Khảo sát đặc điểm vi học và hợp chất alkaloid của cây Tơ xanh (Cassytha filiformis L.)

Góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu Tơ xanh (Cassytha filiformis L.), chống nhầm lẫn với Tơ hồng (Cuscuta sinensis Lamk.), nghiên cứu này tiến hành khảo sát đặc điểm vi học và hóa học, đặc biệt là nhóm aporphinoid của Tơ xanh.

KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM VI HỌC VÀ HỢP CHẤT ALKALOID

CỦA CÂY TƠ XANH (CASSYTHA FILIFORMIS L.)

Bùi Thế Vinh*, Trần Công Luận**

TÓM TẮT

Mục tiêu nghiên cứu: Góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu Tơ xanh (Cassytha filiformis L.), chống nhầm lẫn

với Tơ hồng (Cuscuta sinensis Lamk.), nghiên cứu này tiến hành khảo sát đặc điểm vi học và hóa học, đặc biệt là nhóm aporphinoid của Tơ xanh

Đối tượng nghiên cứu: Cây Tơ xanh được thu hái tại tỉnh Long An, được định danh bởi phòng Tài nguyên

và Dược liệu, Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp HCM Khảo sát đặc điểm thực vật học bằng kính hiển vi; phân lập và xác định cấu trúc bằng kỹ thuật sắc ký và kỹ thuật phổ

Kết quả: Từ mẫu thực vật tươi của Tơ xanh, đã khảo sát được đặc điểm vi học, vi phẫu; qua sắc ký cột

silicagel pha thuận đã phân lập và xác định được cấu trúc của 1 aporphine alkaloid là cassythin

Kết luận: Khảo sát được đặc điểm vi học và nhóm chất alkaloid của Tơ xanh (Cassytha filiformis L.), phân

lập và xác định được cấu trúc của 1 aporphin alkaloid là cassythin

Từ khóa: Tơ xanh, aporphin alkaloid, cassythin

ABSTRACT

STUDIES ON MICROSCOPIC CHARACTERISTICS AND THE ALKALOID OF CASSYTHA

FILIFORMIS L

Bui The Vinh, Tran Cong Luan * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 20 - No 6 - 2016: 191 - 196

Objectives: This study was developed to reveal a standardization of this plant

Materials and methods: Phytology research was performed by determination the microscopic

characteristics; isolation and structural elucidation based on chromatography and spectrum technique

Results: The botany characteristics, microscopic characteristics and the strutural elucidation of one

aporphine alkaloid were reveal

Conclusions: The botany characteristics, microscopic characteristics and the strutural elucidation of one

aporphine alkaloid named cassythine

Keywords: Cassytha filiformis L., cassythine, aporphinoid alkaloid

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tơ xanh (Cassytha filiformis L.) là một cây

thuốc dân gian đã được dùng từ lâu và phổ

biến tại nhiều nước trên thế giới như ở

Indonesia và Châu Phi dùng chữa giun sán, ký

sinh trùng, Trung Quốc dùng chữa vàng da ở

trẻ em Nước ta, Tơ xanh cũng được xem như

một vị thuốc dân gian rất có ích, nước sắc Tơ

xanh dùng làm thuốc bổ, chữa thận hư, liệt

dương, mắt mờ, chân tay yếu mỏi(4,5) Tuy nhiên, cũng có những dược liệu với hình thái ngoài tương tự Tơ xanh nhưng tính vị, công dụng hoàn toàn khác hẳn Tơ xanh đó là Tơ

hồng (Cuscuta sinensis Lamk.) Với mục tiêu

góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu Tơ xanh, chống nhầm lẫn với Tơ hồng; nghiên cứu này tiến hành khảo sát đặc điểm vi học và hóa học, đặc biệt là nhóm aporphinoid của Tơ xanh



Trung tâm Sâm và Dược liệu , ** Trường Đại học Tây Đô

NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu nghiên cứu

Cây Tơ xanh (thân bán ký sinh trên cây chủ)

