Bước đầu đánh giá hiệu quả keo dán fibrin tự thân điều trị phẫu thuật mộng thịt trong nhãn khoa

Keo fibrin là một trong những loại keo sinh học, dùng để dán mô được ứng dụng khá phổ biến hiện nay trong y học. Mặc dù có nhiều thuận lợi như cầm máu nhanh trong phẫu thuật, tương hợp sinh học cao, dễ sử dụng nhưng keo fibrin có thể mang lại một số rủi ro và vấn đề an toàn, do các thrombin có nguồn gốc từ động vật có thể gây ra phản ứng dị ứng ở một số bệnh nhân hoặc có thể gây xuất huyết nghiêm trọng.

BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ KEO DÁN FIBRIN TỰ THÂN ĐIỀU TRỊ PHẪU THUẬT MỘNG THỊT TRONG NHÃN KHOA

Huỳnh Duy Thảo*, Diệp Hữu Thắng**, Lê Thanh Hùng *** , Võ Quốc Vũ * , Thái Trúc Quỳnh*,

Trần Công Toại *

TÓM TẮT

Đặt vấn đề: Keo fibrin là một trong những loại keo sinh học, dùng để dán mô được ứng dụng khá phổ biến

hiện nay trong y học Mặc dù có nhiều thuận lợi như cầm máu nhanh trong phẫu thuật, tương hợp sinh học cao, dễ sử dụng … nhưng keo fibrin có thể mang lại một số rủi ro và vấn đề an toàn, do các thrombin có nguồn gốc từ động vật có thể gây ra phản ứng dị ứng ở một số bệnh nhân hoặc có thể gây xuất huyết nghiêm trọng Ngoài ra còn có nguy cơ lây truyền các tác nhân lây nhiễm từ động vật sang người Do đó,

để khắc phục các nhược điểm trên, chúng tôi nghiên cứu quy trình tạo keo fibrin có nguồn gốc tự thân và bước đầu đánh giá hiệu quả của keo fibrin trong phẫu thuật điều trị mộng thịt

Mục tiêu nghiên cứu: Tạo keo fibrin tự thân và bước đầu đánh giá hiệu quả của keo trong phẫu thuật điều

trị mộng thịt

Phương pháp nghiên cứu: Keo fibrin được tạo ra từ hai thành phần chính có trong máu là fibrinogen và

thrombin Hai thành phần này sẽ được phân lập và kết hợp với nhau để tìm ra quy trình tạo keo hiệu quả Sản phẩm keo được đánh giá bởi một số tiêu chí về cấu trúc, độ vô khuẩn cũng như khía cạnh an toàn sinh học cho người bệnh

Kết quả: Thiết lập được quy trình tạo keo fibrin dùng để dán mô và bước đầu thử nghiệm đánh giá hiệu quả

của keo fibrin tự thân trong điều trị phẫu thuật mộng thịt

Kết luận: Với kết quả nghiên cứu này, keo fibrin sẽ đóng góp thêm một sự lựa chọn cho các nhà phẫu thuật

trong điều trị mộng thịt cũng như đáp ứng được khía cạnh an toàn cho chính người bệnh

Từ khoá: Huyết tương người, keo fibrin, fibrinogen, thrombin.

ABSTRACT

PRELIMINARY ASSESSMENT OF EFFECTIVENESS AUTOLOGOUS FIBRIN GLUE IN TREATMENT

PTERYGIUM IN OPHTHALMOLOGY

Huynh Duy Thao, Diep Huu Thang, Le Thanh Hung, Vo Quoc Vu, Thai Truc Quynh, Tran Cong Toai

* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 19 - No 6 - 2015: 94 - 99

Background: Fibrin glue is one of the biological glue, used to glue tissues, commonly used in medicine today

Although there are many advantages such as rapid hemostasis in surgery, with high biocompatible, using fibrin

because the thrombin is derived from animals that can cause allergic reactions in some patients or can cause serious bleeding Also, there is some risk of transmission of pathogens from animals to humans Therefore, to overcome these disadvantages, we study the process of creating autologous fibrin glue and initially evaluated the efficacy of fibrin glue in pterygium surgery

