Lá cẩm chướng in vitro được cắt thành các mảnh kích thước 0,5 0,5cm và đặt trên môi trường tái sinh có TDZ 1,0 mg/l và NAA 0,1 mg/l, thời gian 5 ngày. Tiếp theo nuôi chung các mẫu mô lá với vi khuẩn chủng Agrobacterium tumefaciens LBA4404 chứa plasmid pVDH1396: promoter SAG12 mang gen ipt tạo enzyme isopentenyl transferase liên quan đến sinh tổng hợp cytokinin, gen hpt kháng hygromycin và gen gusA. Sau 5 ngày nuôi chung, mảnh lá được rửa sạch vi khuẩn và cấy truyền sang môi trường như trên có bổ sung cefotaxime 500 mg/l và hygromycin 5 mg/l để chọn lọc cá thể chuyển gen, qua 3 chu kỳ chọn lọc chúng tôi chọn được một số dòng cây chuyển gen. Các dòng chuyển gen được tách và cấy truyền qua môi trường MS có bổ sung IBA 0,5 mg/l và hygromycin 10 mg/l. Một số ít dòng chuyển gen giả định được kiểm tra mô hoá tế bào GUS cũng cho kết quả dương tính. Sự hiện hiện của gen ipt, hpt và gusA được xác định bằng phương pháp PCR, sự hiện diện của các băng DNA mong đợi tương ứng 615 bp; 508 bp; 365bp. Các dòng chuyển gen được lưu giữ cho thí nghiệm tiếp theo để xác định gen chuyển bền vững trong bộ gen cây hoa cẩm chướng bằng phương pháp Southern blot.
Trang 1NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN IPT TẠO CYTOKININ NHẰM LÀM TĂNG
TUỔI THỌ HOA CẨM CHƯỚNG (Dianthus caryophyllus L.)
NHỜ VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens
Nguyễn Thị Thanh 1*, Lê Thị Phương Quyên 2 , Nguyễn Phương Thảo 2
(1*)
Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, thanh.nguyen.itb@gmail.com
2 Trường đại học Quốc tế, ĐHQG thành phố Hồ Chí Minh
TÓM TẮT: Lá cẩm chướng in vitro được cắt thành các mảnh kích thước 0,5 0,5cm và đặt trên môi
trường tái sinh có TDZ 1,0 mg/l và NAA 0,1 mg/l, thời gian 5 ngày Tiếp theo nuôi chung các mẫu mô lá
với vi khuẩn chủng Agrobacterium tumefaciens LBA4404 chứa plasmid pVDH1396: promoter SAG12
mang gen ipt tạo enzyme isopentenyl transferase liên quan đến sinh tổng hợp cytokinin, gen hpt kháng hygromycin và gen gusA Sau 5 ngày nuôi chung, mảnh lá được rửa sạch vi khuẩn và cấy truyền sang môi
trường như trên có bổ sung cefotaxime 500 mg/l và hygromycin 5 mg/l để chọn lọc cá thể chuyển gen, qua
3 chu kỳ chọn lọc chúng tôi chọn được một số dòng cây chuyển gen Các dòng chuyển gen được tách và cấy truyền qua môi trường MS có bổ sung IBA 0,5 mg/l và hygromycin 10 mg/l Một số ít dòng chuyển
gen giả định được kiểm tra mô hoá tế bào GUS cũng cho kết quả dương tính Sự hiện hiện của gen ipt, hpt
và gusA được xác định bằng phương pháp PCR, sự hiện diện của các băng DNA mong đợi tương ứng 615
bp; 508 bp; 365bp Các dòng chuyển gen được lưu giữ cho thí nghiệm tiếp theo để xác định gen chuyển bền vững trong bộ gen cây hoa cẩm chướng bằng phương pháp Southern blot
Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, Dianthus caryophyllu, hoa cẩm chướng, gen hpt, gen ipt, gen gusA,
GUS, PCR, promoter SAG12, TDZ
MỞ ĐẦU
Hoa cẩm chướng (Dianthus caryophyllus
L.) thuộc họ Cẩm chướng (Caryophyllaceae), có
nguồn gốc từ châu Âu Hoa cẩm chướng có
nhiều màu sắc đa dạng, hình dạng phong phú,
nhiều chủng loại, màu sắc và mùi hương hấp
dẫn Với những ưu điểm trên, cẩm chướng đã
