Bài viết trình bày việc xây dựng và thẩm định quy trình phân tích đồng phân quang học của atenolol bằng phương pháp sắc ký lỏng (HPLC).
Trang 1PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC CỦA ATENOLOL
TRONG VIÊN NÉN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG (HPLC)
Lê Thị Thu Cúc * , Thái Hồng Hạnh * , Lê Khánh Trúc Diễm * , Trần Mỹ Thiên Thanh *
TÓM TẮT
Mục tiêu: Xây dựng và thẩm định quy trình phân tích đồng phân quang học của atenolol bằng phương pháp
sắc ký lỏng (HPLC).
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu là đồng phân (S)-atenolol Trong quá trình
thực nghiệm, các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tách đồng phân như cột sắc ký, thành phần và tỉ lệ dung
môi sẽ được khảo sát nhằm chọn được điều kiện phân tích thích hợp
Sau khi tìm được điều kiện sắc ký thích hợp, tiến hành thẩm định quy trình phân tích bao gồm khảo sát tính phù hợp của hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, giới hạn phát hiện, độ chính xác và độ đúng
Kết quả: Xây dựng và thẩm định quy trình phân tích đồng phân quang học của atenolol, với các điều kiện
sắc ký như sau: cột sắc ký Lux Cellulose-1, pha động là hệ dung môi n-hexan-ethanol-diethylamin (80:20:0,1; tt/tt/tt), detector UV ở bước sóng 220 nm Độ phân giải giữa hai đồng phân lớn hơn 3,0, Khoảng tuyến tính 25 –
1000 μg /ml Phương pháp độ chính xác và độ lặp cao với RSD < 2% và độ phục hồi từ 98 – 102%
Kết luận: Bằng phương pháp HPLC, đã xây dựng và thẩm định được quy trình phân tích đồng phân quang
học của atenolol Phương pháp được ứng dụng để kiểm tra các chế phẩm chứa đồng phân quang học của atenolol
trên thị trường
Từ khóa: đồng phân atenolol, (S)-atenolol, Lux Cellulose-1
ABSTRACT
ENANTIOMERIC SEPARATION OF ATENOLOL IN TABLETS BY HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY METHOD
Le Thi Thu Cuc,Thai Hong Hanh, Lê Khanh Truc Diem, Tran My Thien Thanh
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 3- 2018: 400- 405
Objective: This paper describes validated direct liquid chromatographic chiral methods for enantiomeric
separation and quantitative determination of atenolol.
Methods: The subject of this study is (S)-atenolol The aims of our study are: research of chromatographic
conditions (column, mobile phase, ….) to separate the two isomers of atenolol The validation of an analytical method is the process by which it is established that the performance characteristics of the method, such as Precision, Accuracy, Specificity, Linearity, Limit of Detection (LOD), meet the requirements for the intended applications
Results: A high performance liquid chromatographic (HPLC) method was developed for the chiral separation
of atenolol The two enantiomers were separated on a Lux Cellulose-1 column The mobile phase was n-hexane-ethanol-diethylamine (80:20:0.1; v/v/v), UV detection was at 220 nm The resolution of the enantiomers was more than 3.0, The range of quantification for both enantiomers was 25-1000 μg.mL -1, Relative standard deviation of the method was below 2% (n=6), the recovery range was 98-102%
* Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: TS.DS Lê Thị Thu Cúc, ĐT: 0909337330, Email: thucuc_vkn@yahoo.com.vn