* Bộ môn Mô – Phôi – Di truyền, Trường ĐHYK Phạm Ngọc Thạch

** Khoa Giác Mạc, Bệnh viện Mắt TP.HCM ***Khoa Răng - Hàm - Mặt, ĐH Y Dược TP.HCM

Objectives: Autologous fibrin glue creation and initially evaluated the efficacy of fibrin glue in pterygium surgery

Methods: Fibrin glue is made up of two main components with fibrinogen and thrombin in blood Two

components will be isolated and combined together to figure out how to create effective glue Fibrin glue are evaluated by a number of criteria such as the structure of the glue, the sterility and biosafety aspects for patients

Results: Establishing a process to create fibrin glue used as tissue adhesive and initially tested to assess the effectiveness of autologous fibrin glue in pterygium treatment

Conclusion: With the results of this study, fibrin glue will contribute more choice for surgeons in the treatment of pterygium as well as response the safety aspects for the patient.

Key words: Human plasma, fibrin glue, fibrinogen, thrombin

ĐẶT VẤN ĐỀ

Keo có nguồn gốc sinh học dùng để kết

dính mô và cầm máu trong phẫu thuật là một

trong những hướng nghiên cứu có tính ứng

dụng cao trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là để

cầm máu trong các phẫu thuật thần kinh Thu

nhận các thành phần của keo từ máu người

hoặc động vật có thể mang lại những nguy cơ

lây nhiễm virus cũng như nguy cơ gây phản

ứng miễn dịch từ các protein dị loại Fibrin tự

thân đã được nghiên cứu và phát triển để khắc

phục những nhược điểm trên bằng cách tách

chiết các thành phần của keo từ máu của chính

bệnh nhân Keo fibrin bao gồm hai thành phần

chính là fibrinogen và thrombin, khi cho hai

thành phần này kết hợp với nhau thì thrombin

sẽ chuyển hóa fibrinogen thành fibrin(1,8,14) Các

sợi này sẽ hình thành nên mạng lưới không

gian ba chiều để tạo thành khối kéo kết dính

với nhau Sự ra đời của keo fibrin đã mang lại

nhiều sự lựa chọn hơn cho ngành ngoại khoa

nói chung và ngành nhãn khoa nói riêng Theo

đó, keo fibrin có thể thay thế vai trò chỉ khâu

trong phẫu thuật mộng thịt là một giải pháp

hợp lý, giúp rút ngắn thời gian phẫu thuật, cải

thiện sự thoải mái sau mổ và có thể tránh

được các vấn đề liên quan đến chỉ khâu

ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu thực nghiệm mô tả

Đối tượng nghiên cứu

Keo fibrin tự thân thu từ máu ngoại vi của bệnh nhân mộng thịt tại Khoa Giác Mạc, Bệnh viện Mắt TP HCM

Phương pháp nghiên cứu

Phân lập fibrinogen và thrombin

Fibrinogen được thu nhận từ máu ngoại vi (máu đã sử dụng sau khi làm xét nghiệm) Phần huyết tương thu được này được sử dụng để tách chiết fibrinogen(2,9,11,13), chủ yếu theo quy trình tham khảo của tác giả Glenn Isaacson(6) (đã có những bước biến đổi cho phù hợp với điều kiện nghiên cứu) Theo đó, Máu thu nhận được để yên ở 40C nhằm để phân tách các thành phần của máu Sau khoảng thời gian 3-4 giờ đem quay ly tâm ở 3000vòng/phút trong 15 phút Thu nhận phần huyết tương Phần huyết tương thu được, được đem đông lạnh ở -200C trong 1 giờ sau đó