trở thành một trong bốn loại hoa cắt cành phổ
biến trên thế giới, chiếm 17% sản lượng hoa cắt
cành Italia là nước có diện tích trồng hoa cẩm
chướng lớn nhất thế giới với sản lượng 2.500
triệu cành vào năm 1995, Hà Lan đứng thứ hai
với sản lượng 1.800 triệu cành, Ba Lan đứng
thứ ba với sản lượng 400 triệu cành Colombia
được xem là thiên đường hoa cẩm chướng với
chất lượng hoa tốt nhất thế giới Các nước khác
cũng sản xuất hoa cẩm chướng với số lượng
đáng kể, đó là Israel, Trung Quốc [24]
Hiện nay, cẩm chướng được trồng làm hoa
cảnh trong nước và xuất khẩu có khoảng trên 20
giống, chủ yếu được trồng nhiếu ở Đà Lạt
Hàng năm, Đà Lạt cung cấp khoảng 0,5 triệu
cành cẩm chướng các loại và xuất khẩu qua các
nước: Nhật Bản, Trung Quốc, Ôxtrâylia, Đài
Loan, Pháp, Đức, Nga [23]
Trên thế giới cũng như Việt Nam, ngoài nhân giống cẩm chướng phục vụ sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô, việc nghiên cứu tạo
ra giống mới như giống kháng nấm, virus có hoa màu sắc mới lạ, tươi lâu là vấn đề đang được quan tâm Nghiên cứu tạo giống mới bằng công nghệ gen đã và đang được thực hiện và đã
có khá nhiều công trình công bố kết quả nghiên cứu trên thế giới về chuyển một số gen có ý nghĩa khoa học và thực tiễn trên đối tượng cây
cẩm chướng như gen ACC, bar, gusA, nptII,
LEACO1, PttKN1, rolC, [1, 2, 3, 6, 7, 13, 22]
Trong các chất điều hoà sinh trưởng như auxin, cytokinin, gibberellin, acid abscisic và ethylen có vai trò nhất định trong điều hoà sự lão hoá Trong đó, cytokinin đóng vai trò quan trọng trong hạn chế quá trình lão hóa Trong nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật, cytokinin có vai trò rõ rệt trong quá trình giữ cho mô lá tách rời chậm thoái hoá diệp lục tố, được xanh tươi lâu Ví dụ, như cytokinin liên quan mật thiết đến sự tươi lâu của rau vừa thu hoạch và kéo dài tuổi thọ của hoa cắt cành, mang ý nghĩa kinh tế rất cao Các nghiên cứu đã được công bố trên thế giới của các nhà khoa học
về nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme
Trang 2isopentenyl transferase (ipt) tạo sinh tổng hợp
cytokinin isopentenyl adenin, zeatin và
dihydrozeatin vào cây trồng với mục đích làm
mô tế bào của cây tự sản xuất cytokinin: cây
hoa giả yên (Petunia), cải bông, hoa cúc, hoa
hướng dương, cây rau cải xà lách, khoai tây,
thuốc lá [4, 9, 10, 14, 15, 16, 17, 20] Tác
dụng của cytokinin nội sinh còn làm tăng hoạt
chất artemisinin của cây thanh hao chuyển nạp
gen ipt lên 70% so với cây đối chứng không
chuyển gen [8] Ngoài ra, các nghiên cứu
chuyển nạp gen ipt tạo cây chuyển gen có khả
năng chống lại được những điều kiện bất lợi của
thời tiết như khô hạn, như trường hợp của cây
thuốc lá [18, 21] Kế thừa những nghiên cứu
trên thế giới chuyển gen ipt vào thực vật, chúng
tôi nghiên cứu chuyển gen ipt vào cây hoa cẩm
chướng với hy vọng biểu hiện của gen chuyển
sẽ có tác dụng làm tăng tuổi thọ của hoa và lá
của giống cẩm chướng
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Tạo nguyên liệu nuôi cấy in vitro
Hạt giống cẩm chướng CCF của công ty
Trang Nông (tp Hồ Chí Minh) được khử trùng
với cồn 70% trong 1 phút, sau đó với sodium
hypochloride 30% [5,0 g/l (w/v), Công ty CP
hóa mỹ phẩm Mỹ Hảo, tp Hồ Chí Minh] trong