Trang 2Conclusion A high performance liquid chromatographic (HPLC) procedure for separation of the atenolol
enantiomers was established and validated The method showed applicable to quantitative determination of atenolol enantiomers in pharmaceutical preparations
Keywords: Atenolol enantiomers, (S)-atenolol, Lux Cellulose-1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Các đồng phân đối quang có thể khác nhau
về tính chất dược động học, dược lý học hay độc
tính Không hiếm các trường hợp chỉ một đối
quang có hoạt tính trong khi đối quang kia lại
gây độc cho cơ thể Trong hướng dẫn của FDA
(Mỹ), MHW (Nhật) hay EMEA (châu Âu) đều
nhấn mạnh việc tách riêng các đối quang và
đánh giá sự đóng góp của mỗi đối quang tới tác
dụng của thuốc Điều này cho thấy việc tách
đồng phân quang học đang trở thành một xu
hướng, và thực tế, nó là một trong những vấn đề
được quan tâm nghiên cứu hàng đầu trong lĩnh
vực kiểm nghiệm dược phẩm (1,2,5)
Atenolol là chất thuộc nhóm chẹn beta, do
cấu trúc của atenolol có carbon bất đối nên
chúng có hai đồng phân đối quang Hai đối
quang của atenolol là (S)-atenolol và
(R)-atenolol, trong đó chỉ có dạng (S) là dạng có hoạt
tính Mặt khác, sự hiện diện của dạng (R) còn
gây tác dụng phụ Các biệt dược của atenolol
trên thị trường phần lớn là dạng racemic Tuy
nhiên, do dạng đồng phân (S) có hoạt tính mạnh
hơn dạng racemic, nên hiện nay cũng đã xuất
hiện các chế phẩm dạng đồng phân riêng lẻ trên
thị trường
Tiếp theo công trình nghiên cứu về lĩnh vực
tách đồng phân quang học, trong bài báo này,
chúng tôi giới thiệu kết quả phân tích đồng phân
quang học (S)-atenolol bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC)
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Viên nén atenolol STADA (atenolol 50 mg)
Viên nén (S)-atenolol 25 mg (Nhà sản xuất:
Emcure pharm Ltd India)
Trang thiết bị, hóa chất, dung môi
Trang thiết bị
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao SHIMADZU UFLC 20A, Detector Diod Array SPD-20AD Cột Lux Cellulose-1 (cellulose tris(3,5-dimethylphenyl carbamat) (250 x 4,6 mm; 5 μm) Cột Lux Cellulose-2 (cellulose tris(3-cloro-4-methylphenyl carbamat) (250 x 4,6mm; 5 μm) Cột Lux Amylose-2 (amylose tris(5-cloro-2-methylphenyl carbamat) (250 x 4,6mm; 5 μm) Cân phân tích điện tử Mettler Toledo AT200,
bể siêu âm Hwashin, bình định mức, pipet chính xác, ống đong, cốc có mỏ,
Các thiết bị phân tích và dụng cụ phân tích
đã được hiệu chuẩn đạt quy định theo GLP và ISO/IEC 17025
Hóa chất, dung môi n-Hexan, 2-propanol (IPA), ethanol (EtOH),
diethylamin (DEA): dùng cho HPLC (J.T.Baker)
Chất chuẩn
Atenolol: Viện Kiểm nghiệm thuốc TPHCM,
số lô QT163 010515, hàm lượng 98,47%
(S)-Atenolol: Sigma-Aldrich, số lô 330892,
hàm lượng 99,0%
Phương pháp nghiên cứu
Thay đổi thành phần và tỉ lệ pha động, nhằm chọn được điều kiện phân tích đáp ứng các yêu cầu với các thông số: hai pic đồng phân phải tách nhau hoàn toàn với độ phân giải Rs > 1,5; đáp ứng đầu dò cao, hệ số bất đối As của pic nằm trong khoảng 0,8 - 1,5, Sau khi tìm được điều kiện phân tích thích hợp, tiến hành thẩm định quy trình phân tích bao gồm: khảo sát tính phù hợp của hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, giới hạn phát hiện, độ chính xác và độ đúng(4)