để qua đêm ở 40C Sau đó rã đông ở 2-40C Ly tâm phần huyết tương đã rã đông 3000 vòng/phút, trong 15 phút Loại bỏ dịch nổi, chừa lại 0.5 ml và huyền phù cặn lắng với nước cất Phần dịch này chính là dịch fibrinogen và được bảo quản trong tube eppendorf (1 ml/1vial) ở điều kiện bảo quản -200C sử dụng trong vòng 1 tháng Toàn bộ quá trình được tiến hành trong điều kiện vô trùng

Thrombin được thu nhận theo phương pháp của Saxena S(10) và có những bước điều chỉnh để phù hợp với điều kiện nghiên cứu Theo đó, máu thu nhận được để yên ở 40C nhằm để phân tách

các thành phần của máu Sau khoảng thời gian

3-4 giờ đem quay ly tâm ở 3000vòng/phút trong 15

phút Thu nhận khoảng 1ml huyết tương cho

vào type bảo quản qua đêm ở -200C Lấy 1 ml

huyết tương đông lạnh đem đi rã đông ở 2-40C

và pha loãng với nước cất tạo thành 10 ml dung

dịch Thêm dung dịch acid acetic 1% (tạo pH

5.3) Lắc đều sau đó để yên để tạo kết tủa trong

vòng 30 phút Ly tâm 3000 vòng/phút trong 5

phút Thu tủa lắng, thêm dung dịch DPBS vào và

điều chỉnh pH 7.0 (sử dụng dung dịch Na2CO3

0,01M) Đặt dung dịch trong môi trường có nhiệt

độ 370C trong 15 phút sau đó bổ sung CaCl2

0,1M Xuất hiện khối đông hơi đục trong vòng

1-2 phút Để thu nhận được dung dịch thrombin

trong suốt, dùng đũa thủy tinh khuấy tròn để

cuộn phần tủa đục vào đầu đũa, phần còn lại là

thrombin Cho vào tube eppendorf Dung dịch

thrombin này được bảo quản ở -200C sử dụng

trong vòng 1 tháng Toàn bộ quá trình được tiến

hành trong điều kiện vô trùng

Phương pháp tạo keo fibrin

Keo fibrin được tạo ra dựa trên sự kết hợp

giữa fibrinogen và thrombin theo một tỉ lệ thể

tích phù hợp để tạo keo theo tiêu chí keo được

tạo ra trong thời gian nhanh nhất, khối keo đồng

nhất và keo có độ bền cao nhất

Đánh giá cấu trúc keo fibrin

Sau khi keo được tạo ra sẽ được đánh giá về

cấu trúc bằng mô học (nhuộm H&E), đánh giá

đặc điểm bề mặt keo (SEM) Ngoài ra, keo fibrin

còn được khảo sát thời gian đông và thời gian

hủy keo để có được một khảo sát sơ bộ về thời

gian để giúp các nhà lâm sàng có thể ứng dụng

keo trên lâm sàng

Đánh giá đặc điểm an toàn sinh học của

keo fibrin

Keo được thu nhận và phân lập trong điều

kiện vô trùng, đảm bảo tối đa tiêu chí vô trùng

cho sản phẩm

Tiếp theo, keo được đánh giá độ vô khuẩn

theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV để kiểm

Ngoài ra, keo cũng được đánh giá khả năng gây độc đối với tế bào theo tiêu chuẩn ISO:

10993-5 trong điều kiện nghiên cứu in vitro Đây

là bước đánh giá khả năng gây độc có thể có của keo với tế bào

Ngoài các tiêu chí đánh giá trên, keo fibrin được tạo ra hướng đến là keo dán mô tự thân, được tạo ra từ chính máu của người bệnh do

đó keo đáp ứng được tiêu chí tương hợp sinh học và an toàn cho chính người bệnh vì loại trừ các yếu tố nguy cơ như lây nhiễm bệnh (các bệnh lây nhiễm từ virus như HIV, Viêm gan B, C …) và cũng loại trừ được các nguy cơ

từ các protein ngoại lại (như trong trường hợp keo sinh học được sản xuất có nguồn gốc từ

động vật – keo dị loại)

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Đánh giá giới hạn nhiễm khuẩn