10 phút và rửa sạch bằng nước cất vô trùng
Sau cùng, các hạt đã khử trùng được gieo trên
môi trường 1/2 MS, để trong tối khoảng 1 tuần,
ở nhiệt độ 27-28 oC Khi hạt bắt đầu nảy mầm,
cây con được cấy chuyển 1 tháng một lần trên môi trường MS không chất điều hoà sinh trưởng (ĐHST)
Môi trường và điều kiện nuôi cấy mô
Môi trường 1, môi trường nuôi và nhân giống cẩm chướng MS (Murashige-Skoog, 1962), vitamin B5 (Gamborg B5 vitamin) [MSB5] không chất (ĐHST);
Môi trường 2, môi trường tái sinh MSB5 có TDZ 1 mg/l + NAA 0,1 mg/l (v/v);
Môi trường 3, môi trường tạo sự vươn chồi
và ra rễ MSB5 + IBA 0,5 mg/l
Điều kiện nuôi cấy với 9 giờ chiếu sáng/ngày, nhiệt độ 25-27oC
Chủng vi khuẩn, môi trường và điều kiện nuôi cấy
Sử dụng dòng vi khuẩn Agrobacterium
pVDH1396 (kích thước 15,9 kb) mang các gen
ipt tạo enzyme isopentenyl transferase dưới sự
điều khiển của promoter SAG12 (senescence
associated gene 12, từ Arabidopsis thaliana), gen gusA (có intron, promoter CaMV 35S), gen kháng hygromycin hpt dưới sự điều khiển của
promoter CaMV35S (hình 1) do chúng tôi thiết
kế Môi trường nhân và giữ chủng vi khuẩn là môi trường LB có bổ sung 50 mg/l kanamycin Nhân giống vi khuẩn sử dụng cho nghiên cứu chuyển gen, được nuôi lắc 200 vòng/phút qua đêm trong môi trường LB lỏng có bổ sung kanamycin 50 mg/l, ở nhiệt độ 28oC
Hình 1 Sơ đồ plasmid VDH1396 kích thước 15,890 kb
RB và LB bờ phải và bờ trái; hpt gen chọn lọc kháng hygromycin (Tnos/hpt/p35S);
ipt gen ipt (pSAG12/ipt/Tnos) và gen gusA (T35S/gus/p35S)
Chuyển gen vào cây cẩm chướng nhờ khuẩn
Agrobacterium tumefaciens
Lá khoảng 4-6 tuần tuổi được cắt thành
những mảnh có kích thước khoảng 0,5 05 cm
được sử dụng làm vật liệu chuyển nạp gen Các bước thí nghiệm được tiến hành như sau: 1 Nuôi cấy các mẫu mô lá trên môi trường số 2 trong thời gian 5 ngày; 2 Gây nhiễm các mẫu
mô lá với vi khuẩn tỉ lệ 1:10 (v/v) trong vòng 30
Trang 3phút; 3 Vớt mẫu ra, thấm bớt dịch vi khuẩn
thừa bằng giấy lọc vô trùng; 4 Nuôi chung các
mô lá với vi khuẩn trong 2-3 ngày Sử dụng môi
trường số 2 lỏng có bổ sung acetosyringone 100
µM Sau 3 ngày nuôi cấy chung, rửa sạch vi
khuẩn bằng nước cất có bổ sung dung dịch
cefotaxime 500 mg/l, lắc nhẹ Vớt mẫu ra, thấm
khô nước và cấy các mẫu mô lá trên môi trường
chọn lọc (số 2) có bổ sung hygromycin 4 mg/l,
cefotaxime 500 mg/l Sau 3 tuần, chuyển qua
môi trường chọn lọc có bổ sung hygromycin
5-10 mg/l, cefotaxime 500 mg/l Tiếp tục chu kỳ 3
tăng nồng độ hygromyicn từ 5-10 mg/l, tiếp tục
chọn lọc thêm 2 chu kỳ (3 tuần/chu kỳ) Cấy
truyền các mẫu mô kháng hygromycin qua môi
trường số 2 chứa hygromycin 10 mg/l, đến khi
vươn chồi, thời gian khoảng 2 tháng
Kiểm tra phát triển cá thể chuyển gen trên
môi trường có hygromycin
Tách các dòng cây chuyển gen kháng
hygromycin và cấy chuyển qua môi trường số 3
có bổ sung hygromycin 10 mg/l, theo dõi sự
sinh trưởng của cây
Thử GUS [20]: Ngâm mẫu mô vào dung dịch
thuốc thử GUS, hút thấm chân không, ở 37oC
trong 16 giờ
Phân tích PCR
Tách chiết và tinh sạch DNA dòng cẩm
chướng không chuyển gen và các dòng chuyển
gen bằng DNesasy plant Mini kit (QIAGEN,
Đức) Kiểm tra sự có mặt của các gen ipt hpt,