Chuẩn bị mẫu
Dung dịch mẫu chuẩn atenolol (500 μg/ml): Cân
chính xác khoảng 25 mg atenolol chuẩn, cho vào
Trang 3bình định mức 50 ml, thêm khoảng 35 ml
methanol, siêu âm 5 phút, lắc đều, để nguội,
thêm methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng
lọc PTFE 0,45 μm
Dung dịch mẫu chuẩn (S)-atenolol (250 μg/ml):
Cân chính xác khoảng 5 mg (S)-atenolol chuẩn,
cho vào bình định mức 20 ml, thêm khoảng 10
ml methanol, siêu âm 5 phút, lắc đều, để nguội,
thêm methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng
lọc PTFE 0,45 μm
Dung dịch mẫu thử (S)-atenolol: Cân 20 viên
(S)-atenolol, xác định khối lượng trung bình
viên Nghiền 20 viên thành bột mịn, cân lượng
bột viên tương ứng với khoảng 25 mg
(S)-atenolol, cho vào bình định mức 100 ml, thêm
khoảng 50 ml methanol, siêu âm 5 phút, lắc đều,
để nguội, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc
đều, lọc qua màng lọc PTFE 0,45 μm
Dung dịch mẫu thử atenolol: Cân 20 viên
atenolol, xác định khối lượng trung bình viên
Nghiền 20 viên thành bột mịn, cân lượng bột
viên tương ứng với khoảng 50 mg atenolol, cho
vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 50 ml
methanol, siêu âm 5 phút, lắc đều, để nguội,
thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua
màng lọc PTFE 0,45 μm
Dung dịch mẫu placebo: chuẩn bị như dung
dịch mẫu thử nhưng thay lượng bột thuốc bằng
lượng tá dược tương ứng trong mẫu thử (viên
nén atenolol)
Dung dịch mẫu trắng: Dung môi hòa tan mẫu
là methanol
KẾT QUẢ
Khảo sát điều kiện sắc ký
Bảng 1 Các điều kiện sắc ký khảo sát (3)
(80:20:0,1)
(80:20:0,1)
Cột Lux Cellulose-1
Nhận xét: Điều kiện 1, 2, 3 và 4: không phân biệt được các dạng đồng phân
Điều kiện 5: hai pic đồng phân tách hoàn toàn với RS = 3,89 (pic 1 có thời gian lưu 9,92 phút
và pic 2 có thời gian lưu 12,80 phút).Như vậy, điều kiện thích hợp để phân tách đồng phân quang học atenolol là: Cột sắc ký Lux Cellulose-1
(250 x 4,6 mm; 5 μm) Pha động
n-hexan-EtOH-DEA (80:20:0,1) Tốc độ dòng: 1 ml/phút Nhiệt
độ cột: 30 oC Thể tích tiêm mẫu: 20 μl Bước sóng phát hiện: 220 nm (Hình 1)
Thẩm định phương pháp
Khảo sát tính phù hợp hệ thống Bảng 2 Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của
phương pháp (n=6)
Rt (phút)
%RSD (Rt)
% RSD (S)
(phút)
%RS
D (Rt)
% RSD (S)
As Rs
3,9
Kết quả thống kê cho thấy, sau 6 lần sắc ký thông số thời gian lưu (Rt) và diện tích pic (S) của mỗi pic đồng phân có RSD < 2%; giá trị độ phân giải (RS) lớn hơn 1,5 và hệ số đối xứng (AS) nằm trong khoảng 0,8 - 1,8, Vậy phương pháp đạt tính phù hợp hệ thống
Tính đặc hiệu
Tiến hành sắc ký mẫu trắng, mẫu đối chiếu
và mẫu thử
Kết quả cho thấy mẫu trắng không có pic trùng với pic chất phân tích Thời gian lưu của pic chính trong mẫu thử tương ứng với thời gian
lưu của pic chính trong mẫu chuẩn (S)-atenolol Khi thêm chuẩn (S)-atenolol vào mẫu chuẩn atenolol thì diện tích pic (S)-atenolol (pic có thời
gian lưu khoảng 12,8 phút) tăng cao so với ban đầu Phổ tử ngoại tại thời gian di chuyển của các pic trong mẫu thử giống phổ tử ngoại của mẫu chuẩn Độ tinh khiết của các pic lớn hơn 99% Hai pic của hai dạng đồng phân có phổ UV giống nhau Vậy phương pháp có tính đặc hiệu