Keo fibrin tạo ra phải phải đảm bảo vô khuẩn theo tiêu chuẩn giới hạn nhiễm khuẩn, phụ lục 13.6, Dược điển Việt Nam IV (2009) Đây

là phương pháp nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm, mốc có khả năng sống lại được và phát hiện các vi khuẩn chỉ điểm y tế có trong sản phẩm Thử nghiệm này sẽ được thực hiện tại Trung tâm kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Dược phẩm (thuộc Sở Y Tế TP.HCM) Kết quả đánh giá độ vô khuẩn cho thấy, khung fibrin là một khối đặc, trong, màu sắc hơi vàng, đạt độ vo khuẩn theo tiêu chí của Dược điển Việt Nam IV

Đánh giá độc tính đối với tế bào

Đánh giá độc tính cấp tính của vật liệu đối với

tế bào trong điều kiện in vitro theo tiêu chí ISO

10993-5:2009 (Tests for Cytotoxicity—In Vitro Methods) Tế bào được nuôi trong keo fibrin trên đĩa 6 giếng Được quan sát bằng kính hiển vi đảo ngược để theo dõi và đánh giá sự bám dính và phát triển của nguyên bào sợi trong khoảng thời gian 48 giờ Sau khoảng thời gian theo dõi và đánh giá cho thấy, keo fibrin không gây độc đối

với tế bào trong điều kiện nghiên cứu in vitro

Hình 1 Kết quả đánh giá khả năng gây độc in vitro của keo fibrin đối với nguyên bào sợi (A) Mẫu

chứng, không có nuôi tế bào (B) Keo fibrin được sử dụng để nuôi nguyên bào sợi trong khoảng 24 giờ đầu, các tế bào bắt đầu cố định và bám dính, chưa có nhiều tế bào phát triển (chủ yếu là các tế bào tròn, bầu dục) (20X) (C) Sau khoảng thời gian 24-48 giờ nuôi cấy, các tế bào bắt đầu phân chia mạnh, có hình thái đặc trưng của nguyên bào sợi (20X)

Đánh giá cấu trúc của keo

Hình 2 Kết quả đánh giá cấu trúc keo fibrin (A) Kết quả sau khi tạo keo fibrin được quan sát bằng kính hiển

vi đảo ngược (10X) (B) Kết quả nhuộm H-SG cho keo fibrin được chụp ở vật kính 10X (C) Kết quả khảo sát bề mặt khung bằng kính hiển vi điện tử truyền suốt (SEM, x400)

Khung fibrin sau khi được tạo ra sẽ tiến hành

nhuộm H-SG và SEM Dựa vào kết quả thu được

từ nhuộm H-SG và SEM trên khung fibrin, có thể

đưa ra nhận định chung, khung fibrin có một

cấu trúc xốp, cấu tạo từ những sợi protein đan

chéo vào nhau Sợi protein này có đường kính

trung bình khoảng 0,5 µm, kích thước các lỗ

không đồng nhất trong toàn bộ khung, kích

thước này dao động nằm trong khoảng từ 30-60

µm Kết quả này phù hợp với quá trình tạo

khung fibrin trong cơ thể để ngăn quá trình chảy máu bằng cách tạo ra cục máu đông, có bản chất

là khung fibrin

Đánh giá khả năng tạo keo

Chúng tôi thay đổi tỉ lệ thể tích kết hợp giữa

fibrinogen và thrombin theo nhiều cách kết hợp khác nhau dựa trên một số nghiên cứu của các tác giả trên thế giới về tỉ lệ kết hợp giữa hai thành phần này(3,5) Từ đó có bảng số liệu:

Bảng 1: Tóm tắt kết quả tạo keo fibrin theo các tỉ lệ thể tích khác nhau của fibrinogen và thrombin

Tỉ lệ (v/v; ml/ml)

