Xây dựng quy trình phát hiện đồng thời chlamydia trachomatis và neisseria gonorrhoeae bằng phương pháp multiplex real time PCR

Đối với phụ nữ đang mang thai, việc mắc bệnh có nguy cơdẫn đến viêm vùng chậu, thai chậm phát triển, chết thai, sinh non, sinh con nhẹ cân vàđặc biệt có thể gây mù lòa ở trẻ sơ sinh do C

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP HCM

ĐỖ TRUNG HẬU

Chlamydia trachomatis VÀ Neisseria gonorrhoeae BẰNG

PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX REAL-TIME PCR

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

Mã số: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 06 NĂM 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - ĐHQG Tp HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Hồ Huỳnh Thùy Dương

Cán bộ chấm nhận xét 1: TS Trần Trưng Hiếu

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS Hoàng Anh Hoàng

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 28 tháng 07 năm 2017

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 Chủ tịch hội đồng: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng

2 Thư ký hội đồng: TS Huỳnh Ngọc Oanh

3 ủy viên Phản biện 1: TS Trần Trung Hiếu

4 ủy viên Phản biện 2: TS Hoàng Anh Hoàng

5 ủy viên Hội đồng: PGS.TS Phan Ngọc Hòa

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Đỗ Trung Hậu

Ngày, tháng, năm sinh: 01/10/1985

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

I TÊN ĐỀ TÀI: Xây dựng quy trình phát hiện đồng

thời Chlamydia trachomatis và Neisseria gonorrhoeae bằng phương pháp multiplex

real-time PCR

II NHỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

Xây dựng quy trình phát hiện đồng thời Chlamydia trachomatis (CT) và Neisseria

gonorrhoeae (NG) bằng phương pháp multiplex real-time PCR với các nội dung chính

sau:

1 Thiết lập quy trình multiplex real-time PCR phát hiện CT và NG

2 Xác định các thông số kỹ thuật của phản ứng multiplex real-time PCR

3 Đánh giá hiệu quả của quy trình phát hiện CT và NG trên các mẫu lâm sàng, in NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 06/02/2017

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 18/06/2017

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS Hồ Huỳnh Thùy Dương

Tp HCM, ngày tháng năm 20

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

GS.TS Phan Thanh Sơn Nam

MSHV: 1570255Nơi sinh: TP HCM

Mã số: 60420201

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

PGS.TS Hồ Huỳnh Thùy Dương PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lòi cảm ơn chân thành đến:

Ban Giám hiệu trường Đại học Bách Khoa, Ban chủ nhiệm Khoa Kỹ Thuật HóaHọc, Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng tất cả quý thầy cô đã giảng dạy, truyền đạtnhững kiến thức quý báu cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Ban Giám Đốc Công ty TNHH Công nghệ Sinh học Khoa Thương đã tạo điều kiệncho tôi làm việc và thực hiện đề tài tại công ty

PGS.TS Hồ Huỳnh Thùy Dương, Bộ môn Di truyền - Đại học Khoa Học Tự Nhiên

TP HCM, người hướng dẫn khoa học cho tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này.ThS Nguyễn Thị Minh Tâm, các em phòng nghiên cứu, phòng Kiểm định Chấtlượng cùng toàn thể các đồng nghiệp làm việc tại công ty TNHH CNSH Khoa Thương

đã hỗ trợ và đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian qua

Những người thân yêu của tôi: Ba mẹ, Bà xã, con trai và các anh chị em tôi mếnthương nhất Cảm ơn Bà xã và con trai đã tạo động lực cho tôi hoàn thành luận vănnày

Tp Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 06 năm 2017

Đỗ Trung Hậu

Chlamydia trachomatis (CT) và Neisseria gonorrhoeae (NG) là hai tác nhân vi

khuẩn gây bệnh lây truyền qua đường tình dục phổ biến trên thế giới và thường đi kèmvới nhau Nhằm tạo ra một công cụ hỗ trợ, phát hiện nhanh và chính xác CT và NGtrong bệnh phẩm, chúng tôi xây dựng quy trình multiplex real-time PCR phát hiệnđồng thời hai tác nhân gây bệnh này Phản ứng multiplex real-time PCR được xâydựng có giới hạn phát hiện LOD50 là 4 bản sao/phản ứng, với độ đặc hiệu cao cho CT

và NG Quy trình có độ lặp lại tốt với hệ số biến thiên nội phản ứng nhỏ hơn 1% và hệ

số biến thiên liên phản ứng nhỏ hơn 2%

Chúng tôi thực hiện trên 100 mẫu dịch phết tế bào, kết quả cho thấy có 20%trường hợp nhiễm CT, 15% trường hợp nhiễm NG và 8% trường hợp đồng nhiễm CT/

NG Đồng thời quy trình của chúng tôi có kết quả đúng với kết quả giải trình tự.Nghiên cứu này là tiền đề cho sự phát triển kit phát hiện đồng thời CT và NG

Chlamydia trachomatis (CT) and Neisseria gonorrhoeae (NG) are the most

common pathogens which cause sexually ửansmitted diseases in the world In order tocreate a toolkit used for a rapid and accurate detection of CT and NG in clinicalsamples, we developed a multiplex real-time PCR test that can simultaneously detectboth pathogens The limit of detection (LOD50) of the real-time PCR was 4 copies perreaction The protocol had good repeatability, with intra-assay and interassaycoefficients of variability inferior to 1% and 2%, respectively

We tested 100 clinical samples for CT and NG The infection rates were 20 % for

NG and 15% for CT, co-infection of CT/NG accounted for 8% in total Our resultswere confirmed by Sanger sequencing The study constituted the base for furtherdevelopment of diagnostic kit simultaneously detecting CT and NG in clinicalsamples

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kếtquả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, nếu có gì sai sót tôi xin hoàn toàn chịutrách nhiệm.

Tp Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 06 năm 2017

Đỗ Trung Hậu

MỤC LỤC

TÓM TẮT ii

ABSTRACT iii

LỜI CAM ĐOAN iv

MỤC LỤC V DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TÔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về Chlamydia trachomatis (CT) và Neisseria gonorrhoeae (NG) 3

1.1.1 Giới thiệu về CT 3

1.1.2 Giới thiệu về NG 7

1.2 Một số phuơng pháp phát hiện CT và NG 11

1.2.1 Phuơng pháp nuôi cấy truyền thống 11

1.2.2 Phuơng pháp kháng thể huỳnh quang trục tiếp 12

1.2.3 Phuơng pháp miễn dịch liên kết enzyme 12

1.2.4 Phuơng pháp PCR và multiplex PCR 13

1.2.5 Phuơng pháp real-time PCR và multiplex real-time PCR 13

1.3 Một số nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam 16

1.3.1 Trên thế giới 16

1.3.2 Tại Việt Nam 17

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 19

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 19

2.2 Vật liệu 19

2.2.1 Mẩu thực nghiệm 19

2.2.2 Mồi, mẫu dò và amplicon 19

2.2.3 Hóa chất 19

2.2.4 Thiết bị và dụng cụ 20

2.3 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 20

2.4 Bố trí thí nghiệm 22

2.4.2 Xác định các thông số kỹ thuật của phản ứng multiplex real-time PCR 25

2.4.3 Đánh giá hiệu quả của quy trình phát hiện CT và NG trên các mẫu lâm sàng 26