gusA trong các dòng cẩm chướng chuyển gen
giả định bằng các cặp mồi đặc hiệu của gen như
sau: hpt-1: 5’-AGCTGCGCCGATGGTTT
CTACAA-3’ hpt-2: 5’-ATCGCCTCGCTCCA
GTCAATG-3’ Sản phẩm PCR được khuếch đại
có kích thước đoạn DNA 508 bp;
TG-3’ Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn DNA
có kích thước 365 bp; ipt-1: 5’-TCGGTCCAAC
TTGCACAGGAA-3’ và ipt-2: 5’-TACTCCTG
AGCGATCCCAT-3’ Sản phẩm PCR khuếch
đại đoạn DNA có kích thước 615 bp Chương
trình luân nhiệt: 95 oC: 2 phút; 30 chu kỳ (95oC:
1 phút, 52 -55oC: 1 phút, 72oC: 2 phút) 72 oC: 5
phút, sau cùng bảo quản sản phẩm PCR ở 4oC
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Nghiên cứu tính chống chịu tự nhiên của mô
lá đối với kháng sinh hygromycin
Kết quả nghiên cứu tính chống chịu tự nhiên của mẫu mô lá giống cẩm chướng CCF có khả năng kháng hygromycin tự nhiên 4 mg/l Vì vậy, chúng tôi sử dụng nồng độ hygromycin chọn lọc các dòng chuyển nạp gen, nồng độ từ thấp lên cao từ 5-10 mg/l (đối chứng hygromycin 4 mg/l, gây chết mẫu mô lá sau 3 tuần nuôi cấy) Ở thí nghiệm của chúng tôi, nếu chọn ngay lúc đầu nồng độ hygromycin 10 mg/l thì không thu nhận được kết quả
Giai đoạn nuôi chung mẫu mô lá với
vi khuẩn
Nhiều nghiên cứu công bố trên thế giới đã dùng phương pháp chuyển nạp gen vào cây trồng, thời gian nuôi cấy chung khoảng 2-3 ngày [8, 10, 15] Nhưng ở đối tượng cẩm chướng, thời gian nuôi chung với vi khuẩn sau 2-3 ngày nuôi cấy mọc rất yếu [3, 5] Vì vậy, chúng tôi đã tăng thời gian nuôi ủ chung với vi khuẩn lên 5 ngày Có nhiều khả năng, trong quá trình nuôi cấy chung với vi khuẩn một số giống cẩm chướng tiết ra phenol gây cản trở sự phát triển của vi khuẩn Chính vì lý do này, thí nghiệm của chúng tôi nuôi chung mẫu mô lá với vi khuẩn tốt nhất thời gian là 5 ngày và nồng độ kháng sinh hygromycin bước đầu cho chọn lọc các các thể chuyển nạp gen giả định là
5 mg/l
Chọn lọc cá thể chuyển nạp gen
Sau giai đoạn nuôi chung với vi khuẩn, nếu cấy chuyển các mẫu mô trên môi trường tái sinh
có bổ sung hygromycin 10 mg/l, các mẫu mô này bị chết (số liệu chưa công bố) Vì vậy, chế
độ chọn lọc các tế bào chuyển nạp gen lần lượt
từ thấp đến cao (hygromycin 5-10 mg/l) Sau khoảng một tháng chọn lọc, có nhiều mẫu mô bị chết, và có sự hình thành một số cụm callus mới tăng sinh trên môi trường có hygromycin 5mg/l Tiếp theo, cấy chuyển callus qua môi trường có hygromycin 6-10 mg/l và tăng dần của lần chọn lọc thứ 3 là 10 mg/l (hình 2) Sau 3 chu kỳ chọn lọc triệt để, chúng tôi đã thu nhận được 5 dòng chuyển gen giả định từ 135 mẫu mô lá Tần số chuyển gen 3,7%
Trang 4Kiểm tra khả năng phát triển rễ trên môi
trường có hygromycin
Năm dòng chuyển gen giả định thu nhận
được trên môi trường chọn lọc có hygromycin
10 mg/l được cấy chuyển qua môi trường số 3
có bổ sung hygromycin 10 mg/l Kết quả các chồi phát triển và ra rễ tốt (hình 2)
Hình 2 Chọn lọc và tái sinh các dòng cẩm chướng chuyển gen
và kiểm tra tính kháng hygromycin của cá thể chuyển gen
a (DC đối chứng không chuyển gen; CG Callus phát triển trên môi trường tái sinh có hygromycin 5 mg/l); b: Callus kháng hygromycin; c Chồi phát triển trên môi trường tái sinh có hygromycin 5 mg/l; d, e cây con