Trang 4Điều kiện 1 (mẫu chuẩn atenolol) Điều kiện 2 (mẫu chuẩn atenolol)
Điều kiện 3 (mẫu chuẩn atenolol) Điều kiện 4 (mẫu chuẩn atenolol)
mẫu chuẩn atenolol mẫu chuẩn (S)-atenolol
Điều kiện 5
Hình 1 Các sắc ký đồ khảo sát điều kiện sắc ký
Hình 2 Sắc ký đồ của atenolol
(mẫu chuẩn atenolol)
Hình 3 Sắc ký đồ của chuẩn atenolol + chuẩn
(S)-atenolol
Trang 5Hình 4 Sắc ký đồ của (S)-atenolol
(mẫu chuẩn)
Hình 5 Sắc ký đồ của (S)-atenolol
(mẫu thử)
Hình 6 Sắc ký đồ của mẫu trắng(Placebo) Khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại và giới hạn phát hiện
Bảng 3 Phương trình hồi quy, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện
(S)-atenolol
0,1 µg/ml
Nhận xét: kết quả thống kê cho thấy quy
trình phân tích có khoảng tuyến tính rộng với hệ
số tương quan cao
Độ lặp lại, độ chính xác trung gian và độ đúng
Bảng 4 Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ chính xác trung gian
(mg)
Diện tích
Diện tích
(S)-atenolol Hàm lượng (%)
1
50
Trang 6Bảng 5 Kết quả khảo sát độ đúng
Tỷ lệ chất
chuẩn thêm vào
(%)
Lượng (S)-atenolol
có sẵn (µg/ml)
Lượng (S)-atenolol
Lượng tìm lại ( µg/ml)
Tỷ lệ phục hồi (%)
Nhận xét: Phương pháp phân tích đạt độ
đúng với tỷ lệ phục hồi nằm trong khoảng cho
phép 98%-102%
BÀN LUẬN
Với sắc ký pha thuận sử dụng pha tĩnh bất
đối, dung môi không phân cực như n-hexan
chứa một alcol như ethanol hay IPA thường
được sử dụng Vai trò của alcol là cạnh tranh
với atenolol để gắn với pha tĩnh bất đối nhờ
khả năng tạo liên kết hydro Để tách các chất
có nhóm acid, một lượng nhỏ các acid như
DEA cũng được thêm vào pha động để làm
giảm thời gian lưu, tăng độ phân giải cũng
như giảm hệ số kéo đuôi Ngoài ra, sự có mặt
của DEA sẽ tăng khả năng tách đối quang vì
nó có tác dụng ngăn sự kết hợp của các đối
quang
KẾT LUẬN
Bằng phương pháp HPLC sử dụng pha tĩnh
bất đối, chúng tôi đã tiến hành xây dựng và
thẩm định quy trình phân tích đồng phân quang
học (S)-atenolol, với các điều kiện như sau: cột
sắc ký Lux Cellulose-1, chiều dài 250 mm, đường
kính trong 4,6 mm, kích thước hạt 5 μm Pha
động là hệ dung môi n-hexan-EtOH-DEA
(80:20:0,1, v/v/v), tốc độ dòng 1 ml/phút, nhiệt độ
30 oC, thể tích tiêm mẫu 20 μl, bước sóng phát hiện 220 nm Quy trình này có tính đặc hiệu, độ chính xác và độ lặp cao
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Alberto C., Luisa P., Alessandro M., Nicola M., Francesco D (2011), “Recent applications in chiral high performance liquid
chromatography: A review”, Analytica Chimica Acta, 706,
pp.205-222,
2 Caner H., Groner E., Levy L., Agranat I (2004), “Trends in the
development of chiral drugs”, Drug Discov Today, 9(3), 105,
3 Dongmei W., Fang L., Zhen J., Li Y., and Xingjie G.o (2014),” Chiral Recognition Mechanisms of four β-Blockers by HPLC
with Amylose Chiral Stationary Phase”, Iran J Pharm Res, 13(2),
pp.449-45,
4 ICH Harmonised tripartite guideline (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology, pp.1-13,
5 Landoni MF, Soraci A (2001), “Pharmacology of Chiral
Compounds: 2-Arylpropionic Acid Derivatives”, Current Drug
Metabolism, 2, 37-51,
Ngày phản biện nhận xét bài báo: 02/03/2018 Ngày bài báo được đăng: 20/04/2018