2.5 Phuơng pháp nghiên cứu 27

2.5.1 Phuơng pháp kiểm tra mồi và mẫu dò 27

2.5.2 Thu mẫu lâm sàng 27

2.5.3 Phuơng pháp tách chiết DNA 27

2.5.4 Phuơng pháp multiplex real-time PCR phát hiện CT và NG 31

2.5.5 Xử lý số liệu 33

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 34

3.1 Kết quả thiết lập quy trình multiplex real-time PCR phát hiện CT và NG 34

3.1.1 Kết quả thiết lập phản ứng real-time PCR 34

3.1.2 Kết quả tối ưu hóa các phản ứng monoplex real-time PCR 36

3.1.3 Kết quả đánh giá tính hiệu quả và tối ưu hóa phản ứng multilex real-time PCR 45

3.1.4 Kết quả so sánh các phương pháp tách chiết DNA 47

3.2 Kết quả xác định các thông số kỹ thuật của phản ứng multiplex real-time PCR49 3.2.1 Độ nhạy phân tích 49

3.2.2 Độ đặc hiệu phân tích 51

3.2.3 Độ lặp lại 53

3.3 Ket quả đánh giá hiệu quả của quy trình phát hiện CT và NG trên các mẫu lâm sàng 55

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 58

4.1 Kết luận 58

4.2 Đề nghị 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC a

Ct: Threshold cycle (chu kỳ ngưỡng)

CV: Coeficient of variation (hệ số biến thiên)DNA: Deoxyribonucleic acid

dNTP: Deoxynucleoside triphosphate

IC: Internal control (chứng nội)

LOD: Limit of detection

LPS: Lipopolysaccharide

Md: Megadalton

MOMP: Major outer membrane protein

N/A: Not available

NCBI: National Center for Biotechnology Information

No Ct: Không có giá trị Ct

PCR: Polymerase Chain Reaction

STI: Sexually ttansmitted infection

TE: Dung dịch gồm Tris và EDTA

Tm: Melting temperature

WHO: World Health Organization

Bảng 1.1 Tỷ lệ nam nhiễm NG tại 53 nước vào năm 2014/100.000 dân 7

Bảng 1.2 Các chất phát và hấp thu huỳnh quang thường sử dụng 16

Bảng 2.1 Danh sách hóa chất sử dụng 20

Bảng 2.2 Danh sách thiết bị và dụng cụ 20

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng monoplex real-time PCR CT, NG và IC 22

Bảng 2.4 Thành phần hóa chất và phân bố trong đìa/tube tách chiết TANBead DNA AutoKit 30

Bảng 2.5 Diễn giải phân tích kết quả multiplex real-time PCR 33

Bảng 3.1 Đặc tính của các cặp mồi và mẫu dò 34

Bảng 3.2 Kết quả đánh giá hoạt động của mồi và mẫu dò CT, NG và IC 35

Bảng 3.3 Giá trị Ct của phản ứng CT, NG và IC ở các nhiệt độ lai khác nhau 37

Bảng 3.4 Giá trị Ct của phản ứng CT, NG và IC ở các nồng độ MgCl2 38

Bảng 3.5 Giá trị Ct của phản ứng CT, NG và IC ở các nồng độ mồi 39

Bảng 3.6 Giá trị Ct của phản ứng CT, NG và IC ở các nồng độ mẫu dò 40

Bảng 3.7 Giá trị Ct của phản ứng CT, NG và IC ở các nồng độ enzyme Taq DNA polymerase 42

Bảng 3.8 Hiệu quả nhân bản và ngưỡng phát hiện của phản ứng CT, NG, IC 43

Bảng 3.9 Thành phần phản ứng multiplex real-time PCR 45

Bảng 3.10 Kết quả đánh giá tính hiệu quả phản ứng multiplex real-time PCR 46

Bảng 3.11 Bảng kết quả so sánh 3 phưomg pháp tách chiết DNA 48

Bảng 3.12 Bảng thống kê hệ số tưomg quan “r” giữa 3 phưomg pháp tách chiết DNA .49

Bảng 3.13 Độ nhạy phân tích của phản ứng multiplex phát hiện CT (HEX) 50

Bảng 3.14 Độ nhạy phân tích của phản ứng multiplex phát hiện NG (FAM) 50

Bảng 3.15 Độ nhạy phân tích của phản ứng multiplex phát hiện IC (CY5) 50

Bảng 3.17 Ket quả phát hiện CT và NG bằng phưomg pháp multiplex real-time

PCRtrên 100 mẫu lâm sàng 56

DANH MỤC CÁC HÌNH • Hình 1.1 Viêm cổ tử cung ở nữ và viêm niệu đạo ở nam do CT 5

Hình 1.2 Tế bào bị nhiễm vi khuẩn CT 5

Hình 1.3 Cấu trúc plasmid LGV440 của CT ố Hình 1.4 Chu kỳ vòng đừi của vi khuẩn CT ố Hình 1.5 Viêm kết mạc ở mắt và trẻ mù mắt do NG 9

Hình 1.6 Vi khuẩn NG 10

Hình 1.7 Cấu trúc bề mặt của NG 11

Hình 1.8 Thuốc nhuộm liên kết DNA trong phản ứng real-time PCR 14

Hình 1.9 Nguyên lý hoạt động của mẫu dò TaqMan® 15

Hình 2.1 Máy real-time PCR CFX96, Stratagene Mx3005P và AriaMx 20

Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 21

Hình 2.3 Máy tách chiết bán tự động Smart LabAssist 30

Hình 2.4 Bố trí đĩa tách chiết (trái) và khay tách chiết dạng tube (phải) 31

Hình 3.1 Kết quả kiểm tra hoạt động của mồi và mẫu dò CT, NG và IC 35

Hình 3.2 Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò của phản ứng CT, NG và IC 41