chuyển gen trên môi trường 3 có hygromycin 10 mg/l; g Cẩm chướng đối chứng không được chuyển gen
Thử GUS: Lấy ngẫu nhiên 3 dòng cẩm chướng
chuyển gen giả định (T1; T3 và
CCF-T5) thử với X-GUC Kết quả, hầu hết các mô của
cẩm chướng kháng hygromycin đều có kết quả
dương tính với thuốc thử GUS (hình 3d)
Phân tích PCR các gen ipt, hpt và gen gusA
Các dòng cẩm chướng kháng hygromycin sinh
trưởng bình thường trên môi trường có
hygromycin 10 mg/l được tách chiết DNA và
kiểm tra PCR Kết quả PCR cho thấy, các gen
ipt, hpt và gen gusA với các cặp mồi đặc hiệu
cho thấy sự hiện diện của các băng DNA được
khuếch đại tương ứng là 615 bp, 508 bp và 365
bp (hình 3a, 3b, 3c)
KẾT LUẬN
Nghiên cứu chuyển nạp gen vào mẫu mô lá
cẩm chướng bằng phương pháp gián tiếp nhờ vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 chứa plasmid pVDH1396 mang gen, hpt, ipt và gen gusA, chúng tôi đã nhận được một số dòng
cây chuyển nạp gen Qua phân tích các dòng
cây này sinh trưởng in vitro bình thường trên
môi trường có hygromycin 10mg/l, nhuộm xanh
với thuốc thử GUS Phân tích PCR các gen hpt,
ipt và gen gusA đã cho thấy, các băng DNA
dương tính lần lượt 508 bp, 615 bp và 365 bp Các dòng chuyển nạp gen này tiếp tục được giữ giống để phục vụ các bước nghiên cứu tiếp theo, như phân tích sự có mặt của gen chuyển trong bộ gen cây hoa cẩm chướng bằng kỹ thuật Southern bot và trồng thử nghiệm trong nhà lưới, theo dõi và đánh giá khả năng tăng tuổi thọ của hoa và lá các dòng đã được chuyển gen
Trang 5Hình 3 Phân tích PCR và thử GUS các dòng cẩm chướng
chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
(a) gen ipt dương tính với băng DNA 615 bp; M Thang chuẩn 1,0 kb (BioLabs, Mỹ); 1 Đối chứng âm (cây
không chuyển gen); 2 Đối chứng dương (plasmid); 7 Đối chứng dương tính dòng phong lan chuyển gen ipt),
2, 3, 4, 5 và 6 Các dòng cây chuyển nạp gen
(b) gen hpt dương tính với băng DNA 508 bp; M Thang chẩn DNA 100 bp (Sigma, Mỹ); 1 Đối chứng âm
(cây không chuyển gen); 2 Đối chứng dương (plasmid); 7 Đối chứng dương tính dòng phong lan chuyển gen
hpt); 2, 3, 4, 5 và 6 Các dòng cây chuyển nạp gen
(c) gen gusA dương tính với băng DNA 365 bp; M Thang chuẩn 1 kb (BioLabs, Mỹ); 1, 2 và 3 Các dòng
cây cẩm chướng chuyển gen; 4 Đối chứng âm (cây không chuyển gen)
(d) Biểu hiện của gen gusA sau khi nhuộm với thuốc thử GUS; -ve đối chứng không chuyển nạp gen; 1, 2 và
3 các dòng cẩm chướng chuyển nạp gen
Lời cảm ơn: Các tác giả xin chân thành cảm
ơn Đại học quốc gia tp Hồ Chí Minh đã hỗ trợ
về kinh phí; Phòng Thí nghiệm trọng điểm về
Công nghệ Tế bào thực vật phía Nam, Viện
Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam đã hỗ trợ trang thiết bị cho
nghiên cứu này
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Amir Zucker A., Chang R F L., Ahroni A.,
Cheah K., Woodson W R., Bressan R A.,
Watad A A., Hasegawa P M., Vainstein
A., 2010 Transformation of carnation by
microprojectile bombardment Sci Hortic, 64:177-185
2 Amir Zucker, Ahroni A., Tzfira T., Ben-Meir H., Vainstein A 1999 Wounding by bombardment yields highly efficient
Agrobacterium - mediated transformation of
carnation (Dianthus caryophyllus L.) Mol
Breed, 5: 367-375
