình của nhóm có đột biến cao hơn ở nhóm không đột biến(22) Nhưng theo Eklof, nhóm tuổi
< 70 tuổi có tỉ lệ đột biến (2,7%) cao hơn so với nhóm tuổi ≥ 70 (1,9%) nhưng sự khác biệt không
có ý nghĩa thống kê (p = 0,226), tuy nhiên nghiên cứu này chỉ khảo sát exon 20 Nghiên cứu của Li cũng cho kết luận tương tự(24)
Các nghiên cứu chưa cho thấy sự khác biệt
về tỉ lệ đột biến PIK3CA theo giới tính một cách
thuyết phục Có nghiên cứu cho thấy ở nữ tỉ lệ đột biến cao hơn hẳn ở nam có ý nghĩa thống
kê(30) Nhưng cũng có nghiên cứu không có sự
khác biệt về tỉ lệ đột biến PIK3CA theo giới
tính(8,13)
Trang 7KẾT LUẬN
Nghiên cứu trên 50 trường hợp ghi nhận: tỷ
lệ đột biến gen KRAS trên bệnh nhân carcinôm
tuyến đại-trực tràng tại bệnh viện Ung bướu
Cần Thơ là 34% Các dạng đột biến ở codon 12
và 13 gồm G12D, G12V, G12S, G13D, G13S, với
tần suất đột biến G12D và G12V cao nhất, và 1
đột biến rất hiếm ở codon 10 là G10E Đột biến
gen KRAS thường gặp ở trực tràng nhiều hơn so
với đại tràng Chúng tôi chưa ghi nhận trường
hợp đột biến gen NRAS nào trong 32 bệnh nhân
Chỉ 1 trường hợp đột biến BRAF Tỉ lệ đột biến
PIK3CA là 6% và tỉ lệ đột biến PIK3CA ở nhóm
bệnh nhân < 50 tuổi và bệnh nhân nữ cao hơn có
ý nghĩa thống kê so với nhóm bệnh nhân ≥ 50
tuổi và nam
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Amado RG, Wolf M, Peeters M, Van Cutsem E, Siena S,
Freeman DJ, Juan T, Sikorski R, Suggs S, Radinsky R, Patterson
SD (2008) Chang, D.D Wild-type KRAS is required for
panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal
cancer J Clin Oncol., 26, 1626-1634
2 American Joint Committee on Cancer (2010), "AJCC cancer
staging atlas", Seventh Edition, Springer, pp 143-164
3 Baldus SE, Schaefer KL, Engers R, Hartleb D, Stoecklein NH, et al
(2010), "Prevalence and heterogeneity of KRAS, BRAF, and
PIK3CA mutations in primary colorectal adenocarcinomas and
their corresponding metastases" Clin Cancer Res, 16 (3), pp 790-9
4 Bando H, Yoshino T, Yuki S, Shinozaki E, Nishina T, Kadowaki
S, Yamazaki K, Kajiura S, Tsuchihara K, Fujii S et al (2012):
Clinical outcome of Japanese metastatic colorectal cancer
patients harbouring the KRAS p.G13D mutation treated with
cetuximab + irinotecan Japanese Journal Of Clinical Oncology,
42(12):1146-1151
5 Bokemeyer C, Kohne C, Rougier P, et al Cetuximab with
chemotherapy (CT) as first-line treatment for metastatic
colorectal cancer (mCRC): analysis of the CRYSTAL and OPUS
studies according to KRAS and BRAF mutation status Journal
of Clinical Oncology 2010;28(Suppl.)