Hình 3.3 Hiệu quả nhân bản và ngưỡng phát hiện của phản ứng CT 43

Hình 3.4 Hiệu quả nhân bản và ngưỡng phát hiện của phản ứng NG 44

Hình 3.5 Hiệu quả nhân bản và ngưỡng phát hiện của phản ứng IC 44

Hình 3.6 Kết quả đánh giá tính hiệu quả phản ứng multiplex real-time PCR 46

Hình 3.7 Biểu đồ đường cong chuẩn màu HEX (phải) và màu FAM (trái) 48

Hình 3.8 Biểu đồ kết quả so sánh 3 phương pháp tách chiết DNA 49

Hình 3.9 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu phân tích 51

Hình 3.10 Hệ số biến thiên nội phản ứng 53

Hình 3.11 Hệ số biến thiên liên phản ứng 54

Hình 3.12 Kết quả phát hiện CT và NG một số mẫu lâm sàng 55

MỞ ĐẦU

Chlamydia trachomatis (CT) và Neisseria gonorrhoeae (NG) là hai tác nhân vi

khuẩn gây bệnh lây truyền qua đường tình dục phổ biến trên thế giới đặc biệt là ở cácnước đang phát triển [27], [31], Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hàng năm cóthêm khoảng 131 triệu người nhiễm CT (36,7%) và 71 triệu người nhiễm NG (19,9%)trong tổng số 357 triệu người nhiễm bệnh lây truyền qua đường tình dục [59], Mộtnghiên cứu tại 5 tỉnh biên giới của Việt Nam vào năm 2003 cho thấy tỷ lệ nhiễm CT là11,9%; NG là 10,7%; đồng nhiễm CT/NG là 19,9% [57], Một nghiên cứu khác công

bố tỷ lệ nhiễm CT ở phụ nữ đến khám vô sinh tại bệnh viện Phụ sản Trung Ương năm

2012 là 25,2% [8], Tỷ lệ nhiễm CT khoảng 16,7% và NG khoảng 14,7% trong tổng số

314 nam bán dâm đồng giới tại Hà Nội năm 2014 - 2015 [9], Trong những năm gầnđây, tỷ lệ người mắc bệnh do CT và NG gây ra ngày càng tăng cao nhưng ít đượcthống kê đầy đủ và chính xác [21],

Người mắc bệnh Chlamydia do CT và bệnh lậu do NG gây ra nếu không được pháthiện và điều trị sớm sẽ dẫn đến những di chứng lâu dài ở cả nam và nữ như vô sinh,viêm hậu môn, trực tràng Đối với phụ nữ đang mang thai, việc mắc bệnh có nguy cơdẫn đến viêm vùng chậu, thai chậm phát triển, chết thai, sinh non, sinh con nhẹ cân vàđặc biệt có thể gây mù lòa ở trẻ sơ sinh do CT và NG lây truyền từ mẹ sang con [22],Mặc dù dễ điều trị nhưng bệnh lây lan rất nhanh ttong cộng đồng và gây ra nhữnghậu quả khó lường do bệnh ít có triệu chứng hoặc được phát hiện ở giai đoạn muộn.Một số phương pháp truyền thống như nuôi cấy, nhuộm, soi tươi, miễn dịch huỳnhquang thường được sử dụng để phát hiện CT và NG, tuy nhiên các phương pháp này

có độ nhạy thấp, tốn nhiều thời gian [54], [56] Chính vì vậy các phương pháp nhânbản gene (PCR, Real-time PCR) đã được sử dụng rộng rãi trong thời gian gần đây vì

có độ nhạy cao so với các phương pháp nuôi cấy định danh [17], [19] và được Trungtâm Kiểm soát và Phòng chống Dịch bệnh Hoa Kỳ (Centers for Disease Conừol andPrevention - CDC) khuyến cáo sử dụng trong các chương trình giám sát CT và NG[20]

Hiện nay, việc xây dựng phương pháp multiplex real-time PCR để chẩn đoán CT và

NG vẫn chưa phổ biến tại Việt Nam Chính vì vậy, việc xây dựng một phương phápphát hiện nhanh và chính xác CT và NG tại Việt Nam với chi phí thấp là vấn đề cấp

truyền qua đường tình dục do hai vi khuẩn này gây ra Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng

tôi thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình phát hiện đồng thời Chlamydia

trachomatis và Neisseria gonorrhoeae bằng phương pháp multiplex real-time

PCR” với các nội dung chính sau:

1 Thiết lập quy trình multiplex real-time PCR phát hiện CT và NG

2 Xác định các thông số kỹ thuật của phản ứng multiplex real-time PCR

3 Đánh giá hiệu quả của quy trình phát hiện CT và NG trên các mẫu lâm sàng

Sự thành công của đề tài sẽ là tiền đề cho sự phát triển kit chẩn đoán multiplex time PCR có khả năng phát hiện nhanh, chính xác CT và NG, tác nhân gây bệnh lantruyền qua đường tình dục Đây là cơ sở thuận lợi cho công tác nghiên cứu dịch tễ học

real-và chẩn đoán bệnh trong lĩnh vực y tế cộng đồng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về Chlamydia trachomatis (CT) và Neisseria gonorrhoeae (NG)

1.1.1 Giới thiệu về CT

1.1.1.1 Dịch tễ học bệnh Chlamydia

Theo ước tính của WHO, mỗi năm có khoảng 130,9 triệu người nhiễm CT [58], Tỷ

lệ nhiễm CT cao nhất ở thanh thiếu niên trong độ tuổi từ 15-24 [22] Hầu hết phụ nữ

và nam giới nhiễm CT đều không có triệu chứng Tỷ lệ nhiễm CT không có triệuchứng ở nữ (80%) thường cao hơn so với nam (50%) [49],

Theo báo cáo của CDC, năm 2015, tại Mỹ, có khoảng 1.526.658 trường hợp nhiễm

CT, tăng 5,9% so với năm 2014 Trong đó, tỷ lệ nhiễm CT ở nữ tăng 3,8% và ở namtăng 10,5% [21],

Tỷ lệ nhiễm CT ngày càng gia tăng nhưng chưa được thống kê đầy đủ và chính xác.Các nghiên cứu gần đây tại Ấn Độ cho thấy tỷ lệ nhiễm CT chiếm khoảng 23% tại cácphòng khám phụ khoa và chiếm 19,9% ở các bệnh nhân nhiễm trùng qua đường tìnhdục Một nghiên cứu khác ở Anh, trong vòng 20 năm qua, ước tính tỷ lệ nhiễm CT ởcác phòng khám tiết niệu là 17,3%, ở các phòng khám thai là 12,6%, tại các cơ sở pháthai là 12,3%, tại các phòng khám dành cho thanh thiếu niên chiếm 10,7% và 10% ởcác phòng khám kế hoạch hóa gia đình [41],

Tại Việt Nam, theo số liệu các địa phương báo cáo về Viện Da liễu Quốc gia, số canhiễm CT có xu hướng tăng lên do bệnh này thường diễn biến âm thầm và ít triệuchứng [10], Nghiên cứu của Lê Hồng cẩm trên 415 phụ nữ viêm cổ tử cung trong độtuổi từ 15 đến 45 trong thời gian từ 2/1998 đến 3/1999 tại huyện Hóc Môn, Thành phố

Hồ Chí Minh cho thấy tỷ lệ nhiễm CT trên đối tượng này là 18,07% [5] Nghiên cứukhác của Phạm Văn Đức và cộng sự về tỷ lệ nhiễm CT ở phụ nữ hút thai 3 tháng đầu

và các yếu tố liên quan tại khoa Kế hoạch hóa gia đình - Bệnh viện Từ Dũ từ01/08/2007 đến 30/01/2008 cho thấy trong 1003 trường hợp nghiên cứu, tỷ lệ nhiễm