3 Chalermsri Nontaswatsri., Seiichi F., Masanori G 2003 Revised cocultivation
conditions produce effective Agrobacterium
- mediated genetic transformation of
Trang 6carnation (Dianthus caryophyllus L.) Plant
Sci., 166: 59-68
4 Chang H., Jones M L., Baz G M., Clarke
D G., 2003 Overproduction of cytokinin in
Petunia flowers transformed with PSAG12
-IPT delays Corolla senescence and decrease
sensitivity to ethylene Plant Physiol., 132:
2174-2138
5 Chin-Yi L., Greg N., Terese W.R., Stephen
F.C., Richard Y Michael J D 1999
Agrobacterium-mediated transformation of
carnation (Dianthus caryophyllus L.)
Nature Biotech., 9:864-868
6 Estopa M., Marfa V., Mele E and
Messeguer J., 2001 Study of different
antibiotic combination for use in the
elimination Agrobacterium with kanamycin
selection in carnation Plant Cell Tiss Org.,
65: 211-220
7 Eva C., Ana E V., Amir Z., Belen F.,
Alexander V., Maria I T., Lluisa M., 2004
adventitious organogenesis and levels of
endogenous auxin and cytokinins Plant
Sci., 167: 551-560
8 Geng Sa., Ma M., Ye H., Liu B., Li G.,
Chong Kang, 2001 Effects of ipt gene
expression on the physiological and
chemical characteristics of Artemisia annua
L Plant Sci., 160: 691-698
9 Hsiang Chang, Michelle L J., Gary M B.,
and David G C., 2003 Overproduction of
cytokinins in Petunia flowers transformed
with pSAG12- IPT delays corolla senescence
and decreases sensitivity to Ethylene Plant
Physiol., 132: 2174-2183
10 Kim-Hong Nguyen., Wilco J., Kees Van D,
Frank S., Evert D., Geert S., Philip J Dix.,
and Eugene J K., 2008 Delayed senescence
in cauliflower transformed with an
autoregulated isopentenyl transferase gene
Int J Plant Sci., 169(3): 339-347
11 Lai-Sheng Meng., Jiang-Ping S., Shao-Bu
S., Chong-Ying W., 2009 The ectopic
PttKN1 gene causes pleiotropic alternating
of morphology in transgenic carnation
(dianthus caryophyllus L.) Act Physiol
Plant, 31(6): 1155-1164
12 Long-Fang O., Chen, Jia-Yuan H., Yee-Yung C., Chi-Wen S., Shang-Fa Ya., 2001 Transformation of broccoli (Brassica
oleracea var italica) with
isopentenyl-transferase gene via Agrobacterium tumefaciens for post-harvest yellowing
retardation Mol Breed, 7: 243-257
13 Mariya K., Degang Z., William S., Yi Li,
Richard McAvoy, 2006 Expression of ipt
gene controlled by an ethylene and auxin responsise fragment of the LEACO1 promoter increases flower number in
transgenic Nicotiana tabacum Plant Cell
Rep., 25: 1181-1192
14 Mariya K., Radomira V., Jiri M., Aizhen L.,
Yi Li, Richard McAvoy, 2009 Enhancement of flowering and branching
phenotype in chrysanthemum by expression
of ipt under the control of a 0.821 kb fragment of the LEACO1 gene promoter
Plant Cell Rep., 28: 1351-1362
15 Matthew S McCabe., Lee C G., Frank S., Wilco J R M Jordi, Geert M S., Evert D.,
J Hans A van R., J Brian P., Michael R
D., 2001 Effects of P SAG12 -IPT gene
expression on development and senescence
in transgenic lettuce Plant Physiol., 127: 505-516
16 Molinier J., Thomas C., Brignou M., Hahne
G., 2002 Transient expression of ipt gene
enhances regeneration and transformation
rates of sunflower shoot apices (Helianthus
annuus L.) Plant Cell Rep., 21: 251-256