Kết quả tạo khối keo Thời gian đông

Tỉ lệ thể tích kết

hợp giữa

fibrinogen và

Fibrinogen (ml) Thrombin (ml)

thrombin (ml) 2 1 Không tạo được keo

Đánh giá hiệu quả bước đầu trên bệnh

nhân điều trị phẫu thuật mộng thịt

Chúng tôi tiến hành sử dụng quy trình đã

được thiết lập để thử nghiệm keo fibrin trong

trường hợp điều trị phẫu thuật mộng thịt ghép

mô Nghiên cứu được triển khai thử nghiệm tại

Khoa Giác Mạc, Bệnh viện Mắt TP HCM Thử

nghiệm trên keo fibrin tự thân đã được thông

qua bởi Hội đồng Y đức tại Bệnh viện Ngoài ra,

bệnh nhân tự nguyện tham gia nghiên cứu với

phiếu cam kết đồng ý tham gia chương trình

nghiên cứu Các phương pháp nghiên cứu và

tiến hành phẫu thuật được tiến hành trong điều

kiện vô trùng nghiêm ngặt tại Phòng thí nghiệm

cũng như theo các quy trình phẫu thuật được

cho phép tại bệnh viện

Trong đó, keo fibrin được tạo ra hoàn toàn từ

chính máu của người bệnh (keo fibrin tự thân)

Kết quả cho thấy thời gian để keo dính khoảng 3

phút (khi so sánh trong điều kiện in vitro khoảng

30 giây – 1 phút), thời gian này đủ để các nhà

phẫu thuật hoàn tất quy trình phẫu thuật Trong

tất cả các trường hợp sử dụng không có trường

hợp nào bị bong mảnh ghép, keo dính tốt và đáp

ứng tiêu chí như một loại keo dán mô(4,7)

Keo đáp ứng được khía cạnh an toàn cho người bệnh (trong các trường hợp thử nghiệm không có trường hợp nào bị dị ứng vì được thu nhận từ huyết thanh tự thân), không có trường hợp nào bị nhiễm trùng(12)

Đặc biệt là sự hài lòng của người bệnh khi sử dụng keo fibrin làm chất kết dính mảnh ghép nếu so với dùng chỉ khâu Vicryl Khi sử dụng chỉ khâu, người bệnh có cảm giác khó chịu, không thoải mái và thời gian chỉ khâu tiêu biến cũng lâu hơn so với sử dụng keo fibrin tự thân

Bên cạnh đó, chúng tôi cũng tiến hành nghiên cứu đối chứng với keo fibrin thương mại Khi so sánh keo fibrin tự thân với keo thương mại kết quả cho thấy Keo thương mại có sử dụng huyết thanh bò nên một số trường hợp có gây ra dị ứng, thời gian keo thương mại tác dụng nhanh (khoảng 30 giây) nên đòi hỏi phẫu thuật phải thực hiện nhanh chóng

Ngoài ra, keo fibrin thương mại có giá thành khá cao (ví dụ, TISSEEL Lyo (2ml), Baxter,

£80.34; Evicel Fibrin Sealant, LTD 3905, Omrix Biopharmaceuticals, $79.99) Trong khi đó, keo fibrin tự thân được sản xuất với chi phí ước lượng khoảng $20)

Hình 3 Kết quả ghép tế bào gốc rìa giác mạc trên nền collagen sử dụng keo fibrin tự thân để giữ nền ghép

Bệnh nhân sẽ được phẫu thuật loại bỏ mộng

thịt và sử dụng tế bào gốc rìa giác mạc để tái tạo

lại vùng mô, tế bào này được nuôi cấy trên nền

collagen và được cố định bằng keo fibrin tự thân

từ máu ngoại vi của chính người bệnh (A) Bệnh

nhân bị mộng thịt (B) Một ngày sau ghép (C)

Một tuần sau ghép (D) Tám tuần sau ghép Kết

ghép cho thấy an toàn, hiệu quả Keo giữ mảnh ghép tốt, không gây viêm, không gây dị ứng, giúp nâng cao hiệu quả điều trị trên những bệnh nhân bị mông thịt ở mắt