CT ở phụ nữ hút thai là 9,2% với độ tuổi dưới 30 và có thu nhập trung bình [12], Theomột báo cáo đánh giá hoạt động phòng chống bệnh lây truyền qua đường tình dục năm

2014 của bệnh viện Phong - Da liễu Trung ương Quy Hòa ở 15 tỉnh khu vực miềnTrung - Tây Nguyên từ Quảng Bình đến Bình Thuận và 5 tỉnh Tây Nguyên (Kon Tum,

Gia Lai, Đắk Lắk, Đắk Nông, Lâm Đồng), tỷ lệ người mắc bệnh CT trong tổng sốngười đến khám chữa bệnh da liễu ở các phòng khám tuyến tỉnh là 288.950 ngườichiếm 0,07% [7], Việc tầm soát CT là một trong những biện pháp ngăn ngừa và điềutrị CT hiệu quả nhất.

1.1.1.2, Triệu chứng lâm sàng [2], [49]

CT có khả năng gây ra nhiều bệnh khác nhau do 15 serovars (týp huyết thanh) gâyra

Khởi đầu nhẹ: ngứa, nóng rát, chảy nước mắt

Nhiễm trùng cấp tính: viêm kết mạc thể nang, xung huyết, phù kết mạc và dẫn đếnviêm giác mạc Chu trình tái diễn với những tổn thương lặp lại, đặc biệt là ở giác mạcdẫn đến hậu quả là mù Các nghiên cứu thực nghiệm và lâm sàng cho thấy những biếnchứng thường hay gặp ở các nhiễm trùng mạn tính, đặc biệt là khi nhiễm trùng lần thứhai vì cơ thể đã được mẫn cảm do nhiễm trùng lần thứ nhất

mắt tiếp xúc với dịch đường sinh dục có vi khuẩn của mẹ

Ở nam giới: chủ yếu gây viêm niệu đạo nhưng có 40% nam giới bị nhiễm không cótriệu chứng Viêm mào tinh hoàn và viêm tuyến tiền liệt là biến chứng sau khi namgiới bị nhiễm CT, có tới 50% trường hợp viêm mào tinh hoàn dưới 35 tuổi

Ở nữ giới: Thường gặp nhất là viêm niệu đạo, âm đạo, cổ tử cung Khoảng 70%phụ nữ nhiễm trùng sinh dục không có triệu chứng, nếu không điều trị sẽ để lại dichứng nặng nề và dẫn đến viêm vùng chậu (Pelvic Infection Disease - PID), tắc vòitrứng, thai ngoài tử cung, vô sinh [2], [49], Các chương trình sàng lọc CT được chứngminh là làm giảm tỷ lệ viêm vùng chậu ở phụ nữ [49]

Hình 1.1 Viêm cổ tử cung ở nữ và viêm niệu đạo ở nam do CT [62]

reactive arthritis): ảnh hưởng đến các khớp lớn, đặc biệt là khớp chân Nam giới bị ảnhhưởng nhiều hơn nữ giới với tỷ lệ 10:1

55%, trong đó 45% là viêm kết mạc và 30% viêm phổi [2], [49],

tình dục do CT serovars Ll - L3 gây ra [2],

1.1.1.3 Đặc điểm sinh học của CT

Quan sát dưới kính hiển vi quang học, CT là vi khuẩn Gram âm có màng làlipopolysaccharide, hình cầu hoặc bầu dục, kích thước thay đổi Vi khuẩn thường thayđổi hình dạng trong chu kỳ sao chép, vỏ vi khuẩn gồm màng trong và màng ngoài,không có lớp peptidoglycan giữa các màng [3],

Hình 1.2 Tế bào bị nhiễm vi khuẩn CT [66]

1.1.1.4, Đặc điểm bộ máy di truyền CT

CT là vi khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc, bộ gene có khoảng 600 gene CT chứa 7đến 10 bản sao của plasmid trong mỗi tế bào, cryptic plasmid có kích thước khoảng7,5 kb được phát hiện trong tất cả các chủng của CT [47], [48], Cryptic plasmid

chứa 8 khung đọc mở (Open Reading Frame - ORF) mã hoá chomột số protein kháng nguyên đặc trung Mặc dù chức năngcủa 8 gene trên cryptic plasmid còn chưa xác định hoàntoàn, nhưng trình tự nucleotide và sự có mặt của plasmidtrong tế bào cho thấy nó có vai trò quan trọng đối với vikhuẩn CT [53],

Hình 1.3 Cấu trúc plasmid LGV440 của CT [40]

Chu kỳ sống của CT gồm 2 dạng: thể cơ bản (elementary body) và thể lưới(recuticulate body)

Thể cơ bản: là những tế bào tròn có kích thước khoảng 0,3 pm, nhân đậm Thể nàyxâm nhập vào các tế bào theo kiểu thực bào

Thể lưới: Sau khi xâm nhập vào tế bào CT chuyển hóa nhờ tế bào và tạo thành thểlưới (đường kính 1 pm), sinh sản theo hình thức nhân đôi Sau đó thể lưới lại chuyểnthành thể cơ bản và giải phóng khỏi tế bào [3],

s V Panmkwt:

Hình 1.4 Chu kỳ vòng đòi của vi khuẩn CT [69]

CT có kháng nguyên lipopolysaccharide chung và kháng nguyên protein vỏ riêngdựa vào đó được chia ra 15 loại týp huyết thanh khác nhau bao gồm: Týp huyết thanh

A - c, D - K và Ll - L3 Trong đó týp A, B, Ba và c gây bệnh ở mắt Týp D - K gâybệnh ở đường sinh dục và ở mắt Týp LI gây bệnh hoa liễu viêm hạch hạt [1], [2],[36],

Dị biệt kháng nguyên của CT là protein chủ yếu ở màng ngoài (major outermembrane protein - MOMP), chiếm đến 50% cấu tạo màng MOMP là một proteinxuyên màng chứa các quyết định kháng nguyên đặc hiệu loài và đặc hiệu týp Nhữnghội chứng do CT gây ra có liên hệ đặc hiệu với các týp huyết thanh khác nhau [3],

1.1.2 Giới thiệu về NG

1.1.2.1 Dịch tễ học bệnh lậu

Bệnh lậu do NG gây ra, đứng thứ hai sau bệnh Chlamydia trong các bệnh lâytruyền qua đường tình dục trên thế giới [30], [32] Theo báo cáo tại 28 quốc gia thànhviên thuộc Liên minh Châu Âu (EU) và khu vực kinh tế Châu Âu (EEU) vào năm

2013, có 52.995 trường hợp nhiễm NG được thống kê Trong đó, thanh thiếu niêntrong độ tuổi từ 15 - 24 tuổi chiếm 39% các trường hợp nhiễm NG và tỷ lệ nhiễm ởnam giới nhiều gấp 3 lần so với nữ giới [30],