17 Nigel E Gapper., Marian J M., Mary C C., Robert H B., Simon A C., Ross E L, Paula E J., 2002 Agrobacterium tumefaciens - mediated transformation to
alter ethylene and cytokinin biosynthesis in broccoli Plant Cell, Tiss and Organ Cul., 70: 41-50
18 Rivero R M., Kojima M., Gepstein A., Sakakibara H., Mittler R., Gepstein S., Blumwald E., 2007 Delayed leaf senescence induces extreme drought tolerance in a flowring plant Proc Natl Acad Sci USA, 104: 19631-19636
Trang 719 Song Z., Li-Hua Z., Xue-Yuan L., Annelie
A., Margareta W., 2004 Infection by
Agrobacterium tumefaciens increased the
resistance of leaf explants to selective agent
in carnation (Dianthus caryophyllus L and
D chinensis) Plant Sci., 168: 137-144
20 Thanh T Nguyen., Philip J Dix, Greg D
Nugent, 2010 Transformation of potato via
bombardment Biologia Plantarum., 54(1):
141-144
21 Yan Xu., Jiang T., Thomas G., Bingru H.,
2009 Effects of SAG12-ipt expression on
cytokinin production, growth and
senescence of creeping bentgrass (Agrostis
stolonifera L.) under heat stress Plant
Growth Regul., 57: 281-291
22 Yusuke K., Kenichi S., Nanako T., Yujiro I., Atsushi M., Toshihito Y., Teruyoshi H., Shigeru S., 2000 Expression of genes responsible for ethylene production and wilting are differently regulated in carnation (Dianthus caryophyllus L.) petals Plant Sci., 158:139-145
23 http://www.rauhoaquavietnam.vn
24 Đặng văn Thông, Đinh Thế Lộc, 2005 Hoa Cẩm Chướng Nxb Lao Động - Xã Hội
A STUDY ONE ISOPENTENYL TRANSFERASE GENE
BY USING Agrobacterium tumefaciens TO INCREASE
THE LONGEVITY OF CARNATION (Dianthus caryophyllus L.)
Nguyen Thi Thanh 1* , Nguyen Thi Phuong Quyen 2 , Nguyen Phuong Thao 2
(1) Institute of Tropical Biology, VAST (2)
International University, Vietnam National University-Ho Chi Minh City
SUMMARY
In vitro leaves of carnation (cut-off flower) variety CCF cut into small pieces about 1x1cm in size were precultured for 5 days and were co-cultivated with the Agrobacterium tumefaciens strain LBA 4404 harbouring the plasmid pVDH1396 contained the β-glucuronida gene (gusA), hygromycin phosphotransferase gene (hpt) under the control of cauliflower Mosaic virus 35S promoters, terminators, and an isopentenyl transferase (ipt) gene from Agrobacterium tumefaciens, driven by the SAG12 promoter from senescence
associated gene 12 of Arabidopsis thaliana and its terminator After 5 days of co-cultivation, explants were
transferred onto the MS selection medium containing 1.0mg/l TDZ and 0.1mg/l NAA, 5mg/l hygromycin,
500 mg/l cefotaxime Some putative shoots were tested for GUS assay Putative shoots were transferred on
MS medium 3 containing 0.5 mg/l IBA and 10 mg/l hygromycin PCR analyses on hygromycin resistant
shoots generated via Agrobacterium tumefaciens transformation to confirm the presence of the, ipt, hpt and gusA genes with expected bands 615bp, 508bp and 365bp Analysis of putative carnation transformants to
confirm that the foreign genes are inserted into the carnation genome by Southern blot analyses will be done
in the future
Keywords: Agrobacterium tumefaciens, carnation, hpt, gusA, ipt, GUS, mediated transformation, PCR,
promoter SAG12, TDZ
Ngày nhận bài: 21-6-2012