6 Chaiyapan W, et al (2013), "Somatic Mutations of K-Ras and
BRAF in Thai Colorectal Cancer and their Prognostic Value"
Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 14 (1), pp 329-332
7 COSMIC (Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer) Database,
S Institute, Welcome Trust Genome Campus, Hinxton,
Cambridge http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/
8 Day FL, Jorissen RN, Lipton L, Mouradov D,
Sakthianandeswaren A, et al (2013), "PIK3CA and PTEN gene
and exon mutation-specific clinicopathologic and molecular
associations in colorectal cancer" Clin Cancer Res, 19 (12), pp
3285-96
9 De Roock W, Claes B, Bernasconi D, et al (2010) Effects of KRAS
BRAF NRAS and PIK3CA mutations on the efficacy of
cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory
metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis
Lancet Oncology, 11:753–62
10 De Roock W, Jonker DJ, et al (2010) Association of RAS p.G13D mutation with outcome in patients with chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer treated with cetuximab
JAMA, 2010, 304(16), 1812-1820
11 Di Nicolantonio F, Martini M, Molinari F, et al Wild-type BRAF
is required for response to panitumumab or cetuximab in metastatic colorectal cancer Journal of Clinical Oncology 2008;26:5705–12
12 Douillard JY, Siena S, Cassidy J, et al (2010) Randomized, phase III trial of panitumumab with infusional fluorouracil, leucovorin, and oxaliplatin (FOLFOX4) versus FOLFOX4 alone as first-line treatment in patients with previously untreated metastatic
colorectal cancer: the PRIME study Journal of Clinical Oncology;
28:4697–705
13 Eklof V, Wikberg ML, Edin S, et al (2013) The prognostic role of
KRAS, BRAF, PIK3CA and PTEN in colorectal cancer British
Journal of Cancer; 108: 2153–2163
14 Fang, J.Y.; Richardson, B.C The MAPK signaling pathways and colorectal cancer Lancet Oncol., 2005, 6, 322-327
15 Fariña-Sarasqueta A, van Lijnschoten G, Moerland E, Creemers
GJ, Lemmens VE, Rutten HJ, van den Brule AJ (2010) The BRAF V600E mutation is an independent prognostic factor for survival
in stage II and stage III colon cancer patients Ann Oncol., 21(12),
2396-2402
16 Gil FC, Aran V, Zalcberg-Renault I., et al (2014) KRAS mutations: variable incidences in a Brazilian cohort of 8,234
metastatic colorectal cancer patients BMC Gastroenterology, 14:73
17 GLOBOCAN 2008
18 Hamilton SR, “Pathology and genetics of tumours of the Digestive system”, World Health Organisation Classification of Tumours, 2000
19 Hồ Hữu Thọ, Nguyễn Duy Bắc, Trần Văn Khoa, Phạm Ngọc
Tuấn (2011), "Nghiên cứu phát hiện đột biến gen K-RAS bằng kỹ
thuật REMS - PCR để sàng lọc, chẩn đoán sớm một số ung thư đường tiêu hóa", Tạp chí - Y Dược học Quân sự, 6, tr 53-59
20 Hoàng Anh Vũ, Hứa Thị Ngọc Hà (2013), "Phát hiện đột biến
gen KRAS trong ung thu đại-trực tràng bằng kỹ thuật
COLD-PCR và giải trình tự DNA", Y học TP Hồ Chí Minh, Tập 17, Phụ bản của Số 3:51-56
21 Hsieh Li-Ling (2012), "Characteristics and prevalence of KRAS, BRAF, and PIK3CA mutations in colorectal cancer by
high-resolution melting analysis in Taiwanese population"
International journal of clinical chemistry, 413 (19), pp 1605-11
22 Iida S., Kato S., Ishiguro M., Matsuyama T., Ishikawa T., et al (2012), "PIK3CA mutation and methylation influences the
outcome of colorectal cancer" Oncol Lett, 3 (3), pp 565-570
23 Karapetis CS, Khambata-Ford S, Jonker, D.J.; O'Callaghan, C.J.;
Tu, D.; Tebbutt, N.C.; Simes, R.J.; Chalchal, H.; Shapiro, J.D.; Robitaille, S.; Price, T.J.; Shepherd, L.; Au, H.J.; Langer, C.; Moore, M.J.; Zalcberg, J.R K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer N Engl J Med., 2008,
359, 1757-1765
24 Li HT, Lu YY, An YX, et al (2011) KRAS, BRAF and PIK3CA mutations in human colorectal cancer: Relationship with metastatic colorectal cancer Oncology Reports; 25: 1691-1697
25 Lièvre A, Bachet JB, Le Corre D, Boige V, Landi B, Emile JF, Côté
JF, Tomasic G, Penna C, Ducreux M, Rougier P, Penault-Llorca
F, Laurent-Puig P (2004) KRAS mutation status is predictive of
Trang 8response to cetuximab therapy in colorectal cancer Cancer Res.,