Theo báo cáo khác của WHO ở 53 quốc gia vào năm 2014, tỷ lệ nhiễm NG ở nam

là 25,5/100.000 nam giới trưởng thành Tây Thái Bình Dương là nơi được báo cáo có

tỷ lệ nam nhiễm cao nhất và Đông Địa Trung Hải là nơi có tỷ lệ nam nhiễm thấp nhấtthế giới (3,2 trường hợp/100.000 nam) [58],

Bảng 1.1 Tỷ lệ nam nhiễm NG tại 53 nước vào năm 2014/100.000 dân [58]

(range)

Sourw 6ARPR (h1dha5P 170 15I /s;

Theo một báo cáo gần đây của CDC, tỷ lệ nhiễm NG tại Mỹ tăng dần qua các năm.Năm 2009, tỷ lệ nhiễm NG là 98,1/100.000 người, đến giai đoạn 2009 - 2012 tăng nhẹ

(106,7/100.000 người) và năm 2015 bắt đầu tăng nhanh (129,9/100.000 người) so vớinăm 2014 Năm 2015, có khoảng 395,216 triệu người nhiễm NG, tăng 12,8% so vớinăm 2014, trong đó, tỷ lệ nhiễm ở nam tăng 18,3% và ở nữ là 6,8% Tỷ lệ nhiễm tăngcao nhất ở miền Nam và miền Tây nước Mỹ [21],

Tại khu vực Đông Nam A nói chung và Việt Nam nói riêng, tỷ lệ bệnh lậu chưađược thống kê đầy đủ nên việc kiểm soát bệnh gặp nhiều khó khăn đặc biệt là các đốitượng có nguy cơ lây nhiễm cao Một nghiên cứu của Bùi Thị Mậu và Lê Thị KimÁnh về bệnh lây truyền qua đường tình dục ở gái mại dâm tại Trung tâm Chữa bệnh -Giáo dục - Lao động Xã hội tỉnh Hòa Bình năm 2009 cho thấy tỷ lệ gái mại dâmnhiễm lậu chiếm 24,1% trong tổng số 162 đối tượng được khảo sát với độ tuổi dưới

29, trình độ học vấn thấp và thiếu hiểu biết về bệnh lây truyền qua đường tình dục [6],Một nghiên cứu khảo sát về kiến thức, thái độ và niềm tin của học sinh từ 2 trườngdạy nghề tại Thành phố Hồ Chí Minh về các bệnh lây lan do quan hệ tình dục cho thấychỉ 55% hiểu biết về bệnh lậu [28], Tỷ lệ nhiễm lậu ở nhóm mại dâm nam cũng là mộtđiều đáng báo động Công trình nghiên cứu của Nguyễn Văn Hùng và cộng sự về tỷ lệnhiễm HIV/STI và một số yếu tố liên quan ở nhóm nam bán dâm đồng giới 16 - 29tuổi tại Hà Nội năm 2014 - 2015 cho thấy bệnh lậu chiếm khoảng 14,7% trong tổng số

314 nam bán dâm đồng giới [9],

1.1.2.2 Triệu chứng lâm sàng [1], [2], [3]

khoảng 3 - 10% nam nhiễm lậu nhưng không có triệu chứng Neu không được pháthiện và điều trị sớm sẽ dẫn đến các biến chứng như viêm ống dẫn tinh, mào tinh hoàn,tuyến tiền liệt, túi tinh

Bartholine, nhưng đa số là không có triệu chứng hoặc triệu chứng không rõ ràng.Nếu không được phát hiện và điều trị sớm sẽ dẫn đến viêm tử cung, viêm vòi trứng,đặc biệt ở phụ nữ mang thai sẽ dẫn đến vô sinh hoặc thai ngoài tử cung

c Ở trẻ sơ sinh: Lậu mắt ở trẻ sơ sinh do nhiễm NG từ mẹ Triệu chứng phổ biến

nhất là kết mạc đỏ, xuất huyết và chảy mủ kết mạc Nếu không được điều trị kịp thời

có thể dẫn đến mù lòa

Ngoài ra, bệnh lậu còn gây ra một số hệ quả thứ cấp khác như:

- Viêm họng do lậu cầu gặp ở người đồng tính ở cả hai giới hoặc khác giới doquan hệ tình dục bằng đường miệng

- Viêm trực tràng: gặp ở người đồng tính nam do quan hệ tình dục qua hậu môn.Triệu chứng này thường không điển hình

- Nhiễm lậu cầu lan tỏa (DGI): thường gặp ở những người bị lậu nhưng khôngđược điều trị dứt điểm, hầu hết xảy ra ở phụ nữ Bệnh thường có biểu hiện làviêm khớp, viêm da, viêm gan, viêm cơ tim, viêm nội tâm mạc, viêm màngnão

Hình 1.5 Viêm kết mạc ở mắt và trẻ mù mắt do NG [67]

1.1.2.3 Đặc điểm sinh học của NG

Vi khuẩn NG là những song cầu khuẩn Gram âm hình hạt cà phê, hai mặt dẹt vàonhau Kích thước tế bào khoảng 0,6 pm X 0,8 |im, khoảng cách giữa 2 cầu khuẩn bằng1/5 chiều rộng của tế bào Vi khuẩn lậu không sinh nha bào, không có lông, một sốchủng có pili [2], Màng ngoài bao gồm các protein, phospholipid vàlipopolysaccharide (LPS) Đặc tính dùng để phân biệt LPS lậu là cấu trúcoligosaccharide cơ bản phân nhánh và không có sự lặp lại của kháng nguyên o Do đó,LPS của NG được gọi là lipooligosaccharide (LOS) [45],

Trong môi trường nuôi cấy, NG có kích thước thay đổi và kiểu sắp xếp không điểnhình: có thể xếp thành đôi hoặc thành bốn Pili xếp thành từng sợi hoặc tập hợp sợi vàhầu như che phủ toàn bộ bề mặt bên ngoài tế bào vi khuẩn [2]

Hình 1.6 Vi khuẩn NG [68]

I.I.2.4 Đặc điểm bộ máy di truyền NG

Có 3 dạng plasmid trong NG:

- Loại 1: Plasmid 24,5 Md có khả năng hoạt hóa các plasmid khác

- Loại 2: Plasmid 2,6 Md chưa rõ chức năng

- Loại 3: Plasmid quy định sinh p - lactamase, đây là plasmid quy định tính khángsinh của NG Có nhiều plasmid p - lactamase trong NG gây bệnh ở các nước trênthế giới, chúng có trọng lượng phân tử thay đổi: 4,4 Md; 3,2 Md; 2,9 Md [2],

NG có cấu trúc kháng nguyên không đồng nhất và có thể thay đổi cấu trúc bề mặt

trong điều kiện in vitro Đây là tính chất được xem như nhằm tránh sự đề kháng của

ký chủ trong điều kiện in vivo [3]:

- Pili: dài khoảng vài pm, giúp vi khuẩn bám vào ký chủ tốt hơn và chống lại hiệntượng thực bào

- Protein I (Por): tạo những lỗ nhỏ ở bề mặt, qua đó một số chất dinh dưỡng vào

được bên trong tế bào vi khuẩn Mỗi chủng Gonorrhoeae có một loại protein I

khác nhau

- Protein II (Opa): gây kết dính các tế bào gonococci thành một khối và gắngonococci vào tế bào ký chủ Một chủng có từ 0 đến 3 kiểu protein II Protein IIhiện diện ở khối đục, có thể có hay không có ở khối ttong

- Protein III (Rmp): có ở tất cả gonococci, kết hợp với protein I tạo thành lỗ nhỏtrên bề mặt tế bào

- Lipopolysaccharide (LPS): có ở màng ngoài của gonococci, trọng lượng phân tử

từ 3000 - 7000 Độc tính trong nhiễm khuẩn gonococci phần lớn do LPS, có tácdụng như nội độc tố

- Protein khác: có tính kháng nguyên, nhưng vai trò gây bệnh chưa rõ [3].

1.2.1 Phương pháp nuôi cấy truyền thống

I.2.I.I Nuôi cấy CT

CT không nuôi cấy được trong môi trường nhân tạo, mà phải được nuôi trong dòng

tế bào McCoy, Hela 229 hoặc tế bào thận khỉ Thể vùi có thể được thấy sau 48 - 72giờ bằng phương pháp nhuộm Giemsa, Iodine hoặc nhuộm kháng thể gắn huỳnh

quang đặc hiệu cho kháng nguyên của Chlamydia (LPS và MOMP) Khi sử dụng các

kháng thể đặc hiệu MOMP thì sự phát hiện CT có độ đặc hiệu cao Phương pháp nuôicấy được xem là tiêu chuẩn vàng để phát hiện CT vì có độ đặc hiệu cao (100%) nhưng

có độ nhạy thấp (75 - 85%) ngay cả khi thực hiện ttong phòng thí nghiệm chuyênnghiệp [24], [29]

Độ nhạy phụ thuộc vào điều kiện thu, vận chuyển và bảo quản mẫu do đó ít được

sử dụng trong phòng thí nghiệm Phương pháp này dùng để giám sát sự nhạy cảmkháng sinh và sự thay đổi độc tính hoặc khi cần các xét nghiệm với độ đặc hiệu cao[44],

1.2.1.2, Nuôi cấy NG

Vi khuẩn NG khó nuôi cấy, rất dễ chết, chúng không thể phát triển trong môitrường thông thường mà đòi hỏi môi trường phải giàu chất dinh dưỡng như máu vàcác yếu tố dinh dưỡng khác Các môi trường thường được sử dụng là thạch chocolate

và các môi trường chọn lọc khác có chứa kháng sinh (Thayer-Martin, Martin Lewis)

để ức chế các vi khuẩn khác và nấm nhưng không ảnh hưởng đến sự phát triển của vikhuẩn NG Tế bào NG phát triển tốt khi ủ môi trường với 5 - 10% co2 ở nhiệt độ 35 -37°c trong thời gian 18-24 giờ, độ ẩm > 70% và pH = 7,3 [2], [29],

Neu NG được nuôi cấy trong môi trường nghiêm ngặt cộng với sự đảm bảo cácđiều kiện khi lấy mẫu, vận chuyển mẫu và trữ mẫu thì độ nhạy của NG là 60 - 70% và

độ đặc hiệu là 100% [17], [29],

1.2.2 Phương pháp kháng thể huỳnh quang trực tiếp

Nguyên tắc: Phương pháp kháng thể huỳnh quang trực tiếp (Dừect FluorescentAntibody test - DFA) sử dụng kháng thể đặc hiệu đánh dấu huỳnh quang để phát hiệntrực tiếp kháng nguyên đặc hiệu loài MOMP hoặc kháng nguyên nhóm LPS

Có 2 loại kháng nguyên nhưng phần lớn phương pháp này sử dụng kháng nguyênMOMP vì kháng nguyên LPS có thể phản ứng chéo với LPS của các vi khuẩn khác.Với việc sử dụng kháng nguyên MOMP thì độ nhạy và độ đặc hiệu của phương phápkháng thể huỳnh quang trực tiếp lần lượt là 80 - 90% và 98 - 99%

Phương pháp DFA không đòi hỏi điều kiện vận chuyển nghiêm ngặt, thời gian thựchiện nhanh nhưng việc đọc kết quả đòi hỏi chuyên môn cao Do đó, phương pháp nàyđược khuyến cáo sử dụng trong phòng thí nghiệm với số lượng mẫu thấp Nó đượcđánh giá là nhạy hơn so với nuôi cấy để phát hiện CT trong mẫu nội mạc tử cung [41],

1.2.3 Phương pháp miễn dịch liên kết enzyme

Nguyên tắc: Phương pháp miễn dịch liên kết enzyme (Enzyme-LinkedImmunosorbant Assay - ELISA) dựa trên sự kết hợp giữa một kháng nguyên với mộtkháng thể đặc hiệu Kết quả phản ứng miễn dịch được phát hiện bằng cách sử dụngnhững kháng thể cộng hợp với enzyme Phức hợp kháng nguyên - kháng thể hoạt hóaenzyme, chuyển cơ chất không màu thành sản phẩm có màu, thông qua cường độ màu

có thể phát hiện và định lượng nồng độ kháng nguyên hay kháng thể có trong mẫu.Hiện nay, phương pháp ELISA được quan tâm nhiều do tính đơn giản và hiệu quả cao.Phương pháp ELISA có độ nhạy khoảng 62 - 96% và độ đặc hiệu từ 86 - 99% sovới phương pháp nuôi cấy tế bào Phương pháp này phù hợp với các phòng thí nghiệmkhông thể sử dụng phương pháp nuôi cấy [41],

1.2.4 Phương pháp PCR và multiplex PCR

PCR là phản ứng tổng hợp phân tử DNA in vitro bang enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (thường là Taq polymerase) Các DNA polymerase chỉ có thể tổng hợp

được mạch DNA mới từ mạch khuôn bằng cách kéo dài một moi (primer) là một trình

tự nucleotide ngắn đã bắt cặp sẵn trên mạch khuôn Một phản ứng PCR bao gồm nhiềuchu kỳ (30 - 40 chu kỳ); mỗi chu kỳ gồm ba bước : (1) biến tính để tách rời hai mạchcủa phân tử DNA, (2) bắt cặp các mồi xuôi và ngược đặc trưng cho trình tự cần nhânbản, (3) tổng hợp mạch mới bằng cách kéo dài mồi đã bắt cặp