được thu hái tại tỉnh Long An, được định danh

bởi phòng Tài nguyên và Dược liệu, Trung tâm

Sâm và Dược liệu Tp Hồ Chí Minh

Phương pháp

Khảo sát đặc điểm thực vật học

Mô tả hình thái ngoài đặc điểm hoa, quả và

hạt trên mẫu tươi Khảo sát đặc điểm vi phẫu cắt

ngang ở thân tươi với thuốc nhuộm kép đỏ

carmin và lục iod, khảo sát đặc điểm của bột

dược liệu

Khảo sát thành phần alkaloid

Định tính nhóm alkaloid bằng phản ứng hóa

học và sắc ký lớp mỏng: Làm ẩm 10 g bột dược

liệu bằng NH4OH 10%, ngâm chiết với 100 ml

CH2Cl2 x 3 lần Gộp các dịch chiết CH2Cl2 cô

giảm áp đến cắn Hòa 1 phần cắn với lượng

H2SO4 1% vừa đủ thực hiện phản ứng định tính

với các thuốc thử alkaloid đặc trưng:

Dragendorff, Mayer, Bouchardat Phần cắn còn

lại hòa với CH2Cl2 thực hiện sắc ký lớp mỏng với

hệ pha động CH2Cl2 : MeOH : NH4OH (9 : 1 : 1

giọt), phát hiện bằng thuốc thử Dragendorff

Chiết xuất, phân lập alkaloid: 4,2 kg Bột Tơ

xanh được kiềm hóa bằng dung dịch NH4OH

15% đến pH 10 Thêm CH2Cl2 đến khi ngập

bề mặt bột Tơ xanh Ngâm trong khoảng 12

giờ, thỉnh thoảng có khuấy trộn, lọc thu dịch

chiết Kiểm tra sự hiện diện của alkaloid trong

dịch chiết bằng phương pháp sắc ký lớp

mỏng, sau đó tiến hành cô quay giảm áp thu

cao chiết, dung môi CH2Cl2 thu hồi được sử

dụng để chiết tiếp bã dược liệu Quy trình lặp

lại cho đến khi dịch chiết không còn alkaloid

Cao alkaloid tổng thu được là 380 g Dùng 10 g

cao tiến hành sắc ký qua nhiều cột silica gel

pha thuận với hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH

với độ phân cực tăng dần (100:0; 99:1; 98:2 đến

95:5) Thu nhận được 27 mg chất A kết tinh

hình kim, màu cam nhạt

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát đặc điểm thực vật học

Thân

Dài 1,5 – 2 m hay hơn, dây leo, xoắn, thân hơi có rãnh dọc, có lông nâu mịn, ít khi nhẵn Màu vàng lục đến xanh lục, tiết diện tròn, ít khi dẹp, đường kính trung bình 1,5 – 2 mm, khoảng cách giữa các lóng 7 -9 cm, các nhánh thường bên mọc thẳng góc với trục chính Không thấy nhánh cấp 2

Lá

Tiêu giảm thành vảy, vảy hình tam giác dài khoảng 1-1,5mm Nơi thân tiếp xúc với các bộ phận cây chủ hay với chính thân của nó có các giác mút hình bầu dục kích thước 1-1,5 mm

Hoa

Cụm hoa dạng gié, mọc trên nhánh bên Trục mang hoa dài 1,5-5 cm, màu xanh, có lông mịn và các nốt bì khổng, mang khoảng 8 hoa, hoa không cuống Hoa lưỡng tính, màu trắng, khi chưa nở có hình trứng cỡ 1,5-2 mm

Đài

Có 3 đài phụ, 3 lá đài màu xanh có ít lông nâu Lá đài dính ở đáy, cùng tồn tại với vành hoa đến khi ra quả Vành: Có 3 vành hoa màu trắng Đài và vành dính ở đáy Nhụy đực: xếp thành 4 luân sinh, mỗi luân sinh gồm 3 tiểu nhụy Luân sinh ngoài cùng dính vào cánh hoa, luân sinh trong cùng lép Tiểu nhụy khai bằng 2 nắp Nhụy cái: Bầu noãn thượng, một bầu nhụy, một vòi, ở chính giữa hoa