66(8), 3992-3995
26 Liou JM, Wu MS, Shun CT, Chiu HM, Chen MJ, et al (2011),
"Mutations in BRAF correlate with poor survival of colorectal
cancers in Chinese population" Int J Colorectal Dis, 26, pp 1387 -
1395
27 Mao C, Zhou J, Yang Z, Huang Y, Wu X, Shen H, Tang J, Chen
Q: (2012) KRAS, BRAF and PIK3CA mutations and the loss of
PTEN expression in Chinese patients with colorectal cancer PloS
one, 7(5):e36653
28 Minoo P, Moyer MP, Jass JR (2007) Role of BRAF-V600E in the
serrated pathway of colorectal tumourigenesis Journal of
Pathology; 212:124–33
29 Nagasaka T, Sasamoto H, Notohara K, et al (2004) Colorectal
Cancer With Mutation in BRAF, KRAS, and Wild-Type With
Respect to Both Oncogenes Showing Different Patterns of DNA
Methylation Journal of Clinical Oncology; 22:4584-4594
30 Naguib A, Cooke JC, et al (2011), "Alterations in PTEN and
PIK3CA in colorectal cancers in the EPIC Norfolk study:
associations with clinicopathological and dietary factors" BMC
Cancer, 11, pp 123
31 Naguib A, Mitrou PN, Gay LJ, Cooke JC, Luben RN, et al (2010)
Dietary, lifestyle and clinicopathological factors associated with
BRAF and K-ras mutations arising in distinct subsets of
colorectal cancers in the EPIC Norfolk study BMC cancer 10
32 NCCN (2014) National Comprehensive Cancer Network
Guidelines in Oncology™: Colon cancer
http://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/colon.pdf
33 NCCN (2014) National Comprehensive Cancer Network
http://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/melanoma
34 Negru S, Papadopoulou E, Apessos A, et al (2004) KRAS, NRAS
and BRAF mutations in Greek and Romanian patients with
colorectal cancer: a cohort study BMJ Open 4:e004652
35 Ogino S, Nosho K, Kirkner GJ, Kawasaki T, Meyerhardt JA,
Loda M, Giovannucci EL, Fuchs CS (2009) CpG island
methylator phenotype, microsatellite instability, BRAF mutation
and clinical outcome in colon cancer Gut, 58, 90-96
36 Phipps AI, Buchanan DD, Makar KW, Win AK, Baron JA,
Lindor NM, Potter JD, Newcomb PA (2013): KRAS-mutation
status in relation to colorectal cancer survival: the joint impact of
correlated tumour markers Br J Cancer, 108(8):1757–1764
37 Price TJ, Hardingham JE, Lee CK, Weickhardt A, Townsend AR,
et al (2011), "Impact of KRAS and BRAF gene mutation status
on outcomes from the phase III AGITG MAX trial of
capecitabine alone or in combination with bevacizumab and
mitomycin in advanced colorectal cancer" J Clin Oncol, 29, pp
2675 - 2682
38 Roth AD, Tejpar S, Delorenzi M, et al (2010) Prognostic role of
KRAS and BRAF in stage II and III resected colon cancer: results
of the translational study on the PETACC-3, EORTC 40993,
SAKK 60–00 trial J Clin Oncol 2010;28:466–74
39 Samowitz WS, Sweeney C, et al (2005) Poor survival associated with the BRAF V600E mutation in microsatellite-stable colon
cancers Cancer Research 2005;65:6063-9
40 Shen H, Yuan Y, Hu HG, et al (2011) Clinical significance of K-ras and BRAF mutations in Chinese colorectal cancer patients
World J Gastroenterol 2011; 17: 809 – 816
41 Tạ Thành Văn, Nguyễn Kiến Dụ, Trần Vân Khánh (2011), "Xây
dựng qui trình xác định đột biến gen K-RAS ở bệnh nhân ung thư đại-trực tràng", Tạp chí Y học Việt Nam, 2(382), tr 34-37
42 Tejpar S, Celik I, Schlichting M, Sartorius U, Bokemeyer C, Van Cutsem E (2012): Association of KRAS G13D tumor mutations with outcome in patients with metastatic colorectal cancer treated with first-line chemotherapy with or without cetuximab
Journal of clinical oncology: official Journal of the American Society
of Clinical Oncology, 30(29):3570-3577
43 Tol J, Dijkstra JR, Klomp M, et al (2010) Markers for EGFR pathway activation as predictor of outcome in metastatic colorectal cancer patients treated with or without cetuximab
European Journal of Cancer; 46:1997–2009
44 Van Cutsem E, Köhne CH, Láng I, et al (2011) Cetuximab plus irinotecan, flourouracil and leucovorin as first-line treatment for metastatic colorectal cancer: updated analysis of overall survival
according to tumor KRAS and BRAF mutation status Journal of
Clinical Oncology;29:2011–9
45 Wan PT, Garnett MJ, Roe SM, Lee S, Niculescu-Duvaz D, Good
VM, Jones CM, Marshall CJ, Springer CJ, Barford D, Marais R (2004) Cancer Genome Project Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of BRAF
Cell, 116, 855-867
46 Watanabe T, Yoshino T, Uetake H, et al (2013) KRAS Mutational Status in Japanese Patients with Colorectal Cancer: Results from a Nationwide, Multicenter, Cross-sectional Study
Jpn J Clin Oncol; 43(7):706–712y
47 Yokota T, Ura T; Shibata N, Takahari D, Shitara K, Nomura M, Kondo C, Mizota A, Utsunomiya S, Muro K, Yatabe Y (2011) BRAF mutation is a powerful prognostic factor in advanced and recurrent colorectal cancer Br J Cancer, 2011, 104, 856-862
48 Zhu K, Yan H, Wang R, Zhu H, Meng X, et al (2014),
"Mutations of KRAS and PIK3CA as independent predictors of
distant metastases in colorectal cancer" Med Oncol, 31 (7), pp 16
49 Zlobec I, Bihl MP, Schwarb H, et al (2000) Clinicopathological and protein characterization of BRAF- and K-RAS-mutated
colorectal cancer and implications for prognosis International
Journal of Cancer; 127: 367-380
Ngày nhận bài báo: 20/08/15 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/06/2015 Ngày bài báo được đăng: 05/09/2015
Trang 9GIÁ TRỊ CỦA SINH THIẾT HÚT TRỰC TRÀNG VÀ DẤU ẤN
CALRETININ TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH HIRSCHSPRUNG
TẠI BỆNH VIỆN NHI ĐỒNG 2
Trần Quốc Việt*, Đoàn Thị Phương Thảo**, Đặng Hoàng Minh**, Lâm Thiên Kim*, Hồ Trần Bản*, Trần Thanh Trí*, Trương Nguyễn Uy Linh*, Trần Vĩnh Hậu*, Valérie Segers***, Philippe Goyens***,
Henri Steyaert***, Trương Quang Định*
TÓM TẮT
Mục tiêu: Bệnh Hirschsprung đặc trưng bởi sự vắng tế bào thần kinh trong lớp cơ ở phần xa đại tràng Tuy
nhiên, trong một số trường hợp việc chẩn đoán trên lâm sàng còn gặp nhiều khó khăn Nghiên cứu này nhằm mục đích đánh giá kết quả bước đầu ứng dụng phương pháp sinh thiết hút trực tràng với nhuộm calretinin để chẩn đoán bệnh HD
Phương pháp: Nghiên cứu tiền cứu được thực hiện tại Bệnh Viện Nhi Đồng 2 từ 1/2015 đến 7/2015 Bệnh
nhân có chẩn đoán lâm sàng nghi ngờ bệnh Hirschsprung được chỉ định sinh thiết hút trực tràng Mẫu bệnh phẩm được nhuộm H&E và calretinin nhằm tìm tế bào thần kinh ruột trong lớp dưới niêm Bệnh nhân được theo dõi cho đến khi có kết qủa chẩn đoán cuối cùng Các kết quả mong đợi nhằm đánh giá: độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên đoán âm của chẩn đoán
Kết quả: Từ 29/12/2015 đến 30/7/2015, có 86 trường hợp được sinh thiết hút trực tràng để chẩn đoán
Hirschsprung và có kết quả cuối cùng Tuổi trung vị 6,6 (0,2 – 159,3) tháng Nam/nữ: 53/33 Nhuộm calretinin giúp loại trừ HD trong 50/86 (58,1%) trường hợp Có 1 trường hợp dương tính giả và 1 trường hợp âm tính giả
Độ nhạy và độ đặc hiệu của calretinin lần lượt là 96,67% và 98,18% Trong khi đó, độ nhạy và độ đặc hiệu của H&E lần lượt là 100% và 89,9% Có 4 trường hợp chảy máu, không trường hợp nào thủng 4 trường hợp STH 2 lần do lấy không đủ mô
Kết luận: Sinh thiết hút trực tràng với nhuộm calretinin là phương pháp hữu ích trong chẩn đoán bệnh
Hirschsprung và lần đầu tiên được thực hiện tại Nhi Đồng 2 Kết quả bước đầu cho thấy đây là phương pháp đơn giản, an toàn, có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao
Từ khoá: Bệnh Hirschsprung, Sinh thiết hút trực tràng, Nhuộm Hoá mô miễn dịch calretinin, nhuộm HE
(Hematoxillin và Eosin)
ABSTRACT
ROLE OF RECTAL SUCTION BIOPSIES AND CALRETININ IMMUNOHISTOCHEMISTRY
IN DIAGNOSIS OF HIRSCHSPRUNG DISEASE AT CHILDREN’S HOSPITAL 2
Tran Quoc Viet, Doan Thi Phuong Thao, Dang Hoang Minh, Lam Thien Kim, Ho Tran Ban, Tran Thanh Tri, Truong Nguyen Uy Linh, Tran Vinh Hau, Valérie Segers, Philippe Goyens, Henri Steyaert, Truong Quang Dinh * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 19 - No 5 - 2015: 179 – 186
Objevtives: Hirschsprung’s disease (HD) is characterized by the absence of ganglion cells in the distal
myenteric layer of the colon However, the diagnosis is still difficult in an important number of cases if only have
* Khoa Ngoại Tổng hợp – Bệnh Viện Nhi Đồng 2 – Tp Hồ Chí Minh
** Bộ môn Giải Phẫu Bệnh – Đại Học Y Dược Tp.HCM