Multiplex PCR là phương pháp cải biên của PCR, nhiều trình tự DNA được nhânbản cùng lúc, sử dụng nhiều hơn 1 cặp mồi trong một phản ứng PCR Phương phápnày cho phép phát hiện cùng lúc nhiều tác nhân gây bệnh trong bệnh phẩm giúp rútngắn thời gian cho ra kết quả xét nghiệm Phương pháp multiplex PCR được áp dụng

đã làm tăng độ chính xác của xét nghiệm chẩn đoán CT và NG Các công trình trên thếgiới đều cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR chẩn đoán CT và NGđều trên 90% [17], [26],

1.2.5 Phương pháp real-time PCR và multiplex real-time PCR

I.2.5.I Nguyên tắc [16], [18], [25]

Real-time PCR được phát triển từ kỹ thuật PCR cổ điển dựa trên nguyên lý cơ bản

là sự nhân bản số lượng DNA mục tiêu được đưa vào phản ứng Nhưng realtime PCRkhác PCR cổ điển là real-time PCR kiểm soát được tín hiệu huỳnh quang phát ra tạimỗi chu kỳ ttong suốt quá trình xảy ra phản ứng Mỗi tín hiệu huỳnh

quang phát ra tương ứng với một trình tự mục tiêu đượcnhân bản thành công Những hóa chất phát huỳnh quang baogồm thuốc nhuộm liên kết DNA (Evagreen, SYBR Green I,SYBR Green II) và một đoạn DNA mạch đơn đặc hiệu cho vùnggene mục tiêu được gắn chất huỳnh quang gọi là mẫu dò(mẫu dò TaqMan®, molecular beacon, mẫu dò Eclipse, ).Multiplex real-time PCR dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật real-time PCR nhưngtrong một ống phản ứng đơn có thể nhân bản đồng thời nhiều trình tự mục tiêu khi sửdụng nhiều hơn một cặp mồi và các mẫu dò khác nhau.

Hiện nay, mẫu dò TaqMan® và thuốc nhuộm liên kết Evagreen, SYBR Green được

sử dụng phổ biến nhất Mỗi loại đều có những ưu điểm và mặt hạn chế của chúng nó

1.2.5.2 Các hóa chất phát huỳnh quang thường được sử dụng [16], [18]

a Thuốc nhuộm liên kết DNA được sử dụng chủ yếu là SYBR Green I và

Evagreen cho phép liên kết không đặc hiệu với DNA mạch đôi (Hình 1.8) Các chấtnày chỉ phóng thích một lượng nhỏ tín hiệu huỳnh quang khi chúng ở dạng tự do trongdung dịch, nhưng tín hiệu huỳnh quang sẽ tăng lên đến 1000 lần khi chúng liên kết vớiDNA mạch đôi Như vậy, tín hiệu huỳnh quang tổng từ phản ứng sẽ tỷ lệ với lượngDNA mạch đôi hiện diện và gia tăng khi trình tự mục tiêu được nhân bản

Phân tử SYBR Green I chưa gắn chèn

Phân tử SYBR Green I được gắn chèn

Hình 1.8 Thuốc nhuộm liên kết DNA trong phản ứng real-time PCR [65]

(chỉ cần 2 mồi, không cần thiết kế mẫu dò), chi phí ban đầu thấp Tuy nhiên trở ngại lớnnhất của thuốc nhuộm liên kết DNA là chúng không đặc hiệu, nghĩa là chúng liên kếtvới bất kỳ DNA mạch đôi nào do đó phải thực hiện phân tích melting-curve (đườngcong nóng chảy) để kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng nhân bản Kết quả là sự hiệndiện của các sản phẩm không đặc hiệu trong phản ứng realtime PCR có thể làm tănglượng tín hiệu huỳnh quang tổng và ảnh hưởng đến tính chính xác của kết quả địnhlượng.

b Hóa chất phát huỳnh quang dựa trên mẫu dò được sử dụng phổ biến hiện nay

là mẫu dò TaqMan® Đó là một đoạn DNA mạch đơn đặc hiệu cho vùng gene mục tiêucùng với phân tử phát huỳnh quang (reporter) và phân tử “dập tắt” huỳnh quang(quencher) được gắn cộng hóa trị ở hai đầu Khi mẫu dò vẫn còn nguyên vẹn, tín hiệuhuỳnh quang phát ra bởi reporter sẽ bị quencher dập tắt Khi phản ứng PCR xảy ra, mẫu

dò bắt cặp với vùng gene mục tiêu nằm giữa 2 mồi và bị phân cắt bởi hoạt tính 5’ - 3’

exonuclease của Taq DNA polymerase Lúc này, phân tử reporter và quencher được

tách nhau ra và tín hiệu huỳnh quang thu được từ reporter trở nên mạnh hơn Sự giatăng tín hiệu này mạnh hơn sau mỗi chu kỳ và tương ứng với lượng sản phẩm PCRđược tạo ra

Hình 1.9 Nguyên lý hoạt động của mẫu dò TaqMan® [64]

ưu điểm chính của mẫu dò TaqMan® là độ đặc hiệu cao và cho phép thực hiện cácphản ứng multiplex Tuy nhiên giá thành đắt và việc thiết kế phản ứng phức tạp hơn

hấp thu huỳnh quang.

Bảng 1.2 Các chất phát và hấp thu huỳnh quang thường sử dụng

Tên reporter Bước sóng kích

TEXAS RED 590 610 BHQ2, BHQ3, DABCYL

1.3 Một số nghiên cứu trên thế giói và tại Việt Nam

Đen năm 2015, nghiên cứu của Tayoun và cộng sự sử dụng phương pháp multiplex

PCR và Melt Curve Analysis để phát hiện đồng thời CT, NG, Trichomonas vaginalis

(TV) và chứng nội (Internal Conttol) được bổ sung vào trong quá trình tách chiết DNA

để kiểm soát quá trình tách chiết DNA và PCR Kết quả phương pháp chẩn đoán nàytiết kiệm được chi phí, có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, dễ dàng phát hiện sự đồng nhiễmcủa CT, NG, TV và có thể sử dụng nhiều loại mẫu khác nhau: nước tiểu, dịch phết âmđạo [56],

Tiếp theo đó cũng vào năm 2015, công trình nghiên cứu của Rumyantseva và cộng

sự đánh giá phương pháp multiplex real-time PCR (AmpliSens) phát hiện đồng thời 4

mục tiêu CT, NG, TV và Mycoplasma geneitalium (MG) Phương pháp còn phát hiện

thêm trình tự DNA chứng nội Kết quả cho thấy phương pháp có độ nhạy và độ đặchiệu cao với tỷ lệ nhiễm CT, NG, TV, MG lần lượt là 6,3%; 0,3%; 0,08% và 5,7% [51],

giá kit PelvoCheck CT/NG bằng phương pháp PCR để phát hiện CT và NG, kit sử dụng

gene ADAT1 được bổ sung vào master mix làm chứng nội kiểm soát quá trình nhân bản

cùng với DNA CT/NG [43] Cũng trong năm 2016, nghiên cứu của Jaureguy và cộng sự

sử dụng phương pháp real-time PCR để xác định tỷ lệ nhiễm CT và NG ở những cánhân bị tấn công tình dục ở Paris, Pháp Kết quả phát hiện 15% nhiễm CT, 5% nhiễm