Quả

Giả quả, do đài và vành không rụng mà đồng trưởng cùng quả tạo thành bao dày, mọng, màu xanh, có chất nhầy Giả quả hình cầu, kích thước 5-8 mm, trơn nhẵn Bao lấy quả bế bên trong, hình trứng nhọn một đầu, khi chín màu nâu đen, vỏ sù sì, kích thước khoảng 3-4 mm

Hạt

Trong hạt có 2 lá mầm to, màu xanh lục nhạt, có 2 lớp vỏ, bao ngoài là lớp vỏ quả cứng

và đen nâu

Đặc điểm cây Tơ xanh qua khảo sát ở nhiều

mẫu thì có đặc tính cấu tạo chung như trên, phù

hợp với các tài tiệu đã công bố (4,5) Tuy nhiên, do

Tơ xanh là loài sống bán kí sinh, do đó có thể tùy

vào cây chủ mà đặc điểm sinh học của nó có thể

khác đi một ít về kích thước và màu sắc

Vi phẫu thân

Thân tiết diện tròn, ngoài cùng là lớp biểu bì

kích thước đều có cutin khá dày, mang nhiều

lông che chở đơn bào Mô dày phiến đều 1 – 2 lớp, vùng mô mềm vỏ đạo chiếm khoảng 4-6 lớp, trong rải rác có các hạt lục lạp Nội bì không rõ, sợi trụ bì xếp thành cụm úp trên các bó libe 1, khoảng 20-26 bó libe gỗ xếp trên một vòng, các

bó gỗ 1 nhỏ, 3-4 mạch phân hóa li tâm rõ, bên cạnh gỗ 1 quanh mô mềm tủy có các mạch gỗ hậu mộc rất to Mô mềm tủy trong cùng kích thước to, dạng gần tròn xếp chừa các đạo nhỏ

Hình 1 Dạng hoa, quả và hạt của Tơ xanh

Hình 2 Vi phẫn thân Tơ xanh

Lông che chở Biểu bì có cutin

Mô dày

Mô mềm vỏ Sợi mô cứng Libe

Mô mềm tủy

Gỗ

Hình 3 Các cấu tử của bột dược liệu (1: Lông che chở; 2: Mảnh mạch điểm; 3: Biểu bì và lỗ khí; 4: Bó sợi mô

cứng; 5: Mảnh mạch xoắn)

Bột dược liệu

Bột màu nâu xám, mùi cây cỏ đặc trưng

Trong bột tìm thấy nhiều nhất các cấu tử: Lông

che chở gập hoặc đứt gãy, mảnh biểu bì với

nhiều lỗ khí kiểu song bào xếp thành dãy, mảnh

mạch xoắn, mạch điểm, các bó sợi mô cứng, các

khối chất nhựa màu cam

Khảo sát thành phần alkaloid

Định tính alkaloid bằng phản ứng hóa học

Thuốc thử Kết quả định tính Ghi chú

Dragendorff +++ +: Phản ứng dương

tính Bouchardat +++ +++: Phản ứng

dương tính rất rõ

Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học và

sắc ký lớp mỏng cho thấy mẫu chiết có sự hiện

diện của nhóm alkaloid rất rõ Trên sắc ký đồ, có

thể thấy ít nhất 6 vết chất bắt màu dương tính

với thuốc thử Dragendorff, cho thấy trong Tơ

xanh có nhiều về hàm lượng và các loại alkaloid

Phân lập và biện giải cấu trúc của alkaloid

đã phân lập

A là chất kết tinh hình kim, màu nâu, tan tốt

trong các dung môi phân cực như methanol,

không tan trong nước Phổ UV cho 3 đỉnh hấp

thu 220 nm, 283 nm, 303 nm Phổ IR cho tín hiệu

của các nhóm chức OH (3416,63 cm-1); C=C nhân

thơm (1608,73; 1516,53; 1410,51 cm-1); C-O-C (1249,08 cm-1); O-CH2-O (1054,86; 869,21 cm-1)

Hình 4: Định tính alkaloid bằng sắc ký lớp mỏng hệ

dung môi: CHCl 3 : MeOH : NH 4 OH (9:1:0,5); mẫu: Alkaloid toàn phần; phát hiện bằng thuốc thử Dragendorff

Phổ 1H-NMR cho tín hiệu cộng hưởng ứng với sự hiện diện hai nhóm proton methoxy H

[4,06 (3H; s; 3-OMe); 3,87 (3H; s; 10-OMe)], bốn nhóm proton methylen trong đó có 1 nhóm ở vùng trường thấp [H 6,12; H 6,01

(O-CH2-O, A; O-CH2-O, B)], số nhóm còn lại ở vùng trường cao [2,96; 2,98 (H-4A; H-4B); 3,73; 3,35 (H-5A, H-5B); 3,02; 2,84 (H-7A, H-7B)], ba nhóm proton methin H [4,36 (1H;H-6a), 6,75 (1H; H-8), 7,63 (1H; H-11)]

Các dữ liệu phổ 13C-NMR, DEPT cho thấy A1

có tổng số 19 carbon cho tín hiệu phổ từ 20 ppm

đến 150 ppm Trong đó có 10 carbon bậc IV (C), 3

carbon bậc III (CH), 4 carbon bậc II (CH2) và 2

carbon bậc I (CH3) Tất cả 10 carbon bậc IV đều

dịch chuyển ở vùng trường thấp (δC từ 115 ppm

đến 150 ppm) Trong đó có 4 carbon mang dị tố

oxy (δC 145,73; 137,66; 148,48; 147,41 ppm), các

carbon còn lại đều là của nối đôi

Trong số 3 carbon bậc III có 1 carbon ở vùng

trường cao (δC 54,52 ppm; δH 4,36 ppm), 2 carbon

còn lại ở vùng trường thấp (110 – 115 ppm)

Có 4 carbon bậc II, trong đó có 1 carbon bậc

II xuất hiện vùng trường thấp [δC 102,73 ppm, δH

(6,12; 6,01) ppm] Đây là đặc trưng của nhóm

methylendioxid thường gặp trong các alkaloid

của chi Stephania Các carbon bậc II còn lại là các

carbon mang nối đơn xuất hiện ở vùng trường

cao [δC 42,55 ppm; δH (3,73; 3,31) ppm], [δC 33,67

ppm; δH(3,02; 2,84) ppm], [δC 21,47 ppm; δC (2,96;

2,98) ppm]

Trong nhóm methyl, có 2 nhóm có độ dời

hóa học đặc trưng của nhóm methoxy [δC 60,12

ppm; δH (4,06; 3H) ppm] và [δC 56,66 ppm; δH

(3,87; 3H) ppm]

Với các dữ liệu phổ NMR như trên ta có thể

dự đoán A1 là một alkaloid có một nhóm thế

methylen dioxid, hai nhóm methoxy, hai nhóm

methylen, một nhóm NH và một nhóm -OH

Tham khảo các tài liệu công bố đặc điểm phổ

NMR có thể dự đoán được A1 là khung

aporphin

Dựa vào phổ HMBC (PL 6.4.5), hai proton

của nhóm methylen dioxid (6,12 và 6,01) có

tương tác với cả hai carbon bậc IV δC (145,73 và

137,66, có thể là C-1 và C-2) Thêm vào đó proton

của nhóm methoxy δH (4,06) có xuất hiện tương

tác với cả C-1, C-2 và một carbon bậc IV (δC

140,61) do đó carbon bậc IV này có thể là C-3 hoặc C-3ª Cả hai proton methylen (δH 2,96; δH

2,96) và hai proton methylen (δH 3,73; δH 3,35) đều cho tương tác với một carbon bậc IV (δC

117,54) nên carbon bậc IV (δC 140,61) phải là vị trí C-3 và carbon bậc IV (δC 117,54) phải là vị trí C-3a Thêm vào đó hai proton methylen (δH 2,96; δH

2,96) có tương tác với C-3, một carbon bậc IV (δC

122,13) và carbon methylen (δC 42,55), nên carbon bậc IV (δC 122,13) phải là vị trí C-1b, carbon methylen (δC 42,55) là vị trí C-5 và hai proton methylen (δH 2,96; δH 2,98) gắn với carbon (δC 21,47) ở vị trí C-4 Hơn nữa H-5A, H-5B đều tương quan với C-3a, C-4 và một carbon bậc III (δC 54,52) nên carbon bậc III này phải là C-6a Dựa vào phổ COSY (PL 6.4.6), H-6a ghép cặp với hai proton methylen (δH 3,02; δH 2,84), nên hai proton này là H-7a, H-7b Hai proton H-7a, H-7b lại gắn với carbon (δC 33,67) do đó carbon này là C-7

Phổ HMBC cho thấy H-6a có tương quan với carbon bậc IV (δC 112,25) mà không tương quan với carbon bậc IV (δC 125,78) còn H-7 thì ngược lại, nên (δC 112,25) là vị trí C-1a, (δC 125,78) là vị trí C-11a Ngoài ra, H-6ª và H-7 cùng tương quan với carbon bậc IV (δC 123,23), nên (δC 123,23) là vị trí C-7a H-7a tương quan với cả hai carbon methine (δC 111,89; δC 116,16) còn proton methin (δH 6,75) thì không tương quan với carbon methin (δC 111,89), nên (δC 111,89) là vị trí C-11

và (δC 116,16) là vị trí C-8 Cả hai H-7a và H-8 đều có tương quan với carbon bậc IV (δC 148,48), nên (δC 148,48) là vị trí C-9 Còn lại là vị trí C-10 Dựa trên kết quả phổ kết hợp so sánh tài liệu tham khảo (1) (2) (3), có thể nhận định chất A là một aporphin alkaloid tên gọi là cassythin

Bảng 1 Kết quả phổ NMR của A so sánh với Cassythine

Vị trí 1 H (a) 13 C (a) HMBC COSY 1 H (b) 13 C (b)

Alkaloid A1 Cassythine [3]

Vị trí 1 H (a) 13 C (a) HMBC COSY 1 H (b) 13 C (b)

C 1b , C 3 , C 3a , C 5 H 5

2,68-2,74 m 23,9

5A 3,73 dd 42,55

C 3a , C 4 , C 6a H 4

3,39 m 43,1

6a 4,36 (dd) 54,52 C 1b , C 7 , C 7a H 7 3,87 dd 53,8

C 1b , C 6a , C 7a , C 8 , C 11a H 6a

2,78 36,5

8 6,75 116,16 C 7 , C 7a , C 9 , C 11a 6,79 s 114,2

11 7,63 111,89 C 1a , C 7a , C 9 , C 10 , C 11a 7,59 s 109,7

O-CH 2 -O A 6,12 102,73

C 1 , C 2

6,1 100,5

(a) Phổ A đo trong MeOH, 1 H-NMR 500 MHz và 13 C-NMR 125 MHz

(b) Phổ Cassythine đo trong CDCl 3 , 1 H-NMR 400,13 MHz và 13 C-NMR 100,62 MHz

KẾT LUẬN

Nghiên cứu này đã khảo sát được đặc điểm

vi học và nhóm chất alkaloid của Tơ xanh

(Cassytha filiformis L.), phân lập và xác định được

cấu trúc của 1 aporphine alkaloid là cassythin

Kết quả nghiên cứu góp phần xây dựng tiêu

chuẩn dược liệu này, đồng thời có thể dùng Cassythine làm chất chuẩn đối chiếu đánh giá chất lượng hàm lượng của dược liệu này, chống nhầm lẫn với cây Tơ hồng

TÀI LIỆU THAM KHẢO

constituents from Cassytha filiformis L Journal of Natural

products, 61(7), 863-866

Baldeyrou B, Lansiaux A, Bailly C and Quetin-Leclercq J

(2004) Alkaloid from Cassytha filiformis and Related

Aporphines: Antitrypanosomal Activity, Cytotocixicity, and

Interaction with DNA and Topoisomerases Planta Med., 70,

407-413

Liabres G, Adjakidje V and Quetin-Leclercq J(2002) Cytotoxic

Aporphine Alkaloid from cassytha filiformis Planta Med., 68,

1042-1044

Nam (tập2) NXB Khoa học kĩ thuật, 978

1236

Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/09/2016

N O

O

OMe

OH MeO

H H 5

7a 8 9 10

11 1

3

4

1b 1a

7

6a 11a

Hình 5 Công thức của cassythin