KẾT LUẬN

Keo fibrin đã được nghiên cứu và ứng dụng

từ rất sớm tuy nhiên cho đến nay ở nước ta chưa

được quan tâm và nghiên cứu một cách toàn

diện để có thể đưa ra các sản phẩm keo fibrin có

thể triển khai ứng dụng được trên lâm sàng và

rộng hơn là có thể phát triển thành các sản phẩm

thương mại

Nhóm nghiên cứu đã cố gắng tìm ra phương

pháp đơn giản để có thể tạo ra keo dán nhằm

đáp ứng nhu cầu điều trị của người bệnh, cụ thể

là trong trường hợp điều trị phẫu thuật mộng

thịt Keo fibrin cho thấy hiệu quả, an toàn và

giảm bớt gánh nặng chi phí điều trị cho người

bệnh nếu sử dụng các loại keo thương mại

Ngoài ra, khi sử dụng keo fibrin người bệnh hài

lòng với cảm giác dễ chịu hơn khi phải sử dụng

chỉ khâu

Nhóm nghiên cứu vẫn tiếp tục công việc để

có thể cải thiện quy trình nghiên cứu nhằm tạo

ra một quy trình chuẩn hóa để tạo ra loại keo

fibrin tự thân an toàn, hiệu quả làm keo dán mô

và đánh giá trên nhiều bệnh nhân mộng thịt hơn

để có thể đánh giá một cách toàn diện hiệu quả

của keo fibrin tự thân so với keo thương mại

cũng như so với chỉ khâu để phát triển một quy

trình điều trị thường quy trong bệnh viện để

nâng cao hiệu quả điều trị cũng như chăm lo sức

khỏe người bệnh

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Albala DM (2003), Fibrin sealants in clinical practice

Cardiovasc Surg, 11, 5-11

2 Alston SM; Solen KA, Broderick AH, et al (2007) New method

to prepare autologous fibrin glue on demand Translational

Research, 149:187-195

3 Barker TH, Fuller GM, Klinger MM, et al (2001) Modification

of fibrinogen with poly(ethylene glycol) and its effects on fibrin clot characteristics J Biomed Mater Res, 56:529-535

4 Currie LJ, Sharpe JR, Martin R (2001), The use of fibrin glue in

skin grafts and tissue-engineered skin replacements: a review,

Plast Reconstr Surg, 108, 1713-26

5 Doolittle RF, Spraggon G, and Everse SJ (1997) Evolution of vertebrate fibrin formation and the process of its dissolution

Ciba Foundation Symposium, 212: 4–17

6 Isaacson G, and Herman JH, (1996), Autologous Plasma Fibrin

Glue: Rapid Preparation, American Journal of Otolaryngology,

17(2):92-94

7 Ochsner MG (1998), Fibrin solutions to control hemorrhage in

the trauma patient J Long Term Eff Med Implants, 8, 161-73

8 Quinn JV, Ed (2005), Tissue Adhesives in Clinical Medicine, BC

Decker Inc, Hamilton, p.1

9 Radosevich M, Goubran HI, Burnouf T (1997), Fibrin sealant: scientific rationale, production methods, properties, and

current clinical use Vox Sang, 72, 133-143

10 Saxena S, Jain P, Shukla J (2003), Preparation of two component Fibrin Glue and its clinical evaluation in skin

grafts and flaps, Indian Journal Plastic Surgery, 36(1):14-17

11 Silver FH, Wang MC, Pins GD (1995) Preparation and use of

fibrin glue in surgery Biomaterials, 16:891-903

12 Staindl O (1979), Tissue adhesion with highly concentrated

human fibrinogen in otolaryngology, Ann Otol Rhinol

Laryngol, 88, 413-18

13 Suh M, Cha CI (1993) Biochemical aspects of autologous fibrin glue derived from ammonium sulfate precipitation Laryngoscope, 103:193-196

14 Wheat JC, Wolf JS, Jr (2009), Advances in bioadhesives, tissue

sealants, and hemostatic agents, Urol Clin North Am, 36,

265-75 2

Ngày phản biện nhận xét bài báo: 19/10/2015