NG và 3% đồng nhiễm cả hai loại vi khuẩn trên [38],

1.3.2 Tại Việt Nam

Ở Việt Nam, các nghiên cứu đã công bố về xây dựng các phương pháp phát hiện CT

và NG có phần hạn chế hơn so với thế giới

Năm 2007, Võ Hồ Hồng Hải đã xây dựng và chuẩn hóa quy trình phát hiện đồng thời

CT và NG sử dụng kỹ thuật PCR-ELISA và chứng nội Kết quả phát hiện 6% nhiễm

CT, 2% nhiễm NG trong 100 mẫu dịch phết cổ tử cung [14],

Vào năm 2011, Trần Đăng Thắng và cộng sự đã xây dựng thành công quy trìnhmultiplex PCR phát hiện đồng thời hai tác nhân gây bệnh HPV và NG Kết quả chothấy 2 trường hợp dương tính với NG chiếm 6% trong 30 mẫu thu thập từ bệnh nhân và

1 trường hợp đồng nhiễm với HPV [13]

Như vậy, các công trình nghiên cứu về phương pháp phát hiện CT và NG đã đượcthực hiện rộng rãi trên thế giới dưới nhiều hình thức khác nhau Tuy nhiên, ở Việt Namcác công trình nghiên cứu đã được công bố sử dụng phương pháp multiplex real-timePCR phát hiện CT và NG chưa phổ biến Phương pháp real-time PCR có nhiều ưu điểmhơn so với PCR truyền thống là nó cho phép xác định số lượng bản sao khuôn mẫu banđầu với sự chính xác và độ nhạy cao, kết quả real-time được đánh giá không cần phảiđiện di trên gel agarose, giúp tiết kiệm thời gian Đồng thời, việc tiến hành phản ứng vàđánh giá kết quả trong một hệ thống ống đóng kín giúp làm giảm nguy cơ ngoại nhiễm

và loại bỏ những thao tác sau phản ứng nhân bản

Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng mẫu dò TaqMan® và mồi nhân bản vùng geneđặc trưng của CT và NG Ngoài ra, trong hỗn hợp phản ứng real-time PCR còn chứa

một cặp mồi nhân bản một đoạn gene ALAS1 của người làm chứng nội nội sinh Khác

với một số công trình công bố gần đây đã sử dụng chứng nội ngoại sinh, đoạn gene này

chất ức chế có trong mẫu và kiểm soát hiệu quả của quá trình tách chiết DNA cũng nhưphản ứng PCR [38], [51], [56],

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại Công ty TNHH Công nghệ Sinh học Khoa Thương

Thời gian thực hiện đề tài: 16/01/2017 - 18/06/2017

2.2 Vật liệu

2.2.1 Mẩu thực nghiêm

Mau DNA và mẫu lâm sàng được thu tại một bệnh viện có chuyên khoa da liễu ở

Hà Nội được chỉ định xét nghiệm CT và NG từ tháng 01/2017 đến 04/2017

Mau DNA các vi sinh vật khác được lưu trữ tại phòng Kiểm định Chất lượng công ty TNHH Công nghệ Sinh học Khoa Thương

-2.2.2 Mồi, mẫu dò và amplicon

Cặp mồi, mẫu dò CT và NG sử dụng trong nghiên cứu được tham khảo từ các côngtrình nghiên cứu đã công bố [54], [37], Trình tự mồi và mẫu dò bắt cặp trên đoạn gene

ALAS1 của người dùng làm chứng nội (IC) từ một công trình nghiên cứu khác trong

nhóm nghiên cứu của chúng tôi tại công ty TNHH Công nghệ Sinh học Khoa Thương.Các trình tự amplicon được xác định bằng phần mềm Annhyb dựa trên các cặp mồi[54], [37] và các trình tự được công bố trên ngân hàng gene (NCBI), trong đó:

- Amplicon CT: mang vùng trình tự dài 71 bp nằm trên cryptic plasmid của CT

- Amplicon NG: mang vùng trình tự dài 90 bp nằm trên vùng gene opa của NG.

- Amplicon IC: mang vùng trình tự dài 144 bp nằm trên vùng gene ALAS1 ở

người

Các cặp mồi, mẫu dò và amplicon được tổng hợp bởi công ty Integrated DNATechnologies - IDT (Mỹ)

2.2.3 Hóa chất

Bảng 2.1 Danh sách hóa chất sử dụng

Hóa chất dùng tách chiết DNA

Kit tách chiết DNA tủa: AccuRive

Kit tách chiết DNA sử dụng cột

silica: AccuRive sDNA Prep kit Khoa Thương Biotech Việt Nam

Kit tách chiết DNA bán tự động:

TANBead DNA Auto Kit

Taiwan Advanced

Hóa chất dùng trong phản ứng real-time PCR

2.2.4 Thiết bị và dụng cụ

Bảng 2.2 Danh sách thiết bị và dụng cụ Tên thiết bị và dụng cụ Hãng sản xuất Xuất xứ

Hệ thống real-time PCR

Máy tách chiết DNA tự động

Smart LabAssist Taiwan Advanced Nanotech Inc Đức

Hình 2.1 Máy real-time PCR CFX96, stratagene Mx3005P và AriaMx

2.3 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Mục tiêu của đề tài là xây dựng quy trình

multiplex real-time PCR phát hiện đồng thời CT

và NG Trước tiên, chúng tôi thiết lập phản ứng

real-time PCR và sử dụng amplicon nhân tạo để

tối ưu hóa các phản ứng monoplex, từ các thành phần được tối ưu tiến hành thiết lập,

time PCR.

1 - Thiết lập, đánh giá tính hiệu quả và tối ưu hóa phán ứng multiplex.

- So sánh các phương pháp tách chiết DNA: tủa, cột silica và bán tự động.

- Độ nhạy phân tích

- Độ đặc hiệu phân tích

- Độ lặp lại

Đánh giá hiệu quả của quy trình phát

hiện CT và NG trên các mẫu lâm sàng

h ĩ _- _/

- Tách chiết DNA 100 mẫu dịch phết tế bào.

* J - Phát hiện CT và NG bằng phương

pháp multiplex real-time PCR, giải trình

tự một số mẫu kiểm tra độ đúng của quy trình.

phản ứng multiplex, tiếp tục so sánh các phương pháp tách chiết DNA từ mẫu dịchphết tế bào để chọn phương pháp tách chiết đạt hiệu quả cao Nhằm hướng tới việcphát triển kít trong tương lai, chúng tôi xác định các thông số kỹ thuật của phản ứngmultiplex real-time PCR và áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện CT và NG trêncác mẫu lâm sàng Công trình nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ sau: